Name: プレ埋め込み免疫組織化学および電子顕微鏡のための非ヒト霊長類脳組織の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: 学ぶ非ヒト霊長類脳組織のプレ埋め込み免疫組織化学法。アクロレイン固定と電子顕微鏡適用により、シナプス構造の神経解剖学的研究を効率的かつ低コストで実現します。

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この研究は、自然科学とカナダの工学研究会（NSERC、MPに401848から2011）によってサポートされていました。 MPは、 フォンデRECHERCHEデュケベックサンテ（FRQ-S）からキャリア賞を受け取りました。 LEはFRQ-S（FRQ-S 14D 29441）から博士交わりの受信者でした。私たちは、技術支援のためにマリージョゼWallmanに感謝します。

<ol><li>Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+spatial+light+modulation+two-photon+microscopy+for+fast+functional+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging.</a> Neurophotonics. 2 (1), 015005(2015).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+study+of+detecting+gold+nanorods+in+living+cells+with+confocal+reflectance+microscopy+and+two-photon+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy.</a> J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).</li>
<li>Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+12+nm+resolution+Fresnel+zone+plate+lens+based+soft+X-ray+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy.</a> Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).</li>
<li>Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+50+nm+spatial+resolution+EUV+imaging-resolution+dependence+on+object+thickness+and+illumination+bandwidth%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth.</a> Opt Express. , (2011).</li>
<li>Wachulak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compact+%26%2334%3Bwater+window%26%2334%3B+microscope+with+60+nm+spatial+resolution+for+applications+in+biology+and+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">A compact &#34;water window&#34; microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology.</a> Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).</li>
<li>Stikov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+histology+of+the+myelin+g-ratio+with+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging.</a> Neuroimage. 118, 397-405 (2015).</li>
<li>Stikov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+myelin+g-ratio+from+electron+microscopy+images+of+the+macaque+corpus+callosum%5BTitle%5D)+AND+%22Data+Brief%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum.</a> Data Brief. 4, 368-373 (2015).</li>
<li>Mollenhauer, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artifacts+caused+by+dehydration+and+epoxy+embedding+in+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy.</a> Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).</li>
<li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Realizing+the+potential+of+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Realizing the potential of electron cryo-microscopy.</a> Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).</li>
<li>Sander, B., Golas, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+bionanostructures+using+transmission+electron+microscopical+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques.</a> Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).</li>
<li>Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+of+human+low-density+lipoprotein+and+bound+receptor+based+on+cryoEM%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).</li>
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<li>Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+structural+organization+of+eukaryotic+and+prokaryotic+cytoskeletons+using+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography.</a> Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).</li>
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<li>Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStierhof%2C+Y+%22Handbook+of+cryo-preparation+methods+for+electron+microscopy%22">Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy</a>. 14, 344-365 (2009).</li>
<li>Leranth, C., Pickel, M. V. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-1-4757-2055-6_6">Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods.</a> Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).</li>
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<li>King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrolein%3A+a+fixative+for+immunocytochemical+localization+of+peptides+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system.</a> J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).</li>
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<li>Karlsson, U., Schultz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+of+the+central+nervous+system+for+electron+microscopy+by+aldehyde+perfusion%3A+I.+Preservation+with+aldehyde+perfusates+versus+direct+perfusion+with+osmium+tetroxide+with+special+reference+to+membranes+and+the+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ultrastruct.+Res%22%5BJournal%5D)">Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space.</a> J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).</li>
<li>Sesack, S. R., Pickel, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+ultrastructural+localization+of+enkephalin+and+tyrosine+hydroxylase+immunoreactivity+in+the+rat+ventral+tegmental+area%3A+multiple+substrates+for+opiate-dopamine+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions.</a> J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).</li>
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<li>Eid, L., Parent, A., Parent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asynaptic+feature+and+heterogeneous+distribution+of+the+cholinergic+innervation+of+the+globus+pallidus+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct.+Funct%22%5BJournal%5D)">Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates.</a> Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).</li>
<li>Eid, L., Parent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+evidence+for+dopamine+interactions+with+pallidal+neurons+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates.</a> Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).</li>
<li>McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+freezing+for+preservation+of+high+resolution+fine+structure+and+antigenicity+for+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling.</a> Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).</li>
<li>Gilkey, J., Staehelin, L. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jemt.1060030206/abstract">Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure.</a> J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).</li>
<li>Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+adult+mouse+neocortex+comparing+aldehyde+perfusion+with+cryo+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Karlsson, U., Schultz, R. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022532066800345">Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion.</a> J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).</li>
<li>Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+neurons+and+neuroglia+of+cerebral+cortex+and+corpus+callosum%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum.</a> Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).</li>
<li>Gocht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+LR+white+resin+for+post-embedding+immunolabelling+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anat.+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue.</a> Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).</li>
<li>Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fixation+and+penetration+enhancement+techniques+for+use+in+ultrastructural+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry.</a> J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).</li>
<li>Manocha, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glutaraldehyde+fixation+on+the+localization+of+various+oxidative+and+hydrolytic+enzymes+in+the+brain+of+rhesus+monkey%2C+Macaca+mulatta%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+J%22%5BJournal%5D)">Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta.</a> Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).</li>
<li>Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+immunodetection+of+various+protein+antigens+in+glutaraldehyde-fixed+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue.</a> J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).</li>
<li>Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemistry+of+glutamate+at+the+synaptic+level%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level.</a> J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).</li>
<li>Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kainate+receptors+in+primary+afferents+to+the+rat+gracile+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus.</a> Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).</li>
<li>Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S. Jr, Grillo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+of+neural+tissues+for+electron+microscopy+by+perfusion+with+solutions+of+osmium+tetroxide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide.</a> J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).</li>
<li>Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCorthell%2C+J+%22Basic+Molecular+Protocols+in+Neuroscience%3A+Tips%2C+Tricks%2C+and+Pitfalls%22">Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls</a>. , 1st ed, Academic Press. 83-90 (2014).</li>
<li>Helander, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+prepared+from+paraformaldehyde+is+stable%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable.</a> Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).</li>
<li>van Harreveld, A., Khattab, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+fixation+with+glutaraldehyde+and+post-fixation+with+osmium+tetroxide+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy.</a> J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).</li>
<li>Renno, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embedding+double-gold+labeling+immunoelectron+microscopic+co-localization+of+neurotransmitters+in+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Monit%22%5BJournal%5D)">Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain.</a> Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).</li>
<li>Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picking+Faces+out+of+a+Crowd%3A+Genetic+Labels+for+Identification+of+Proteins+in+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging.</a> Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).</li>
<li>Labrecque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+multiplex+single-particle+tracking+of+different+receptor+subtypes+labeled+with+quantum+dots+in+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons.</a> J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008(2016).</li>
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著者は、開示することは何もありません。

