プレ埋め込み免疫組織化学および電子顕微鏡のための非ヒト霊長類脳組織の調製

この実験の全体的な目標は、電子顕微鏡法のための非霊長類脳組織の信頼性の高いプレエンベッド免疫染色を得ることです。この方法は、正確な脳構造における特定の神経支配のシナプス発生率など、神経解剖学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、電子顕微鏡に適した特定の神経支配を標識するための簡単で低コストの方法であることです。

まず、関心領域を含むアクロレイン固定非ヒト霊長類脳の50ミクロンの厚さの切片を、PBSを含む12ウェルプレートに移します。フリーフローティング切片をPBSで室温で5分間3回洗浄し、次いで新たに調製した水素化ホウ素ナトリウム溶液で室温で30分間インキュベートします。カバーなしでやさしく揺らします。

30分が経過したら、水素化ホウ素ナトリウムを吸引し、各ウェルにPBSを添加します。プレートをロッカーに置き、10分間激しく振ってください。洗浄をさらに2回、または反応ガスがなくなるまで繰り返します。

2%正常血清と0.5%冷魚ゼラチンをPBSで希釈した溶液で室温で1時間、穏やかに揺さぶりながらインキュベートすることにより、切片をブロックします。インキュベーション時間が経過したら、一次抗体溶液中の切片を室温で一晩穏やかに振盪しながらインキュベートします。翌日、前回と同様に切片を洗浄した後、切片を二次抗体溶液中で室温で1時間半インキュベートし、穏やかに揺さぶってください。

前回と同様に切片を洗浄した後、アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼまたはABC溶液で1時間ロッキングしながらインキュベートします。次に、TBSで希釈した0.005%過酸化水素と0.05%3,3'ジアミノベンジジンの新鮮な溶液を調製します。洗浄後、切片をDAB溶液中で3〜7分間、穏やかに揺さぶりながらインキュベー

茶色の沈殿物が目的の色に発達したら、冷たいTBSですばやく2回洗浄し、次に一連の時限TBSおよびPB洗浄で反応を停止します。DABで染色された切片を含むプレートをベントフードに移します。PBを充填した6ウェルプレートに切片を移し、PBをプレートから慎重にピペッティングして切片を完全に平らにし、平坦化した切片を乱さないように四酸化オスミウム溶液を一滴ずつ加えます。

プレートをアルミホイルで覆って切片を光から保護し、攪拌せずに室温で30分間インキュベートします。浸透時には、エポキシ樹脂混合物の各成分を大きなプラスチックカップに適量加えて、撥水エポキシ樹脂を調製します。均一な茶色が得られるまで木の棒またはプラスチック製のピペットで攪拌し、次に同量の樹脂を処理されるセクションの数に適したサイズのアルミニウムカップに移し、休ませます。

浸透期間が経過したら、切片をPBで3回、低速ロッキングで10分間洗浄します。洗浄後、次の一連の等級付けされたエタノールの切片をそれぞれ2分間脱水します。次に、プロピレンオキシドを充填したガラスバイアルに切片を移し、プロピレンオキシドでそれぞれ2分間ずつ3回インキュベートして脱水プロセスを完了します。

次に、セクションを1つずつ慎重にアルミカップに移し、空気との接触をできるだけ避けます。切片をあらかじめ混合した撥水エポキシ樹脂に平らに埋め込み、通気フードの下で室温で一晩インキュベートします。翌日、スライドガラスとプラスチックカバースリップに鉱物油を塗り、アルミカップを60°Cで12〜15分間インキュベートして樹脂を柔らかくします。

スライドガラスのグリースを塗った側のセクションを慎重に平らにします。グリースを塗ったカバースリップを置き、残っている空気を慎重に押し出します。スライドを摂氏60度で48時間インキュベートします。

