げっ歯類からの神経細胞とヒト以外の霊長類の脳スライスのDiOLISTIC標識

私はゲイル・シーベルです。国立アルコール乱用・依存症研究所のベロニカ・アルバレス博士の研究室でポストドクトラルフェローを務めています。本研究は、オレゴン霊長類センターのカトリーン・グラント博士およびアンドリュー・ウォウ氏、ならびに本研究で使用した非人間霊長類組織を提供してくださったウェイクフォレスト大学のジェームズ・デネ博士との共同研究により行われました。本手順の全体的な目的は、ニューロンに蛍光染料を導入し、あらゆる年齢のげっ歯類や霊長類などの異なる種の脳切片を標識することです。

樹状突起および樹状突起棘の形態を研究するため、まずTsとビーズをD eyeなどの親油性染料でコーティングします。次に、チューブの内側をD eyeコーティングビーズで敷き詰め、それを Helios 遺伝子銃システムの弾丸として使用する小さな断片に切断します。最後に、遺伝子銃を用いてD eyeコーティングビーズを脳切片に導入します。

この手順の最終ステップは任意です。スタイリスティクス（stylistics）を免疫染色と組み合わせることで、他のマーカーを同時に局在化させることができます。最終的に、共焦点顕微鏡や2光子顕微鏡などの高解像度イメージング、および樹状突起の分枝や樹状突起スパインの形態研究に適した、ニューロンのまばらな蛍光ラベル化の結果を得ることが可能です。既存の手法と比較した本技術の主な利点は、スタイリスティクスが種、年齢、遺伝子型を問わず、あらゆる動物の脳切片に適用できることです。

本手法は免疫染色と併用することができ、高解像度顕微鏡観察に適した希薄な蛍光標識を可能にします。まず、化学薬品用ドラフトチャンバー内にて、30 mg/mLの最終濃度となるように、450 mLの塩化メチレンに13.5 mgの親油性染料を加え、タングステンビーズをコーティングします。300 mgのタングステンビーズが入った1本のプリエロクアチューブに300 µLの塩化メチレンを加え、激しくピペッティングしてビーズを再懸濁させ、均一な溶液にします。

弾丸1セットにつき100 milligramsのタングステンビーズを使用します。ビーズを再懸濁させるためにピペッティングを行い、100 millilitersのビーズと溶解した染料をガラススライドに加えて十分に混ぜ合わせます。ピペットチップを用いて、ビーズが薄い灰色になるまで完全に自然乾燥させます。スライドの下にきれいなワックス付き白紙を敷き、きれいなカミソリ刃を使用して、各色の弾丸のビーズをガラススライドからかき取り、微粉末状に砕きます。

コーティングされたビーズをホエイペーパー上に掻き出し、15 mLのコニカルチューブに集めます。3 mLの水を加え、室温のウォーターバスで10～30分間ソニケーションし、凝集した塊を完全に分散させます。0.7 mのティールチューブを切り、一方の端を斜めにカットして、チューブアダプターを用いてもう一方の端を12 mLのシリンジに接続します。自由端を10 mg/mLのポリビニルピロロン（PVP）溶液10 mLが入ったチューブに入れ、溶液をチューブ経由でシリンジ内に完全に吸引します。

ビーズ溶液をボルテックスしながらシリンジでポンピングして均一な混合液とし、ビーズの沈殿を防ぐため迅速に作業しながら、溶液をチューブ内に完全に吸引します。チューブの両端をピンと張った状態で、気泡が入らないように注意してください。気泡が入ると、その箇所にビーズが付着しなくなります。チューブを左右に傾けて、均一に分散させます。

ビーズを分配します。チューブをプレップステーションに挿入し、ビーズが沈降するまで30～60秒間待ちます。シリンジを使用して、ゆっくりとスムーズに操作します。

ビーズを残して水を排除します。すぐにシリンジを取り外し、チューブを回転させ始めます。プレップステーションの窒素流量を4〜5 LPM（ドライ）に調整し、水滴が見えなくなるまで10〜20分間処理します。