この記事では、我々は、ヒト以外の霊長類の経心臓灌流およびEMのサンプル検査に適した事前埋め込み免疫組織化学のための信頼性の高いプロトコルを提示します。例えばCEMOVISような典型的なクライオEMは、脳の微細構造の良好な保存を提供するが、それはまた、免疫組織化学12の使用を制限します。クライオ置換およびTokuyaso技術を含む他の技術は、免疫組織化学を埋め込むポストできるように、これらの技術は、デュー・プロセス中に必要な追加のデバイスに高価であり、時間がかかり、12、14、15のスキルに挑戦することができます。また、効率的に凍結固定法を使用するために、試料は（大気圧29で28と10μmの凍結高圧を使用する場合、厚さ200ミクロンまで）は比較的小さくなければなりません。理想的には、良い取得します霊長類の脳組織の...

共焦点及び二光子顕微鏡を含む光学顕微鏡は、他のものの1、2のうち、 インビボ神経プロセスで研究するための効率的なツールであることが証明されました。光学顕微鏡（LM）レベルでの典型的な空間分解能は約200nmであるが、このような極紫外線および軟X線顕微鏡などの異なる光源を用いた最近の技術の進歩は、特に、約10 nmの空間分解能3にこの解像度を増加しています、4、5。イメージングにおける他の技術的進歩は、組織学と組み合わせた磁気共鳴画像を含み、 インビボでミエリン鞘の厚さを測定するための新規な方法、唯一の電子顕微鏡（EM）レベル6,7に伝統的に測定可能であったパラメータを提供します。 AlthouGH LMレベルでのこれらの進歩は、シナプス接触の生体プロセス、構造の詳細図および特性を研究するための優れたツールを提供し、わずか0.5ナノメートルに達することができ、解像度を提供EM、を用いて達成することができます。しかし、EMレベルでの観察は、細胞構築を維持するために、化学固定剤と脱水プロセスと、いくつかの方法で死んで、変更する標本が必要です。従って、高解像度で生体試料を検査することは、放射電子ビームによる損傷、低コントラスト、膜の構造偏差、又は8、9、10を埋め込む以下脱水及びエポキシ起こり得るアーチファクトのも存在に挑戦することができます。 構造解析のために彼らの本来の形で標本を保存する「クライオビトリファイドセクションのEM」またはCEMOVIS、切片化アプローチを用いることによって達成することができます急速凍結及び硝子体氷で試料を埋め込み、極低温11、12にEM下のセクションを調べることを含みます。彼らはまだ固体と完全に水和している間、この手順は、このように脱水工程13に起因するアーチファクトを除去する、試料の検査を可能にします。しかし、この方法では、重要な追加コストを発生させる非常に低い温度でこの観察を可能にするために、凍結超薄切片のための追加の装置と同様に、標準のEMに関する追加のデバイスを必要とします。また、CEMOVISアプローチは、抗体は、通常、室温でインキュベートしなければならないため、技術を免疫標識の使用を妨げます。また、凍結固定した標本をゆっくりと凍結防止化学薬品に浸しながら解凍し、目されている、その間、凍結置換法を使用して免疫組織化学的方法で超微細構造解析を組み合わせることが可能ですエンなどLowicrylsなどの特殊な樹脂に包埋しました。ポスト埋め込み免疫標識は、その後、材料12上で実行することができます。しかし、凍結置換とクライオ固定技術は時間がかかります。彼らは、追加の装置の設置を必要とし、依然として低温14,15の使用にもかかわらず、有機溶媒および細胞構築を変更することができる化学固定液に露出されるようにサンプルを必要とします。したがって、特にアクロレインとLMとEMレベル、脳組織の化学的固定、の両方ですべての技術的進歩にもかかわらず、EM 16で免疫組織化学を結合する低コストおよび時間効率的な方法のままです。 過去数十年間で、多くの試みが最高の組織保存を提供アルデヒドの混合物を見つけるために行われました。 1960年代の前に、EMのために許容可能な結果を​​与えただけで化学固定液は、四酸化オスミウムました。しかし、四酸化オスミウムは、脳のような臓器を修正するために血管系を通してその使用を排除し、毒性の高い、高価です。アクロレインは、細胞構造17のEM観察に適した動物組織の保存のための信頼性の高い方法として、1950年代後半に導入されました。これは、より深く組織を貫通し、浸漬によって固定のために使用され、組織17の最小の収縮と細胞質成分の良好な保存を可能にする他のアルデヒドよりも速く反応します。そのような酵素および他のタンパク質18の生体分子化合物のより正確な局在化を可能にすることにより、新鮮な組織で使用される場合、このような特徴は、アクロレイン固定を他のアルデヒドを超える明確な利点を与えます。確かに、それは効率的stabiliとして、両生類及びげっ歯類を含む多くの種でEMレベルで可視化のための固定の、簡単で効率的かつ低コストの方法として、年間を通じて検証されていますZESペプチドおよびタンパク質は、抗原性を保持し、他のアルデヒド固定剤16、18、19、20、21と組み合わせて使用される場合、比較的無傷の超微細構造を提供します。げっ歯類におけるアクロレイン固定用プロトコルは、それ以来EM 16、22二重免疫標識を実施するために、特にPickel基によって、広範囲に標準化に使用されてきました。いくつかのグループは、ヒト以外の霊長類の脳組織23にアクロレイン固定を使用していました。しかし、我々の知る限り、効率的にEMが24を免疫標識と互換性のある非ヒト霊長類におけるアクロレインとの化学的固定を記述する一つだけ発表されたプロトコルがあります。 この記事では、我々は、効率的、化学的に非ハムを修正するための簡単で信頼性の高い方法を提供します免疫標識および送信EM検査を事前に埋め込むとともに、潜在的に長期保存を可能にアクロレインと霊長類の脳、。