48時間後、プラスチックカバースリップを取り外し、部分を樹脂で包んだままにします。まず、双眼鏡を使用して関心領域を特定し、次にメスを使用して約1ミリリットルの四角形の小さな組織片を切断します。次に、レジンブロックの先端をヤスリで削り、四角形のティッシュピースを接着します。

乾燥後、レジンブロックをウルトラミクロトームデッキの垂直位置に置き、鋭利なカミソリの刃を使用してレジンブロックの各面を徐々に切断し、側面が滑らかな台形を形成します。次に、デッキを水平位置に置き、台形の最も長い辺が下を向くまでブロックを回転させます。ダイヤモンドトリミングツールまたはガラスナイフを専用のスペースに置きます。

ウルトラミクロトームを300ミクロン切片を毎秒1mmで切断するように設定します。ナイフを四角形のピースに対して垂直に平行にし、約1度の非常に小さな水平角度を表示するように調整し、組織が現れ始めるまで四角形のピースの表面を切り取ります。次に、蒸留水で満たされたボートを装備したウルトラ45度のダイヤモンドナイフに切り替えて、80ミクロンの厚さの切片をカットします。

水面に触れずにキシレンで先端を付けた吸収紙でセクションを滑らかにし、むき出しの150メッシュの銅グリッドにシリアルセクションを収集します。グリッドをグリッド収納ボックスに入れ、クエン酸鉛ストック溶液と蒸留水の1対1の溶液を準備し、0.2ミクロンのシリンジフィルターでろ過します。バイアルをアルミホイルで覆って、光から保護します。

希釈したクエン酸鉛溶液の滴に各グリッドを置き、セクションを溶液と接触させ、次に小さなピンセットを使用してグリッドを保持し、蒸留水を含む2つのビーカーで完全にすすぎます。吸収紙で余分な水分をやさしく取り除き、グリッドをグリッドボックスに入れます。30分後、切片を透過型電子顕微鏡で検査することができます。

このリスザルの内部淡蒼球の電子顕微鏡写真は、免疫ペルオキシダーゼジアミノベンジジン法におけるアクロレイン-PFA経心臓灌流後の良好な物質を示しています。そこに見られるように、この手順では、矢印で示されている大きな軸索のミエリン鞘を見ることができます。この外眼球の電子顕微鏡写真は、文字dで示される樹状突起プロファイル、aで示される小さな無髄軸索、およびavとラベル付けされた軸索静脈瘤を容易に識別できることを示しています。

矢印は、樹状突起プロファイルとの対称的なシナプス接触を確立する軸索静脈瘤の例を示しています。免疫標識された要素は、その細胞質または電子密度の高いDAB沈殿物で満たされた軸索形質によって容易に同定できます。ここでは、GPiのコリンアセチルトランスフェラーゼに対して免疫染色された樹状突起が、非標識軸索静脈瘤からシナプス接触を受け取ります。

この電子顕微鏡写真は、GPeの有髄軸索を示しており、比較的無傷のミエリン鞘があり、その軸索はチロシンヒドロキシラーゼの免疫標識されています。この例は、樹状突起との対称的なシナプス接触を確立するセロトニントランスポーターのGPi免疫標識における軸索静脈瘤を示しています。この例では、DAB沈殿物が細胞膜と細胞小器官の外面を覆っています。

ここに示されている軸索静脈瘤は、GPeで観察され、チロシンヒドロキシラーゼの免疫標識されました。これは、DAB沈殿物が軸索質を完全に満たし、シナプス小胞が見えるが、描写がより困難になる一例を表しています。この手順に続いて、二重免疫組織化学の事前埋め込みなどの他の方法を実行して、シナプスレベルでのタンパク質や受容体の共局在などの追加の質問に答えることができます。

このビデオを見れば、非霊長類脳組織のプレエンベッド免疫組織化学を調製する方法、エポキシ樹脂へのエンベッドに進む方法、および電子顕微鏡に適した厚さ80マイクロメートルの厚さのセクションに関心領域をウルトラカットする方法を十分に理解できるはずです。