げっ歯類からの神経細胞とヒト以外の霊長類の脳スライスのDiOLISTIC標識

私の名前はゲイル・シーベルで、国立アルコール乱用・アルコール依存症研究所のヴェロニカ・アルバレス博士の研究室の博士研究員です。この研究は、オレゴン霊長類センターのキャスリーン・グラント博士とアンドリュー・ワウ博士、およびこの研究で使用された非ヒト霊長類組織を提供したウェイクフォレスト大学のジェームズ・ディーン博士と共同で行われました。この手順のオーバーホールの目標は、ニューロンに蛍光色素を導入し、あらゆる年齢のげっ歯類や霊長類などのさまざまな種の脳切片を標識することです。

樹状突起と樹状突起棘の形態を研究する目的で、これは最初にTsとビーズをDアイなどの親油性染料でコーティングすることによって達成されます。手順の2番目のステップは、Dアイコーティングされたビーズでチューブを裏打ちし、Helios遺伝子銃システムの弾丸として機能する小さな断片にカットすることです。手順の3番目のステップは、遺伝子銃を使用してDアイコーティングされたビーズを脳スライスに撃つことです。

手順の最終ステップはオプションであり、スタイリスティックスを免疫染色と組み合わせて、他のマーカーを同時に局在化することができます。最終的には、共焦点顕微鏡や2光子顕微鏡などの高解像度イメージングに適したニューロンのまばらな蛍光標識、および樹状突起分岐と樹状突起スパイン形態の研究を示す結果を得ることができます。この技術が既存の方法よりも優れている点は、あらゆる種、年齢、遺伝子型の動物の脳切片に文体を適用できることです。

免疫染色と組み合わせて使用 することができ、弾丸を作成する前に高解像度の顕微鏡観察に適したスパース蛍光標識を生成します。化学ヒュームフード内の親油性染料でタングステンビーズを450ミリリットルの塩化メチレンから13.5ミリグラムの親油性染料の目にコーティングし、最終濃度を30ミリグラム/ミリリットルにします。300ミリグラムのタングステンビーズが入ったプレEloquaチューブを1本取り、300マイクロリットルの塩化メチレンパイプを激しく加えてビーズを再懸濁し、均質な溶液を作ります。

ピペッティングで上下する弾丸セットごとにわずか100ミリグラムのタングステンビーズが使用され、ビーズを再懸濁した状態に保ち、100ミリリットルのビーズと溶解したダイダイアイをスライドガラスに追加し、それらを完全に混合します。ピペットチップを使用して、ビーズが薄い灰色に変わるまで完全に風乾させます。きれいなレーサーブレードを使用して、ワックスを塗ったきれいなホワイトペーパーをスライドの下に置きます 弾丸の色ごとに、ガラスからビーズをこすり落とし、スライドさせてDサイコロで微粉末にします。

コーティングされたビーズをホエイペーパーにこすり落とし、15ミリリットルの円錐形チューブに漏斗状にします。3ミリリットルの水を加え、室温で10〜30分間水浴で超音波処理して、塊を完全に乱します。0.7メートルのティールチューブを一方の端に角度を付けて切断し、もう一方の端をチューブアダプターを使用して12ミリリットルのシリンジに接続し、自由端を10ミリリットル/ミリリットルのポリビニルペロンまたはPVP溶液の10ミリリットルを含むチューブに入れ、溶液をチューブを通してシリンジに完全に引き込みます。

シリンジでポンピングしながらビーズ溶液をボルテックスし、ビーズの沈殿を避けるために迅速に作用する均質な混合物を作り、溶液をチューブに完全に引き込みます。チューブを両端からピンと張ったまま、その場所でビードがチューブに付着するのを防ぐ気泡の導入は避けてください。左右に均等に傾

ビーズを分配します。チューブをプレップステーションに送り込み、ビーズが30〜60秒間沈殿するのを待ちます。シリンジを使用してゆっくりと、しかしスムーズに

ビーズを残して水を取り除きます。すぐにシリンジを外し、チューブの回転を開始します。プレップステーションの窒素流量を4〜5LPMに調整し、水滴が見えなくなるまで10〜20分間乾燥させます。