<table><tbody><tr><td>二塩基性無水リン酸ナトリウム(Na2HPO4)</td><td>Fisher scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>一塩基性一水和物リン酸ナトリウム(NaH2PO4&#183;H2O)</td><td>EM Science</td><td>SX0710-1</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>Fisher scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxymethyl aminomethane (THAM)</td><td>Fisher scientific</td><td>T370-500</td><td></td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>EMD</td><td>HX0603-3</td><td>1 N希釈。製品は腐食性です。適切な保護具を装着して使用してください。</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0590-1</td><td>5 N希釈。製品は腐食性です。適切な保護具を装着して使用してください。</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>4%希釈。製品は粉末状で揮発性が高く、毒性が強いです。適切な保護を備えた通気フードの下で注意して使用してください。</td></tr><tr><td>アクロレイン(90%)</td><td>シグマ</td><td>110221</td><td>3%希釈。製品は非常に有毒です。適切な保護を備えた通気フードの下で使用してください。</td></tr><tr><td>検死通気台</td><td>Mopec</td><td>CE400</td><td></td></tr><tr><td>電子灌流ポンプ</td><td>コールパーマー</td><td>masterflex L/S 7523-90</td><td></td></tr><tr><td>針(灌流)</td><td>terumo&nbsp;</td><td>NN-1838R</td><td>18 G 11/2</td></tr><tr><td>ニードル</td><td>テルモ&nbsp;</td><td>NN-2713R</td><td>21 G 1/2</td></tr><tr><td>ケタミン</td><td></td><td></td><td>20 mg/kg</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td></td><td></td><td>4 mg/kg</td></tr><tr><td>アセプロマジン</td><td></td><td></td><td>0.5 mg/kg</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> メス メス<tr><td>刃</td><td>羽毛&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;ランス</td><td>201011&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;J9913</td><td>No.22 手術用 No.22 および No. 11 EM</td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs</td> ビブラトーム <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ライカ</td><td>VT 1200S</td><td>各使用前にブレードを校正し、デバイスが許可すると</td></tr><tr><td>ビブラトーム カミソリ刃</td><td>ジレット</td><td>GIN 642107</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー 科学</td><td>G33-4</td><td>30% 希釈</td></tr><tr><td>エチレングリコール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>E178-4</td><td>30% 希釈</td></tr> 水素<tr><td>化ホウ素ナトリウム (NaBH4)</td><td>シグマ</td><td>S-9125</td><td></td></tr><tr><td>正常馬血清 (NHS)</td><td>ジャクソン免疫研究所</td><td>008-000-121</td><td>2% 希釈</td></tr><tr><td>冷魚ゼラチン</td><td>オーリオン</td><td>900.033</td><td>0.5% 希釈。オリジナル製品は40%に濃縮されています</td></tr><tr><td>一次抗体、SERT</td><td>Santa Cruz biotechnology</td><td>SC-1458</td><td>1/500</td></tr>希釈<tr><td>一次抗体、ChAT</td><td>Chemicon (Millipore)</td><td>AB144P</td><td>1/25希釈一次</td></tr><tr><td>抗体、TH</td><td>ImmunoStar</td><td>22941</td><td>1/1,000希釈ビ</td></tr><tr><td>オチン化二次抗体、ヤギ</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>BA-9500</td><td>1/1,000希釈</td></tr><tr><td>ビオチン化二次抗体、マウス</td><td>ベクター研究所</td><td>BA-2000</td><td>1/1,000 希釈</td></tr><tr><td>ベクタステインエリート ABCキット</td><td>ベクター研究所</td><td>PK6100</td><td>8.8 & マイクロ;L/mL の A と B をそれぞれ</td></tr><tr><td>3,3'-ジアミノベンジジン (DAB)</td><td>Sigma</td><td>D5637</td><td>0.05% 希釈。