Name: 全モンキー脳の大規模なタンパク質の検出のためのバッチの免疫染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学ぶ全モンキー脳のバッチ免疫染色法。PFA灌流固定、マトリックス包埋、コロナル連続切片を用いて、標的タンパク質の空間発現パターンを脳全体で解析する効率的な神経科学研究手法です。

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私たちは、霊長類の仕事の継続的なサポートのために、フランクエルヴィン、ロバータパーマー、セントキッツ、西インド諸島に位置する行動科学財団研究所のスタッフに感謝しています。ヘルスリサーチ（AC）とナショナルエンジニアリングとカナダの研究評議会（MP）のカナダの協会からオペレーティング助成金 - この作品は、カナダの脆弱X研究財団（FXRFC）からSZの親睦とによってサポートされていました。

Immunohistochemistyは、様々な実験動物モデルの脳内におけるタンパク質発現を特徴づけるための最も広く使用されている技術の一つです。同様の脳の大きさを持つ齧歯類や他の一般的な実験モデルの脳で体系的免疫組織化学的手続を実施するのは比較的簡単です。しかし、全体のサルの脳でそのような免疫検出の手順を実行する方法の包括的な報告を提供する我々の知識への公開作品はありません。以下は、様々な標的タンパク質の大規模な免疫組織化学的検出のために全体のサルの脳を準備する方法の詳細な説明です。この作品は、商用および学術的努力とのコラボレーションの結果として浮上している。このように、埋め込み、切片組織に関する詳細は、NSAの独自の知識のまま。 パート1：動物の治療や組織の準備成人のベルベットモンキー（ ミドリザル ）から脳を、本プロトコルに使用されます。すべての手順は、生物医学研究1の動物の利用とケアのためのアニマルケアに関するカナダの協議会（CCAC）ガイドラインに準拠して行われている。 <ol><li>動物は深く、（10 mg / kgを、IM）塩酸ケタミンで鎮静ペントバルビタールナトリウムの過剰投与（25 mg / kgを、IV）を使用して、安楽死させ、完全に放血するまで0.1MのPBSでtranscardially灌流される。 </li><li>これは、5分（〜1リットル）のためのPBS中4％パラホルムアルデヒド溶液が続いている。 </li><li>脳は、容器の底に沈む˚Cまで、外部化された脳は、0.02％アジ化ナトリウムを含む段階的PBS -バッファショ糖溶液（シーケンス10、20および30％）に入れ、4に維持される。脳は、凍結切片を経るまでのソリューションは、数日おきに置換されます。 </li><li>彼らの独自のMultiBrain™埋め込みおよび凍結セクショニング技術に供される、脳が神経科学アソシエイツ（ノックスヴィル、テネシー州NSA）に送信されます。 </li><li>セクションが適切な方向になる（すなわち、左から右方向）と組織学的処理後に再整列できるように、7（7）アライメントマークを埋め込むマトリックスに配置されます完了です。 </li><li>各シリアルセクションがブロックから収集される前に凍結ブロックは、デジタルブロック面で撮影されています。デジタル画像だけでなく、この脳からのセクションは、それぞれ後、解剖学的および組織学的マップの3D再構成のために使用することができます。 </li><li>シリアルフリーフローティング冠状セクション、セクションごとに50μmの厚さで、脳全体から収集されます。 </li></ol>第2部：組織学的処理セクションは、与えられた空間の間隔で選ばれている（例えば、500μm）と我々の実験目的のために以下の抗体で処理した：脆弱X精神遅滞タンパク質（FMRP、ケミコン、テメキュラ、カリフォルニア州）、SMI32（シュテルンベルガーモノクローナル抗体（株）;ボルチモア、MD）、およびNeuN（ケミコン、テメキュラ、カリフォルニア州）。 FMRPは豊富に正常と順列キャリアの脳の神経細胞2に見られる細胞質タンパク質である。 NeuN（神経核）は、特にほとんどのニューロンに存在し、神経核、perikaryonの複数形といくつかの近位の神経のプロセス3で配布されているDNA結合ニューロン特異的タンパク質のNeuNを認識します。 SMI - 32は、ニューロフィラメント蛋白質4の非リン酸化エピトープを認識するモノクローナル抗体である。 <ol><li> 500μmの間隔で、約140のセクションは、抗体ごとに使用されています。 </li><li>すべてのインキュベーション、洗浄および染色ステップは、特殊な染色皿やバスケット（;ノックスヴィル、テネシー州HistoTools）を用いて軽く攪拌しながら実施されています。 </li><li>セクションは、最初の抗体分子の非特異的結合と、その結果、バックグラウンド染色を低減するために、0.1 M PBS/0.3％トリトンX - 100（TX）/ 60分間5％正常しわがれ血清（NHS）を含む溶液中でインキュベートする。 </li><li>ベンダーの指示に従って、FMRPの免疫染色用にマークされたセクションでは、抗原のアンマスキングソリューション（バーリンゲーム、カリフォルニア州ベクトルラボ）を使用して、抗原回復の追加のステップを経る。 </li><li>セクションは、NeuN抗体について（1 / 5の希釈率で、FMRPとSMI - 32と1 / 2、000の000、0.1 M PBS/0.3％TX / 3％NHSを含む、それぞれの抗体溶液中で一晩とは別の日にインキュベートされる。 </li><li> 1 /;次の日は、セクションは馬で提起されたビオチン化抗マウス二次抗体で室温で2時間インキュベートした洗浄液で3つの10分の期間（0.1 M PBS/0.3％TX）（ベクター研究所のために洗浄されています0.1 Mの1,000倍希釈PBS/0.3％TX / 3％NHS）。 </li><li> 3 10分間の洗浄のさらなるセットの後、切片を室温で1時間アビジン - ビオチン結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（ベクター研究所）の溶液中に配置されます。 </li><li>最後に、洗浄の別のセットの後、切片をニッケル強化された径に10分間さらされているminobenzidine（ニッケルDAB）免疫反応性ニューロン内の染色ダークブルーを生成する反応。 </li><li>組織学的手順の完了時に、セクションは、ゼラチンコートしたスライドガラス上にマウントされています。 </li><li>すべてのセクションでは、一晩風乾しており、標準的な手順に従って封入。 </li></ol>パート3：代表的な結果： このメソッドは、全体のサルの脳全体の関心の標的タンパク質の完全な発現プロファイルを生成します。ここではFMRP、NeuNと同じサルの脳内SMI32式のスナップショットを提供する代表的な冠状セクションを示しています。 <img src="/files/ftp_upload/1286/1286fig1.png" alt="" /> 図1：免疫検出のためのフリーフローティングセクションの大規模なバッチ処理に使用される染色皿（）とバスケット（B）。 <img src="/files/ftp_upload/1286/1286fig2.png" alt="" /> 図2：FMRP（）、NeuN（B）とSMI32（C）抗体で染色ベルベットモンキーの脳からの代表的な冠状断面。

