Analisi immunoblot

L'immuno blotting, spesso indicato come Western blotting, viene utilizzato per identificare, all'interno di un campione proteico, antigeni specifici riconosciuti da anticorpi policlonali o monoclonali. Questa procedura segue tipicamente l'elettroforesi su gel 2D e prevede il trasferimento di proteine separate alle membrane di nitrocellulosa. Incubazione di queste membrane con anticorpi primari e secondari, direttamente o indirettamente coniugati a enzimi e visualizzazione di antigeni proteici su queste membrane utilizzando reazioni di substrato colorate o fluorescenti.

In questo video, forniamo una dimostrazione passo dopo passo di una procedura di immunoblotting. Ciao, sono Sean Gallagher dell'UVPI e collaboro con un centro di proteomica qui al KE Graduate Institute. Oggi vi mostrerò l'analisi dell'immunoblotting.

Prevede una serie di passaggi, tra cui la separazione delle proteine, il blotting delle proteine sulle membrane, il sondaggio immunologico e la visualizzazione con substrati cromogenici e di luminescenza kim. Quindi iniziamo. Prima di iniziare la procedura di immunoblotting, i campioni di proteine devono essere separati mediante elettroforesi utilizzando gel monodimensionali o bidimensionali di piccole dimensioni o di dimensioni standard.

Preparare i campioni antigenici e caricarli nelle corsie del gel, includere proteine prestainate o biotinilate, standard di peso molecolare in una o più corsie del gel. Questi marcatori proteici si trasferiranno alla membrana e indicheranno convenientemente l'orientamento e le dimensioni della membrana delle proteine dopo l'immunocolorazione. Una volta completata l'elettroforesi, siamo pronti per assemblare l'immuno blot.

Per assemblare l'immuno blot Innanzitutto, smontare il sandwich di gel e rimuovere il gel di impilamento, equilibrare il gel per 30 minuti A temperatura ambiente nel tampone di trasferimento, questo equilibrio è necessario per evitare un cambiamento nelle dimensioni del gel durante il trasferimento mentre il gel è in equilibrio. Iniziare ad assemblare il sandwich di trasferimento in un vassoio abbastanza grande da contenere la cassetta di trasferimento in plastica, riempire con il buffer di trasferimento in modo che la cassetta sia coperta. Ora posiziona un tampone lucido o una spugna scotch sulla metà inferiore della cassetta di trasferimento in plastica.

Quindi prendi un foglio di carta da filtro che è stato tagliato della stessa dimensione del gel. Pre-bagnarlo con il tampone di trasferimento e posizionarlo sopra il pad lucido scotch. Una volta terminato l'equilibrio del gel di 30 minuti, posizionare il gel sopra la carta da filtro.

Rimuovere eventuali bolle d'aria tra il gel e la carta da filtro facendo rotolare delicatamente una provetta o una bacchetta di vetro sulla superficie del gel. Oppure puoi usare il rullo BioRad, fornito con il kit BioRad. Ricordarsi di usare i guanti quando si manipolano carte da filtro, gel e membrane.

L'olio dalle tue mani bloccherà il trasferimento. Quindi, preparare la membrana di trasferimento. Tagliare la membrana alla stessa dimensione del gel più uno o due millimetri su ciascun bordo.

Quindi posizionare la membrana in acqua distillata lentamente con un bordo con un angolo di 45 gradi, l'acqua si assorbirà nella membrana e alla fine bagnerà l'intera superficie. Se viene inserito rapidamente nell'acqua, l'aria rimane intrappolata e apparirà come macchie bianche nella membrana. La proteina non si trasferirà su queste aree.

Una volta che la membrana è completamente bagnata, equilibrarla per 10-15 minuti e trasferire il tampone. Questa procedura di bagnatura funziona per le membrane in nitrocellulosa e nylon. Solo le membrane in PVDF sono idrofobiche e non si bagnano semplicemente per essere state messe in acqua distillata o trasferite. Buffer.

Le membrane in PVDF devono prima essere immerse in metanolo al 100% per uno o due secondi, quindi equilibrate per 10-15 minuti. Nel buffer di trasferimento. Non lasciare mai che la membrana si asciughi.