製品は粉末状で揮発性が高く、有毒です。流しにゴミを捨てないでください。</td></tr><tr><td>過酸化物 (H2O2) 30%</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>H-323</td><td>0.005% 希釈</td></tr><tr><td>四酸化オスミウム (OsO4)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>2% 19152 4% 19150 </td><td>元の溶液は 2% または 4% のいずれかです。最終的な1%の希釈を計算するためにどちらが使用されるかに注意してください。製品は光に非常に敏感です。オスミウムは非常に有毒です。適切な保護を備えた通気フードの下でのみ使用してください。</td></tr><tr><td>デュルクパン撥水エポキシ樹脂</td><td>シグマ</td><td>A:Mエポキシ樹脂(44611) B:硬化剤964(44612) C:促進剤960(DY060)(44613) D:可塑剤(44614)&nbsp;</td><td>58°で48時間重合します。廃棄物を捨てる前にC。</td></tr><tr><td>アルミウムカップ</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>70048-01</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>市販アルコール</td><td>1019C</td><td>蒸留水で適切な濃度で希釈</td></tr><tr><td>酸化プロピレン 電子</td><td>顕微鏡科学</td><td>20401</td><td>有機溶剤。揮発性が高く、毒性があります。通気フードの下で使用してください。</td></tr><tr><td>コーティングされていない媒体ガラススライド脳</td><td>研究所</td><td>3875-FR</td><td>鉱物油によるグリース表面</td></tr><tr><td>プラスチックフィルム (Aclar 埋め込みフィルム)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>50425-25</td><td>鉱物油によるグリース表面</td></tr><tr><td>ウルトラミクロトーム</td><td>ライカ UC7</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンドトリミングツール (ウルトラトリム)</td><td>珪藻&nbsp;</td><td>UT 1081</td><td>ガラスナイフを代わりに</td></tr><tr><td>ウルトラ45&deg使用できます。ダイアトメー ダイアモンドナイフ</td><td>Diatome&nbsp;</td><td></td><td>ボート</td></tr>ザ<tr><td>イレン</td>フィ<td>ッシャー科学</td><td>X5SK-4</td><td></td></tr><tr><td>150メッシュ銅グリッド</td>を装備MC13437 <td>電子顕微鏡科学</td><td>G150-cu</td><td></td></tr>グリッド<tr><td>ボックス</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>71138</td><td>最大100グリッドを保存できます</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>アナケミア</td><td>81983</td><td></td></tr><tr><td>硝酸鉛</td><td>シグマ</td><td>L-6258</td><td>1.33&nbspでできたクエン酸鉛の原液を作ります。gの硝酸鉛と1.76&nbsp;42&nbspで希釈したクエン酸ナトリウムのg;mLの煮沸および冷却済みの蒸留水8&nbsp;1のmL&nbsp;N NaOHは、硝酸鉛からクエン酸鉛への変換が完了した後に添加されます。pHは約12である必要があります。溶液を密閉プラスチックボトルに保管し、光から保護します。</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>テルモ&nbsp;</td><td>SS-05L</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td><td>Corning</td><td>431222</td><td>0.2 &micro;m</td></tr><tr><td>吸収紙(ビビュラスペーパー)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>70086-1</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>実験用フィルム</td><td>PM-999</td><td></td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr></tbody></table>

