全モンキー脳の大規模なタンパク質の検出のためのバッチの免疫染色
2009年7月27日
全体の霊長類の脳で標的タンパク質の大規模な免疫検出は、任意の時点で複数のフリーフローティングセクションのバッチ染色のための創造的な装置の使用を組み合わせる方法を埋め込み、セクションなどの新たな組織を採用することで可能です。
この手順は、4%PFA 灌流、外部化、および凍結保護脳を受領すると開始されます。これは、周囲のマトリックスに埋め込まれたアライメント ランドマークを使用して埋め込むために神経科学の仲間に送られました。脳を冠状面で切片化して、所望の厚さで連続切片を生成することができ、これは特殊なバスケットと容器を使用して脳の前方後部全体を表します。バッチ免疫処理は、脳全体にわたるタンパク質の空間的発現パターンを決定するために実行できます。
こんにちは、モントリオール大学検眼学部の視覚神経科学研究室のShaheen Zur博士です。こんにちは、私はマーク・バーク博士で、同じくモントリオール大学検眼学部の視覚神経科学研究室に所属しています。こんにちは、モントリオール大学検眼学部の視覚神経科学研究所の所長である Dr.Mo
ペットです。本日は、サルの脳全体での大規模なタンパク質検出のためのバッチ免疫染色の手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を用いて、脳全体の標的タンパク質の発現パターンを調べ、同じ脳内でのタンパク質の発現を比較対照しています。それでは始めましょう。
組織学的処理の前に、全身灌流および固定後によって保存され、傾斜したスクロース溶液を使用して凍結保護された霊長類の脳を入手します。この段階で、脳は神経科学の仲間に送られ、彼らの独自の技術を使用して埋め込まれ、自由に切片化されます。戻ってくると、7つのアライメントランドマークが埋め込みマトリックスに配置されているため、組織学的処理が完了した後に切片を適切に方向付けて再調整できます。
切片化が行われる間、デジタル画像が撮影され、後で解剖学的地図の3D再構成に使用できます。神経科学者の仲間は、私たちの組織を処理して、脳全体に厚さ50マイクロメートルの連続した浮遊冠状切片を生成します。完了すると、切片の組織学的処理を開始できます。
組織学的処理を開始すると、通常、抗体または染色ごとに約140の切片を取り扱うことになります。ここでは、非リン酸化ニューロフィラメントタンパク質に対するモノクローナル抗体である抗体SMI 32で処理された切片の小さなサンプルでこの手法を実演します。手順全体を通して、特殊な染色皿とバスケットが使用され、多数のフリーフローティングセクションを同時に効率的に処理することができます。
これにより、結果として生じる汚れがすべての切片で一貫していることが保証されます。最初のステップは、TRITTON X 100と正常なウマ血清を含むPBSベースの溶液で切片を60分間インキュベートすることです。これにより、バックグラウンド染色の原因となる抗体分子の非特異的結合が減少します。
次に、切片を一晩インキュベートします。A PBSベースのSMI 32抗体溶液に、翌日にtritton X 100と正常なウマ血清を添加し、切片を洗浄液で10分間3回洗浄した後、室温で2時間インキュベートします。PBSベースのビオチン化Muse二次抗体溶液にTriton X 100と正常ウマ血清を含有しています。
さらに3回の10分間の洗浄の後、切片をアバドンビオチン結合ウマダイコンデュエートペルオキシダーゼ複合体の溶液に室温で1時間入れます。最後に、別の洗浄セットの後、切片をDアミノベンジン反応に10分間置くと、免疫反応性ニューロン内に茶色の染色が生じます。その後、染色バスケットを取り出し、切片をPBSに浸すことにより、反応を停止します。
PBSセクションでの2〜3分、5分間のすすぎの後、スライドガラスに個別に取り付ける準備ができ、大きなペトリ皿と非常に柔らかいペイントブラシを使用して取り付けプロセスを開始します。切片はPBSバッファー容器から持ち上げられ、ゼラチンコーティングされたスライドガラスに個別に取り付けられます。その後、サンプルは翌日、ドラフトで一晩風乾されます。
切片は、取り付けプロセスから残った可能性のある塩の結晶を洗い流すために、二イオン水に浸すことによってすすぎます。次に、スライドを等級別エタノールステップで脱水し、キシレンで洗浄し、マウントごとの封入剤でカバーを滑らせます。この段階では、スライドを水平位置に約1週間から10日間保管して、封入媒体を硬化させる必要があります。
この後、スライドをスライドボックスに保存したり、顕微鏡でイメージングしたりすることができます。この方法では、サルの脳全体にわたって目的の標的タンパク質の完全な発現プロファイルが生成されます。ここでは、FMRP、新しいn、およびSMI 32発現のスナップショットを提供する代表的な冠状切片を示します。
同じ猿の脳で。ここまで、脳全体にわたる目的の標的タンパク質のバッチ免疫染色を完了する方法をお見せしました。この手順を実行するときは、すべての切片がさまざまな溶液でインキュベートされている間、穏やかな攪拌を受け、常に完全に浸漬されたままであることを確認することが重要です。
さらに、解剖液をガラスに取り付けながら、組織の完全性を損なうことなく、できるだけ多くのしわや折り目を取り除きます。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
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概要
この記事では、霊長類の脳全体における標的タンパク質の大規模な免疫検出に関する新しいアプローチについて議論します。革新的な組織埋め込みおよび断面処理の方法と、複数のフリーフローティング断面の連続染色技術を紹介します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 免疫検出
- 脳イメージング
背景
- 免疫検出は脳におけるタンパク質発現の研究に不可欠です。
- 従来の方法は範囲と効率に制限がある可能性があります。
- 組織処理技術の進歩は研究能力を向上させることができます。
- バッチ処理により、タンパク質分布の包括的な分析が可能になります。
研究目的
- 霊長類の脳における大規模な免疫検出の方法を開発すること。
- タンパク質発現分析の効率を向上させること。
- 脳全体の空間的発現パターンの研究を促進すること。
使用した方法
- 脳の保存のための4% PFA灌流。
- 周囲のマトリックス内のアラインメントランドマークを使用した埋め込み。
- 冠状面での連続切片のための切片処理。
- 空間的タンパク質発現分析のためのバッチ免疫処理。
主要な結果
- 霊長類の脳組織の埋め込みと切片処理の成功。
- タンパク質発現パターンの分析能力の実証。
- 革新的な技術により免疫検出の効率が向上しました。
- 神経科学研究におけるより広範な応用の可能性。
結論
- 開発された方法は大規模な免疫検出を大幅に改善します。
- これらの技術は脳タンパク質発現の理解を進めることができます。