準備ステーションからチューブを取り外し、チューブカッターを観察して弾丸を13ミリメートルの長さにカットすると、良好な弾丸にはかすかな灰色の霞が内部を均一に覆っています。無水硫酸カルシウムなどの乾燥剤を含むホイルで包まれたシンチレーションバイアルに弾丸を入れます。撮影の準備ができるまで室温で保管してください。

DIICラベリングは、さまざまな種や年代の脳組織のニューロンを染色するために使用でき、さまざまな方法を使用して保存できます。スライスの前または後に固定された脳のスライスを24のウェルに入れます。ウェルプレート。

スライスを1回のXPB S3で5〜10分間洗浄します。PBSからピペットで取り出し、ペイントブラシを使用してスライスをウェルの中央に配置します。ジーンガンのバレルライナーの端にある2つの金属拡散スクリーンの間に3.0マイクロメートルフィルターを配置します。

ジーンガンを持ち、バレルライナーの端がサンプルから1.5cm離れるようにします。120〜180PSIのヘリウムガス圧でビーズをスライスに撃ち込みます。スライスを1つのXPBSですばやく3回すすぎ、余分な染料を取り除きます。

すべての液体取り扱いステップでは、スライスのショット面を上に向けておくようにしてください。スライスをPBSで3〜6時間保存して、DAIが樹状突起に沿ってホイルで覆われるようにします。daiは光感受性であるため、この段階でスライスをマウントするか、次のセクションで詳述するように抗体でさらに染色して、1つのXPBSに0.01%TRITTON X 100を含む300〜500マイクロリットルの浸透溶液で各スライスに染色を進め、室温で正確に15分間インキュベートすることができます。

ウェルから浸透溶液を取り出し、1つのXPBSに10%ヤギ血清と0.01%トライタンX 100を含む溶液でスライスをブロックし、室温で30分間インキュベートします。ブロッキング溶液で希釈した300〜500マイクロリットルの一次抗体をそれぞれに加えます。室温で1〜2時間または一晩インキュベートし、抗体洗浄スライスに応じて、1回のXPBSで5〜15分間の洗浄ごとに、溶液をウェルから取り出します。

ブロッキング溶液で希釈した300〜500マイクロリットルの二次抗体をそれぞれに加えます。前回と同様に、1つのXPBSで5〜15分間4回よく洗浄し、蛍光封入剤を入れたスライドガラスにスライスを取り付け、18 x 18ミリメートルで覆います。カバースリップは、室温で6〜12時間乾燥させてから、暗い場所に保管された透明なマニキュアで端を密封するか、摂氏4度で覆います。

標識された脳切片の例示的な画像をここに示す。探すべき2つの重要な特性は、低倍率でのまばらな標識パターンと、個々の細胞成分を識別する能力です。弾丸の不適切な準備や組織の過度の固定は、ここに示すように不適切なラベリングにつながる可能性があります。

トラブルシューティングのヒントは、こちらのテキストに記載されています。マウスの脳から採取されたTAL中回転ニューロンとその樹状突起分岐の複雑なパターンの共焦点像があります。共焦点顕微鏡を使用した場合の光学切片化により、組織切片中の単一標識細胞の単離が可能になります。

高倍率画像は、げっ歯類の脳と非ヒト霊長類の脳からの樹状突起セグメントを示しています。この技術では高強度の蛍光染色が達成されるため、ICSと免疫染色を組み合わせると、樹状突起スパインが明確に形成されます。この画像は、赤色のD眼標識と緑色でのGFP発現のための免疫染色の共局在の例を示しています。

この画像は、D oneドーパミン受容体プロモーターの下で蛍光タンパク質GFPを発現するトランスジェニックマウスのsalスライスに対応しています。このビデオを見れば、弾丸の準備方法と、蛍光染料でまばらに起こりやすいニューロンにJing銃を使用する方法についてよく理解できるはずです。この技術により、ニューロンの形態を明確に視覚化し、ダイト分岐とスパインの研究が可能になります。