Analisi comparativa della struttura dell'RNA di trascrizioni nascenti e mature in Saccharomyces cerevisiae

Abbiamo studiato il processamento co-trascrizionale dell'RNA, e questo include come l'RNA nascente si piega emergendo dalla RNA polimerasi che lo sintetizza. Prima di questo metodo, non eravamo in grado di monitorare come l'RNA si piega durante la sintesi, e questo ci rallentava nella ricerca. Quindi questo nuovo metodo supera queste lacune.

CoSTseq è stato sviluppato per indagare il ripiegamento nascente dell'RNA nel lievito. È particolarmente efficace nell'analisi di RNA altamente abbondanti. Per cominciare, inoculare il ceppo BY4741 di Saccharomyces cerevisiae in 50 millilitri di substrato YPAD e incubare a 30 gradi Celsius con scuotimento a 200 giri al minuto fino a raggiungere la fase di logaritmia media.

Raccogliere circa tre millilitri di coltura di lievito corrispondenti a 1,8 unità di densità ottica e centrifugare a 2.500 x g per tre minuti a quattro gradi Celsius utilizzando una centrifuga pre-raffreddata. Scartate il soprandanante in un contenitore di rifiuti. Risospendere il pellet in 10 millilitri di PBS freddo e centrifugare nuovamente a 2.500 g per tre minuti a quattro gradi Celsius.

Rimuovi il surnatante e tieni il pellet di lievito sul ghiaccio. Sospezione attenta del pellet di lievito in 10 millilitri di sarkosyl freddo allo 0,5% senza creare bolle. Incubare il lievito risospeso sul ghiaccio per 20 minuti per permettere la permeazione, poi pelletare le cellule a 400 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e risospendere le cellule permeabili del lievito in 100 microlitri di acqua senza nucleasi usando una pipetta P-1000.

Prepara una soluzione operativa di buffer di trascrizione 2,5X con ditiotriotolo appena aggiunto a cinque millimolari e preriscalda un buffer di sondaggio strutturale 2,5X a 30 gradi Celsius. In un tubo pulito da due millilitri, aggiungi tutti i componenti di reazione necessari e mescola accuratamente. Successivamente, aggiungi 100 microlitri delle cellule di lievito preparate nel tubo di reazione e incubale nel termomiscelatore impostato a 30 gradi Celsius, con agitazione a 500 giri al minuto per due minuti.

Poi aggiungi rapidamente 200 microlitri del buffer di sondaggio strutturale preriscaldato 2,5X e 25 microlitri di reagente dimetilsolfato simultaneo. Vortice il tubo delicatamente in due impulsi e rimettilo nell'incubatrice impostato a 30 gradi Celsius e 500 giri al minuto. Continuare a incubare sul termomixer per quattro minuti, distanziando 30 secondi tra un campione e l'altro.

Prepara in anticipo i buffer di stop e wash e mettili sul ghiaccio fino all'uso. Fermare la metilazione del dimetilsolfato aggiungendo un millilitro di tampone di stop al tubo di reazione. Ora centrifuga i campioni marcati con solfato di dimetile a 3.500 x g per cinque minuti in una centrifuga pre-raffreddata.

Dopo la rotazione, scartare il surnadante in un contenitore di rifiuti appropriato. Aggiungi un millilitro di buffer di lavaggio freddo al pellet e risospendi. Ripeti la centrifugazione a 3.500 x g per cinque minuti.

Procedere immediatamente all'estrazione dell'RNA e non congelare il pellet di lievito. Risospendere il pellet di lievito marcato con solfato di dimetilo in 600 microlitri di tampone di lisi RNA, quindi trasferire la sospensione in un tubo contenente 40 microlitri di dodecile solfato di sodio al 20%. Incubare il campione a 65 gradi Celsius per 30 secondi, con agitazione a 950 giri al minuto.