プレ埋め込み免疫組織化学および電子顕微鏡のための非ヒト霊長類脳組織の調製

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

光学顕微鏡レベルでのすべての技術の進歩にもかかわらず、電子顕微鏡は、シナプスの連絡先などの神経細胞の超微細構造および形態学的な詳細を検討し、特徴づけるための神経科学における唯一のツールのまま。電子顕微鏡のための脳組織の良好な保存が厳しい低温定着方法によって得ることができるが、これらの技術は、かなり高価であると同定された神経系の接続性を理解することが重要である免疫標識の使用を制限します。凍結置換法は、免疫標識とクライオ固定の組み合わせを可能にするために開発されています。しかし、これらの方法論的アプローチの再現性は、通常は高価な凍結デバイスに依存しています。また、この技術の信頼性の高い結果を達成することは非常に時間がかかり、スキル困難です。したがって、特にアクロレイン固定伝統的な化学的に固定された脳は、電子を結合する時間効率および低コストの方法のままで免疫組織化学と顕微鏡。ここでは、霊長類の脳組織の維持につながり、プレ埋め込み免疫組織化学および透過型電子顕微鏡検査と互換性のある化学アクロレイン固定を使用して信頼性の高い実験プロトコルを提供します。

このセクションでは、我々は、化学的に3％のアクロレインの混合物、4％PFAで固定し免疫染色霊長類の脳組織の、送信EMレベルで、観察後に得られた代表的な結果を提示します。比較的無傷のミエリン鞘と二重膜（ 図2A）のニート可視化によって示されるように、我々は、超微細構造の良好な保存を達成しました。シナプス接点は、微小環境からニューロンの要素と共に、容易に（ 図2B）を同定することができます。ジアミノベンジジン（DAB）免疫沈降物で標識されたニューロンの要素は、それらの充填された細胞質または軸索原形質によってEMレベルで認識されます。原形質膜および細胞小器官の外側表面はまた、典型的には、電子密度の沈殿物（ 図3）で裏打ちされています。 この特定の実験では、抗体のAGAを使用しましたリスザルの淡蒼球の（GPE）、外部または内部（GPI）セグメント（ <stro...

