Imaging ad alto plex con microscopia confocale spettrale per ridurre al minimo la fluorescenza tissutale non specifica

Ottimizziamo un flusso di lavoro IBEX che combina il blocco dell'eparina e la rilevazione spettrale per sopprimere il background nei tessuti umani ricchi di eosinofili. L'autofluorescenza e il legame dei granuli eosinofili oscurano il vero segnale. Puntiamo entrambi per abilitare mappe pulite ad alto Plex.

Per cominciare, disegna un cerchio sul vetrino intorno al tessuto montato usando una penna pap per creare una barriera idrofobica. Aggiungi circa 100 microlitri di PBS a ciascun tessuto per reidratarlo e incuba il vetrino per circa due minuti a temperatura ambiente per lavare via il composto a temperatura ottimale per il taglio. Aspira il PBS intorno al tessuto usando una pipetta Pasteur in vetro aspirante.

Poi aggiungi 100 microlitri di tampone bloccante a ciascun tessuto e incuba a temperatura ambiente in una camera di umidità per un'ora. Ora aspira il buffer di blocco usando una pipetta. Aggiungi 100 microlitri di colorazione miscelati su ogni tessuto e incuba il vetrino in una camera di umidità coperta all'interno di un frigorifero a quattro gradi Celsius durante la notte.

Allo stesso modo, preparare la colorazione a sezione con un solo fluoroforo e un controllo negativo senza alcuna colorazione per definire lo spettro dei fluorofori e l'autofluorescenza tissutale. Dopo aver aspirato la miscela di colorazione, lava il tessuto tre volte con PBS e aspira il liquido dopo ogni lavaggio. Monta il campione sul microscopio per l'imaging (imagining).

Concentrati sul campione usando la modalità di contrasto a campo luminoso o interferenza differenziale. Poi passa alla modalità fluorescenza e configura i parametri di acquisizione spettrale in base ai requisiti sperimentali. Assegnare i laser appropriati per i fluorofori utilizzati nell'esperimento.

Seleziona uno splitter di fascio che corrisponda alle linee laser scelte. Consentire a tutti i rivelatori di catturare l'intero spettro di emissione e regolare la risoluzione di acquisizione dell'immagine a una delle risoluzioni predefinite. Oppure scegli la risoluzione massima.

Regola la dimensione dei fori stenopeici a un'unica unità di area per una sezione ottica ottimale. Ottimizza le impostazioni del laser prima dell'acquisizione. Utilizzando una sezione colorata con tutti i marcatori, avvia la modalità di scansione continua a bassa potenza laser.

Regolare il guadagno principale di ogni rivelatore così come le intensità laser finché tutti i marcatori non saranno identificabili con un buon rapporto segnale/fondo. Regolare fine le intensità laser e alternare iterativamente tra sezioni a singola colorazione e sezioni multi-colorazione finché tutti i segnali fluoroforosi sono visibili senza sovrasaturazione. Abilita la funzione delle piastrelle nel software di acquisizione e definisci la regione di acquisizione delle piastrelle attorno al tessuto per garantire una copertura completa dell'immagine.

Ottimizza la concentrazione per la regione di acquisizione delle piastrelle al centro del tessuto. Identificare una caratteristica strutturale unica, come un insieme distinto di celle in una disposizione riconoscibile, da servire come riferimento per l'allineamento nei successivi turni di imaging. Ora abilita la funzione Z-stack e naviga nella scheda Z-stack.

Sotto la scheda centrale, imposta il numero di fette ad almeno sei con un intervallo di almeno un micrometro tra una fetta e l'altra. Clicca sul pulsante centrale per impostare il punto di messa a fuoco attuale determinato nel passaggio precedente come la fetta centrale della pila. Clicca sul pulsante start experiment per avviare l'acquisizione dell'immagine.

Una volta completata l'acquisizione, clicca con il tasto destro sulla miniatura dell'immagine, seleziona Salva come. Scegli la posizione del file e nomina l'immagine. Fai il backup dei dati dell'immagine per un archivio sicuro. Rimuovere il mix dell'immagine utilizzando le stesse impostazioni ottimizzate applicate durante l'acquisizione delle regioni a tiled.

Cattura uno snap da ogni controllo con singola colorazione per ottenere lo spettro del segnale reale e dal controllo non colorato, per catturare lo sfondo o l'autofluorescenza. Usa queste immagini esclusivamente per lo smescolamento spettrale. Confermare che la regione selezionata rappresenti un vero segnale verificando che l'intensità e la morfologia siano assenti o equivalenti ai livelli di fondo nel controllo non colorato e che la localizzazione dei marcatori corrisponda al suo schema cellulare atteso, come distribuzione di membrana, nucleare, citoplasmica o secreta.