Successivamente, eseguire l'estrazione di fenolo-cloroformico dell'RNA seguendo la procedura standard. Vortice le sfere magnetiche di streptavidina e trasferisci 44 microlitri delle sfere in un nuovo tubo per ogni campione di 80 microgrammi di RNA totale. Posiziona le perline magnetiche su una griglia magnetica finché le perline non si depositano.

Dopo aver rimosso il buffer di stoccaggio, sospezioni le sfere in un millilitro di buffer A di pre-lavatura. Ora incuba la sospensione per due minuti a temperatura ambiente, poi magnetizza e rimuovi il surnadante. Dopo il lavaggio, risospendi le perline in 88 microlitri di buffer di legame 2X. Trasferire 80 microlitri della sospensione in un tubo sterile da 1,5 millilitri contenente 80 microgrammi di campione di RNA biotinilato in 80 microlitri.

Ruota la miscela di campioni di sfera su un rotatore per 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente posizionare il tubo sul rack magnetico per raccogliere il flusso contenente RNA maturo e conservarlo per la precipitazione per eseguire la selezione poly-A di RNA maturi utilizzando il flusso di lavoro DMS-MaPseq. Successivamente, risciacqua due volte il complesso RNA perla-nascente con 500 microlitri di tampone ad alto contenuto di sale.

Poi risciacqua una volta con 500 microlitri di tampone di legame 1X, seguito da un risciacquo finale con 500 microlitri di tampone a basso contenuto di sale. Ora aggiungi 300 microlitri di reagente RNA al complesso BEAD=RNA nascente, respondi completamente e incuba sul termomiscelatore per cinque minuti a 60 gradi Celsius. Successivamente, aggiungi 60 microlitri di cloroformio, vortice e incuba per tre minuti a temperatura ambiente.

Centrifugare il campione a 14.000 x g per cinque minuti nella centrifuga pre-raffreddata. Infine, trasferire la fase acquosa superiore di circa 180 microlitri in un nuovo tubo di raccolta. Scartare la fase organica residua, lasciando le perline e la soluzione acquosa residua.

Dopo aver purificato l'RNA nascente, eseguire la trascrizione inversa a cambio di template, legare l'adattatore 5' e selezionare librerie per il sequenziamento. La visualizzazione dei prodotti PCR di prova su un gel al 1%agarosio ha rivelato una formazione minima di dimeri primer e una tipica smincia intorno a 300 coppie di basi per il sequenziamento co-trascrizionale della struttura o le librerie CoSTseq e DMS-MaPseq. L'elettroferogramma per il campione CoSTseq uno ha confermato la distribuzione delle dimensioni della libreria con un picco intorno a 285 coppie di base.

L'allineamento di lettura dell'mRNA ASC1 ha rivelato che la libreria CoSTseq includeva la copertura dell'introno, confermando che l'RNA è nascente. Mentre la libreria DMS-MaPseq non aveva copertura di intoni, indicando che l'RNA è maturo. La matrice di ripiegamento trascrizionale del cot del pre-rRNA 18S ha rivelato che la reattività DMS mostrava cambiamenti improvvisi mentre la RNA polimerasi progrediva dalla posizione 790 all'811 lungo il locus rDNA.

L'analisi della reattività DMS dell'mRNA di ADH1 ha mostrato profili simili tra forme nascenti e mature, indicando regioni di stabilità strutturale. Al contrario, l'mRNA di SSA2 ha mostrato regioni di diversa reattività DMS tra forme nascenti e mature, suggerendo cambiamenti strutturali durante la maturazione. Con CoSTseq, i ricercatori possono determinare in vivo le strutture secondarie dell'RNA nascente e la posizione della RNA polimerasi lungo i trascriccetti di RNA.

CoSTseq prevede passaggi a tempo e utilizza sostanze chimiche tossiche. È meglio processare non più di due campioni alla volta. Dal totale dell'RNA generato da CoSTseq, gli RNA non biotinilati possono essere utilizzati per il sondaggio concorrente della struttura matura utilizzando il tradizionale DMS-MaPseq.