Se ciò si verifica, bagnare nuovamente con metanolo e quindi il tampone di trasferimento. Una volta che la membrana è pronta, posizionare la membrana pre-bagnata direttamente sul lato superiore del gel. Ricordarsi di rimuovere tutte le bolle d'aria tra il gel e la membrana facendo rotolare delicatamente una provetta, un'asta di vetro o un rullo BioRad sulla superficie della membrana.

Successivamente bagnato, un altro pezzo di carta da filtro watman da tre mm. Quindi posizionalo sopra la membrana e di nuovo, rimuovi tutte le bolle d'aria. Quindi posiziona un altro tampone scotch luminoso o una spugna sopra questa carta da filtro.

Completare l'assemblaggio del sandwich immuno blot bloccando in posizione la metà superiore della cassetta di trasferimento. Ora che il sandwich di immuno blot è assemblato, siamo pronti per trasferire le proteine dal gel alla membrana. Per iniziare la procedura di trasferimento, riempire il serbatoio di elettroblotting con il tampone di trasferimento e posizionare la cassetta di trasferimento contenente il sandwich nell'apparecchio di elettroblotting.

È importante per il sandwich in modo che la membrana sia rivolta verso l'anodo o il lato caricato positivamente del serbatoio. Collegare i cavi dell'alimentatore ai corrispondenti lati anodico e catodico dell'apparecchio di elettroblotting. Questo particolare tampone di criterio viene fornito con un blocco di ghiaccio di raffreddamento.

Ora, l'elettroforetico trasferisce le proteine dal gel alla membrana per 30-60 minuti a 50 volt con raffreddamento o durante la notte a 14 volt in una cella frigorifera. Al termine del trasferimento, spegnere l'alimentazione e smontare l'apparecchio. Quindi rimuovere la membrana dall'apparecchio di tamponamento e annotare l'orientamento tagliando un angolo.

A questo punto, le membrane possono essere asciugate e conservate in un sacchetto di plastica richiudibile a quattro gradi Celsius per un anno. Prima di un'ulteriore lavorazione, le membrane in PVDF essiccate devono essere inserite in una piccola quantità di metanolo al 100% per bagnare la membrana. Quindi in acqua distillata per rimuovere il metanolo.

Una volta segnato l'orientamento, colorare il gel per verificare l'efficienza del trasferimento. Per visualizzare le proteine trasferite, è possibile colorare la membrana in modo reversibile con rubino cipro o irreversibilmente con inchiostro di china blu kamasi, blu naftolo o oro colloidale. Queste procedure di colorazione irreversibili sono incompatibili con le membrane in nylon.

Ora che le proteine sono state trasferite sulla membrana, procedere con l'immunosondaggio e la rilevazione visiva delle proteine. In questa fase, le proteine immobilizzate sulla membrana vengono sondate con anticorpi specifici per identificare e quantificare eventuali antigeni presenti. Per iniziare, posizionare la membrana in un vassoio di incubazione di plastica con 20 millilitri di tampone bloccante.

Alcune persone usano le sacche, ma i vassoi vengono spesso utilizzati in quanto sono particolarmente utili quando si elabora un gran numero di strisce in diverse soluzioni di anticorpi primari. Quindi, incubare la membrana sigillata per 30-60 minuti a temperatura ambiente con agitazione su un agitatore orbitale o una piattaforma oscillante. Mentre la membrana è in incubazione, diluire l'anticorpo primario e il tampone bloccante.

La diluizione è determinata empiricamente, ma in genere è compresa tra uno a 100 e 1000. Per un anticorpo policlonale, da uno a 10 a uno su 100 per i surnatanti ibridi e da uno a 1000 per il liquido di acidi murini contenente anticorpi monoclonali. Al termine dell'incubazione, versare il tampone bloccante.

Sostituire il tampone con un anticorpo primario diluito e, di nuovo, incubare per 30-60 minuti a temperatura ambiente con agitazione costante. Successivamente, lavare la membrana quattro volte agitando con 100 millilitri. TTBS per filtri in NITROCELLULOSA o PVDF o TBS per filtri in nylon.

Lavare per 10-15 minuti ogni volta che la membrana viene lavata, diluire l'anticorpo secondario nel tampone bloccante. Esempi di anticorpi secondari includono la perossidasi di rafano o la fosfatasi alcalina, coniugato anti IG, coniugato enzimatico disponibile in commercio. Gli anticorpi secondari vengono solitamente diluiti da uno a 200 a uno a 25.000 prima dell'uso.