Apri l'immagine snap nel software. Clicca sulla scheda di unmixing e seleziona uno degli strumenti di selezione di regione nella scheda strumenti non mixati, disegna una regione di interesse o ROI attorno al segnale positivo per generare lo spettro di quella regione. Confrontare ogni spettro generato con lo spettro teorico delle emissioni del corrispondente fluoroforo.

Assicurati che la regione rappresenti accuratamente il vero segnale. Nomina ogni spettro in base all'identità del fluoroferano e salvalo nel database spettrale. Poi, carica l'immagine a tile e apri lo strumento di unmix.

Usa il pulsante più per aggiungere gli spettri di riferimento per ogni fluoroforo alla lista di smixaggio. Clicca sul pulsante di unmixing lineare per separare i segnali spettrali e salvare l'immagine non mescolata. Prepara la soluzione sbiancante in una cappa a fumo.

Usando una microspatola, pesa 10 milligrammi di boroidrido di litio direttamente in un becher secco. Aggiungi con attenzione 10 millilitri di acqua ultrapura nel becher e mescola finché il composto non si scioglie completamente. Aggiungi circa 100 microlitri della soluzione sbiancante appena preparata a ogni sezione di tessuto usando una pipetta Pasteur in vetro e incuba le vetrine a temperatura ambiente per 15 minuti all'interno della cappa fumi.

Se lo sbiancare viola brillante muore, trasferisci con cura il vetrino su un microscopio epifluorescente e seleziona il filtro a sbianca. Focali il campione e illuminalo a piena potenza. Ora usa un obiettivo 5X per ottenere un campo di illuminazione più ampio e abbassa completamente lo stadio per evitare qualsiasi contatto tra la carrella e l'obiettivo o la custodia.

Infine, decantare la soluzione di boroidrido di litio da ogni pozzo usando una pipetta Pasteur in vetro e riportarla nel becher originale di soluzione sbiancante. Lavare i vetri tre volte con il tampone diluizionale e incubare per circa tre minuti durante ogni lavaggio. Aggiungi la miscela di anticorpi e colora il campione come dimostrato in precedenza.

Nel tessuto polipale nasale non trattato, la colorazione con CD3, CD4 e CD20 ha mostrato una intensa fluorescenza granulare non specifica nelle regioni ricche di eosinofili. Mentre il vero segnale localizzato dalla membrana era presente a bassa intensità. Il pretrattamento con latte scremato al 5% non ha bloccato completamente la fluorescenza aspecifica e ha anche ridotto l'intensità del segnale per fluorofori come AF 532.

Il pretrattamento con dab ha ridotto la fluorescenza aspecifica di CD20, CD3 e CD4, ma ha anche diminuito l'intensità reale del segnale su più canali, inclusi DAPI e AF 532. Il pretrattamento con eparina bloccava efficacemente il legame aspecifico, mantenendo al contempo un'elevata intensità del segnale per CD3, CD4, CD20 e DAPI. L'eparina bloccava il segnale aspecifico in modo dipendente dalla concentrazione, con una soppressione completa raggiunta a 10 unità e senza effetti dannosi osservati a concentrazioni più elevate.

Un sistema di imaging a tre tracce ridusse i tempi di acquisizione, ma introdusse diafonia inclusa la sanguinazione di AF 594 nel canale PE, e una maggiore autofluorescenza tissutale grazie a molteplici eccitazioni laser. L'imaging spettrale eliminava quasi tutto il background e la diafonia, riducendo al contempo i tempi di acquisizione e migliorando il rapporto segnale-background. L'imaging spettrale IBEX di un polipo nasale umano ha rivelato strutture epiteliali marcate da EpCAM.

cellule immunitarie come i linfociti positivi a CD3 e CD20, e vasi che esprimono CD31 e CD34. Il trattamento con eparina eliminava il legame dei granuli senza ridurre il segnale, mantenendo una forte soppressione di fondo durante i cicli IBEX. La dismescolazione spettrale minimizza il flusso di scorrenza e l'autofluorescenza aumenta il segnale verso il sottofondo, accelerando significativamente l'acquisizione multi-pannello rispetto alla confocale multi-traccia.

Ciò consente una proteomica spaziale robusta e tessuti difficili che supportano una mappatura accurata dello stato cellulare e un'analisi a livello di vicinato.