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+to+the+Care+and+Use+of+Experimental+Animals%22">Guide to the Care and Use of Experimental Animals</a>. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. , Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).</li>
<li>Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FMR-1+protein+is+cytoplasmic%2C+most+abundant+in+neurons+and+appears+normal+in+carriers+of+a+fragile+X+premutation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation.</a> Nat Genet. 4, 335-340 (1993).</li>
<li>Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuN%2C+a+neuronal+specific+nuclear+protein+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates.</a> Development. 116, 201-211 (1992).</li>
<li>Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+distinguish+phosphorylated+and+nonphosphorylated+forms+of+neurofilaments+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).</li>
</ol>

著者は開示すべき事項を何も持っていません。

可能な限り全体のサルの脳内のタンパク質の大規模な検出を行うこの手順の2つの重要なステップがあります。一つは、NSAの独自の知識のまま埋め込むとセクショニングのプロトコルです。他はHistoToolsで提供される染色料理やバスケットを使用することです。後者は、所定の時間に多くの（〜40）のセクションの容易かつ迅速な処理を行うことができます。また、一様に脳全体のすべてのセクションを治療するための手段を提供し、科学的に健全な組織学的治療になります。さらに、埋め込まれたランドマークの使用は、デジタル乾燥や封入スライドからの染色パターンを取得するために、分析のさまざまな形式にデジタル化されたファイルを施すことができるという付加的利点を提供します。我々は3つの抗体の例を提供しますが、この手順は、特に他の標的タンパク質だけでなく、組織学的染色の広い範囲、細胞構築、様々な皮質領域を明らかにし、それゆえマッピングの目的で使用されるものに適用することができます。

<table><tbody><tr><td>anti-FMRPモノクローナル抗体</td><td>Chemicon International</td><td>MAB2160</td><td>固定組織において抗原賦活化が必要</td></tr><tr><td>anti-NeuNモノクローナル抗体</td><td>Chemicon International</td><td>MAB377</td><td>該当なし</td></tr><tr><td>anti-Neurofilament Hモノクローナル抗体</td><td>Sternberger Monoclonals Inc.</td><td>SMI32</td><td>該当なし</td></tr><tr><td>抗原賦活化溶液（Antigen Unmasking Solution）</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3300</td><td>該当なし</td></tr><tr><td>正常馬血清</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>ビオチン化抗マウスIgG (H+L)（馬由来）</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-2000</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABCキット（スタンダード）</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4000</td><td>1.5 mg</td></tr><tr><td>浮遊切片用染色皿</td><td>HistoTools</td><td>10009</td><td>12 x 65 mm</td></tr><tr><td>染色搬送バスケット</td><td>HistoTools</td><td>100012</td><td>大&lt;br/&gt;（12 x 65 mm皿に適合）</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>P8514B</td><td>該当なし</td></tr><tr><td>DAB</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC11209-0050</td><td>該当なし</td></tr></tbody></table>

全モンキー脳の大規模なタンパク質の検出のためのバッチの免疫染色

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

免疫組織化学（IHC）は、標的タンパク質の検出のための最も広く使用されている実験手法の一つです。<em&gt;その場で</em&gt;。脳全体にわたる標的タンパク質の発現パターンに関する質問は、このようなげっ歯類のものなどの小さな脳でIHCを使用するときに答えることが比較的容易である。しかし、そのような霊長類のものとして大規模かつ複雑な脳の同じ質問に、答えることは多くの課題を提示。ここでは、成人のサルの脳内の標的タンパク質の免疫検出のための体系的なアプローチを提示する。このアプローチは、神経科学アソシエイツ（NSA）と同様に自由に浮遊切片のバッチ染色のために特別に開発されたツールの方法論を埋め込み、セクションなどの組織に依存しています。それは特定の間隔で、脳全体を表す、セクションの集合の一様な染色をもたらす。結果として染色した切片は、特定のタンパク質を発現するニューロンの人口、タンパク質レベルを測定するために分析的手続の多種多様に供することができる。

全体の霊長類の脳で標的タンパク質の大規模な免疫検出は、任意の時点で複数のフリーフローティングセクションのバッチ染色のための創造的な装置の使用を組み合わせる方法を埋め込み、セクションなどの新たな組織を採用することで可能です。