- 将来の研究はさまざまな応用のためにこれらの方法を基に構築することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Large-scale protein expression mapping in primate brains supports target validation and mechanistic de-risking in neuroscience drug discovery. Batch immunostaining enables reproducible, quantitative assessment of spatial protein distribution across the whole brain, improving predictive confidence in target engagement and pathway modulation. This approach addresses a critical gap in translational research by providing disease-relevant system data for lead identification and preclinical model alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping target protein expression across the entire primate brain.
- Operational Value: Supports biological de-risking through uniform staining of serial sections for consistent target engagement assessment.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing spatially resolved protein expression data for go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via batch processing of free-floating sections.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through synchronized immunostaining of large section sets.
- Strategic Value: Highlights screening readiness and platform reuse for reliable compound evaluation in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through alignment of protein expression patterns with neurological disorder models.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation using standardized immunostaining protocols.
- Predictive Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by enabling quantitative measurement of protein levels and neuronal populations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation to preclinical research by enabling spatially resolved protein expression analysis in disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through whole-brain protein mapping.
- Screening: Describes assay readiness and reproducibility via batch immunostaining of serial sections.
- Analytics: Highlights quantitative readouts such as protein levels and neuron population counts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects method to preclinical continuity via alignment of expression patterns with biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for large-scale protein detection across multiple targets and studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in protein expression studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of immunostaining workflows for large section sets.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early target de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on whole-brain expression profiles.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histology, immunohistochemistry, and neuroanatomy.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including specialized staining dishes, baskets, and microscopy systems.
- Cross-team standardization requirements for section alignment, staining consistency, and data interpretation.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for primate versus rodent brain processing.
- Practical limitations including section handling complexity and mounting precision for large-scale serial sections.