プレップステーションからチューブを取り外し、チューブカッターを用いてブレットを 13 millimeter の長さに切断します。良好なブレットは、内部が均一に薄いグレーの霞のような状態でコーティングされています。ブレットを、無水硫酸カルシウムなどの乾燥剤を入れたアルミ箔で包んだシンチレーションバイアルに入れます。使用するまで室温で保存してください。

Diicラベル標識は、さまざまな種や年齢の脳組織、および多様な保存方法で保存された脳組織におけるニューロンの染色に使用できます。スライス前またはスライス後に固定した脳切片を、24ウェルプレートの各ウェルに配置します。

スライスを1X PBSで3回、1回につき5〜10分間洗浄します。PBSをピペットで取り除き、絵筆を使用してスライスをウェルの中心に配置します。ジーンガンのバレルライナーの端にある2枚の金属拡散スクリーンに、3.0 µmのフィルターを1枚挟み込みます。

バレルライナーの先端をサンプルから1.5 centimeters離してジーンガンを保持します。120 to 180 PSIのヘリウムガス圧で、スライスにビーズを射入します。余分な染料を除去するため、1 XPBSでスライスを迅速に3回すすぎます。

すべての液体操作ステップにおいて、スライスの切断面が上を向いた状態を維持してください。DAIが樹状突起に沿って広がるように、スライスをPBSに3〜6時間浸し、アルミホイルで覆って保存します。DAIは光感受性があるため、この段階でスライスをマウントするか、次節に詳述するように抗体による追加染色を行うことができます。染色を進めるには、0.01% TRITTON X 100を含む透過液を各スライスに300〜500 µL加え、室温で正確に15分間インキュベートします。

ウェルから透過処理液を取り除き、10% goat serumと0.01% tritan X 100を含む1 XPBSのブロッキング液で切片をブロッキングし、室温で30分間インキュベートします。各ウェルに、ブロッキング液で希釈した一次抗体を300～500 µL加えます。抗体に応じて、室温で1～2時間、または一晩インキュベートします。切片を1 XPBSで3回洗浄し（各洗浄5～15分間）、ウェルから溶液を除去します。

ブロッキング溶液で希釈した二次抗体を各ウェルに300～500 µLずつ加えます。前述と同様に、1×PBSを用いて1回につき5～15分間、計4回洗浄します。スライスを蛍光封入剤を用いてガラススライドに封入し、18×18 mmのカバーガラスで覆います。室温で6～12時間乾燥させた後、縁を透明のネイルポリッシュで封止し、暗所でまたは遮光して4 °Cで保存します。

ラベル付けされた脳切片の代表的な画像をここに示します。確認すべき重要な2つの特徴は、低倍率でのまばらなラベル付けパターンと、個々の細胞成分を識別できることです。弾丸（bullets）の調製不備や組織の過剰固定は、ここに示されるような不適切なラベル付けにつながる可能性があります。

トラブルシューティングのヒントをここに記載します。ここでは、マウス脳由来のTAL培地で培養された紡錘形ニューロンの共焦点画像と、その複雑な樹状突起の分岐パターンが示されています。共焦点顕微鏡を使用することで得られる光学切片化により、組織切片内の単一の標識細胞を単離することが可能になります。

高倍率画像は、げっ歯類および非ヒト霊長類の脳から得られた樹状突起分節を示しています。ICSと免疫染色の組み合わせにより、高い蛍光染色強度が得られ、樹状突起スパインが明確に描出されていることに注目してください。この画像は、赤色のD eyeラベルと、緑色のGFP発現に対する免疫染色の共局在の例を示しています。

この画像は、D1ドーパミン受容体プロモーターの下で蛍光タンパク質GFPを発現しているトランスジェニックマウスの脳切片に対応しています。このビデオを視聴することで、ペレットの調製方法および、蛍光色素を用いてニューロンを疎らに標識するためのジングガン（Jing gun）の使用方法について十分に理解できるはずです。この手法により、ニューロンの形態を鮮明に可視化し、樹状突起の分枝やスパインを研究することが可能になります。