免疫組織化学（IHC）は、標的タンパク質をin situで検出するために最も広く用いられている実験手法の一つである。...に関する疑問は

この手順は、周囲のマトリックスに埋め込まれたアライメントランドマークを用いて埋没処理を行うため、Neuroscience associatesに送付された、4% PFAで灌流・摘出・凍結保護処理済みの脳を受領した時点から開始されます。脳は冠状面で切断し、専用のバスケットと容器を使用して、所望の厚さで連続切片を作成することで、脳の前後方向の全範囲を網羅させることができます。バッチ免疫処理を行うことで、脳全体におけるタンパク質の空間的な発現パターンを決定することが可能です。こんにちは。モントリオール大学視覚神経科学研究所、検眼学校のShaheen Zur博士です。こんにちは。同じくモントリオール大学視覚神経科学研究所、検眼学校のMark Burke博士です。こんにちは。モントリオール大学検眼学校の視覚神経科学研究所の所長、Mo Petto博士です。本日は、サル脳全体における大規模なタンパク質検出のためのバッチ免疫染色の手順をご紹介します。当研究室では、この手法を用いて脳全体における標的タンパク質の発現パターンを調査し、同一個体内のタンパク質発現を比較・対照させています。それでは、始めていきましょう。組織学的処理の前に、全身灌流による固定、後固定、および段階的なショ糖溶液による凍結保護処置を施した霊長類の脳を用意します。この段階で、脳をNeuroscience Associates社に送付し、同社の独自技術を用いて包埋および凍結切片作成を行います。返却後、包埋マトリックス内に7つのアライメントランドマークが配置されており、これにより組織学的処理の完了後に切片を適切に方向付けし、再整列させることができることが確認できます。切片作成と並行して、後に解剖学的マップの3D再構築に使用できるデジタル画像を撮影します。神経科学者の共同研究者が組織を処理し、脳全体にわたる厚さ50 µmの遊離冠状断連続切片を作成します。これが完了すると、切片の組織学的処理を開始できます。組織学的処理を開始する際、通常、抗体1種類または染色1回につき約140枚の切片を処理します。ここでは、非リン酸化ニューロフィラメントタンパク質に対するモノクローナル抗体であるSMI 32で処理した少数の切片を用いて、この手法を実演します。手順全体を通じて、専用の染色皿とバスケットを使用することで、大量の遊離切片を同時かつ効率的に処理することが可能になります。これにより、すべての切片で染色の結果が均一になります。最初のステップとして、Triton X-100と正常馬血清を含むPBSベースの溶液中で、切片を60分間インキュベートします。これにより、背景染色の原因となる抗体分子の非特異的結合を抑制します。次に、切片を一晩インキュベートします。翌日、Triton X 100および正常馬血清を添加したPBSベースのSMI 32抗体溶液中で、切片を洗浄液で10分間×3回洗浄し、その後、Triton X 100および正常馬血清を含むPBSベースのビオチン化マウス二次抗体溶液を用いて、室温で2時間インキュベートします。さらに10分間の洗浄を3回行った後、切片を avadon biotin 標識 horse radish peroxidase コンプレックス溶液に浸し、室温で1時間静置します。最後に、再度一連の洗浄を行った後、切片を D amino benzine 反応液に10分間浸すと、免疫反応性ニューロン内に茶色の染まりが生じます。その後、染色バスケットを取り出し、切片を PBS に浸すことで反応を停止させます。PBSで5分間の洗浄を2〜3回行った後、大きなペトリ皿と非常に柔らかい絵筆を用いて、切片をガラススライドに個別に封入する準備が整います。切片をPBS緩衝液の容器から取り上げ、ゼラチンコートされたガラススライドに個別に貼り付けます。その後、サンプルをドラフトチャンバー内で一晩自然乾燥させ、翌日に工程を進めます。切片を脱イオン水に浸して洗浄し、封入工程で残った塩結晶を取り除きます。その後、段階的なエタノール系列で脱水し、キシレンで洗浄した後、Permount封入剤を用いてカバーガラスを被せます。この段階で、封入剤を硬化させるため、スライドを水平な状態で約1週間から10日間保存してください。その後、スライドはスライドボックスに保存するか、顕微鏡によるイメージングに供することができます。この手法により、サル脳全体における標的タンパク質の完全な発現プロファイルを得ることが可能です。ここでは、FMRP、neuN、およびSMI 32の発現を捉えた代表的な冠状断切片を示します。同一のサル脳を用いて、脳全体にわたる標的タンパク質のバッチ免疫染色を完了する方法を説明しました。この手順では、各種溶液でのインキュベーション中、すべての切片を穏やかに攪拌し、常に完全に浸漬した状態に保つことが重要です。さらに、解剖組織のカバーガラス封入を行う際は時間をかけて丁寧に行い、組織の完全性を損なわないように注意しながら、しわや折りをできる限り取り除いてください。以上で説明を終わります。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験がうまくいくことを願っております。

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