Dopo che le fasi di lavaggio sono state completate e i materiali di lavaggio sono stati scartati, aggiungere la perossidasi di rafano diluita o la fosfatasi alcalina, l'anti IG coniugato e incubare da 30 a 60 minuti a temperatura ambiente con agitazione costante. Dopo 30-60 minuti, rimuovere la membrana dal cestino e lavarla quattro volte, da 10 a 15 minuti ogni volta. In TTBS come descritto in precedenza.

Una volta completati i lavaggi, siamo pronti per procedere con la fase di visualizzazione. Ma prima, dimostreremo una procedura di immunosondaggio alternativa. Questa procedura alternativa di immunosondaggio si basa sul kit Vector Stain A BC di Vector Labs.

Utilizza un complesso di biotina avidan per legare la perossidasi di rafano o l'HRPO o la fosfatasi alcalina A A P all'anticorpo secondario biotinilato. Oggi presenteremo il kit HRPO. Il TTBS è adatto come tampone bloccante per i sistemi di biotina avadon.

Ma per i filtri in nylon, si consigliano reagenti leganti le proteine perché il latte in polvere scremato contiene biotina residua, che interferisce con il test immunologico. Deve essere utilizzato nella fase di blocco solo per iniziare a equilibrare la membrana nel tampone di blocco in un vassoio aperto con agitazione costante utilizzando un agitatore orbitale o una piattaforma oscillante. Incubare la membrana per 30-60 minuti a temperatura ambiente mentre la membrana è in equilibrio.

Preparare la soluzione anticorpale primaria. Utilizzare TTBS per membrane in NITROCELLULOSA o PVDF ad alta sensibilità Aden. Sistemi a base di biotina.

La diluizione di cera contenente anticorpi primari varia generalmente da uno su 1000 a uno su 100.000. L'uso della chimica chemiluminescente richiede una gamma più elevata di diluizioni. Nel nostro caso, la dimostrazione cromogenica.

Stiamo usando una diluizione su 5.000 del primario. Una volta terminata l'equilibratura, rimuovere il tampone di blocco. Quindi aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di anticorpi primari per coprire la membrana.

Incubare la membrana per 30 minuti a temperatura ambiente con un leggero dondolio dopo 30 minuti. Lavare la membrana tre volte in TTBS per nitrocellulosa a intervalli di cinque minuti Durante la fase di lavaggio, preparare la soluzione di anticorpi secondari biotinilati diluendo una goccia di anticorpo biotinilato con 10 millilitri di TTBS. Una volta terminate le fasi di lavaggio, aggiungere la soluzione di anticorpi secondari.

Incubare la membrana per 30 minuti a temperatura ambiente con un lento oscillazione mentre la membrana viene incubata con l'anticorpo secondario. Preparare l'HRPO di biotina avadon per fare questo. Mescolare due gocce di reagente colorante vti A e due gocce di reagente B in 10 millilitri.

TTBS per la nitrocellulosa. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente quando l'incubazione degli anticorpi secondari è completa. Lavare la membrana tre volte nell'arco di 15 minuti con TTBS o TBS.

Quindi, aggiungere la soluzione enzimatica di biotina avidan alla membrana e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente con un lento oscillamento. Quindi lavare la membrana tre volte a intervalli di 10 minuti con TTBS. Ora che la procedura di immunosondaggio è completa, le proteine legate alla membrana sono pronte per essere visualizzate con substrati cromogenici.

Per questa fase finale di visualizzazione, i substrati quattro CN dab slash ICL two e TMB sono comunemente utilizzati con le procedure di rilevamento immunologico basate su rafano e perossidasi. Se il lavaggio finale della membrana durante la procedura di immunosonda è stato eseguito in TTBS, quindi lavare la membrana per 15 minuti a temperatura ambiente e 50 millilitri. TBS ora posiziona la membrana in una soluzione di visualizzazione cromogenica.

Le bande proteiche dovrebbero apparire in 10-30 minuti. Dopo l'incubazione di 30 minuti, scartare la miscela di reazione del substrato e terminare la reazione aggiungendo acqua distillata. L'immunoblotting è una procedura in più fasi utilizzata da migliaia di laboratori per rilevare la presenza di proteine specifiche dopo un'elettroforesi 2D.

Ti ho appena mostrato come eseguire un'analisi immuno del sangue. Quindi questo è tutto. Buona fortuna con i tuoi esperimenti e grazie per aver guardato.