ここでは、我々は簡単に、低コストを提供し、時間効率のよいプロトコルは、化学的に透過型電子顕微鏡のための免疫組織化学を事前に埋め込むと互換性のある長期保存を可能に、アクロレイン固定液と霊長類の脳組織を修正します。

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

本実験の全般的な目的は、電子顕微鏡観察のために、非霊長類脳組織において信頼性の高い埋め込み前免疫染色を行うことです。この手法は、特定の脳構造における特定の神経支配のシナプス発生頻度など、神経解剖学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、電子顕微鏡に適した特定の神経支配を標識するための、簡便かつ低コストな方法であることです。まず、目的の領域を含むアクロレイン固定済みの非ヒト霊長類脳の50 micron厚の切片を、PBSを入れた12ウェルプレートに移します。遊離切片を室温で5分間、PBSで3回洗浄し、その後、新鮮に調製した水素化ホウ素ナトリウム溶液中で室温で30分間インキュベートします。蓋をせず、穏やかにロッキングします。30分が経過したら、水素化ホウ素ナトリウムを吸引除去し、各ウェルにPBSを加えます。プレートをロッカーステアラーに載せ、10分間激しく振盪させます。洗浄をさらに2回繰り返すか、反応ガスが完全に消失するまで行ってください。2%通常血清および0.5%冷魚ゼラチンをPBSで希釈した溶液中で、室温にて緩やかに揺らしながら1時間インキュベートし、切片をブロッキングします。インキュベーション時間が経過した後、一次抗体溶液中で室温にて緩やかに揺らしながら一晩インキュベートします。翌日、前述と同様に切片を洗浄した後、二次抗体溶液中で室温にて緩やかに揺らしながら1時間半インキュベートします。前述と同様に切片を洗浄した後、アビジン・ビオチン・ペルオキシダーゼまたはABC溶液中で1時間、ロッキングしながらインキュベートします。次に、TBSで希釈した0.05% 3, 3'ジアミノベンジジンおよび0.005%過酸化水素の新鮮な溶液を調製します。洗浄後、DAB溶液中で3〜7分間、穏やかにロッキングしながら切片をインキュベートします。褐色沈殿が目的の色に達したら、速やかに冷TBSで2回洗浄し、その後、時間を定めたTBSおよびPBでの一連の洗浄を行って反応を停止させます。DAB染色した切片を含むプレートを排気フードへ移動させます。切片をPBを満たした6ウェルプレートに移し、プレートからPBを慎重にピペットで吸い出すことで切片を完全に平坦化させます。その後、平坦化した切片を乱さないよう、四酸化オスミウム溶液を1滴ずつ加えます。プレートをアルミホイルで覆って切片を遮光し、室温で30分間、静置してインキュベートします。オスミウム固定の間、エポキシ樹脂ミックスの各成分を適切な量だけ大きなプラスチックカップに加え、撥水性エポキシ樹脂を調製します。均一な褐色になるまで木製スティックまたはプラスチックピペットで撹拌し、処理する切片数に応じたサイズのアルミカップに等量の樹脂を分注して静置します。オスミウム酸固定期間が終了したら、切片をPBで10分間、低速でロッキン

preparation-non-human-primate-brain-tissue-for-pre-embedding

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

脳の銀行と生体物質の系統的サンプリングは、公平な立体学の基礎を提供し、各試料から得られる潜在的なデータを最大限に高めることができます。...

脳バンキング：あなたの研究の標本のほとんどを作る

全体の霊長類の脳で標的タンパク質の大規模な免疫検出は、任意の時点で複数のフリーフローティングセクションのバッチ染色のための創造的な装置の使用を組み合わせる方法を埋め込み、セクションなどの新たな組織を採用することで可能です。...

全モンキー脳の大規模なタンパク質の検出のためのバッチの免疫染色

我々は経心臓的マウスの灌流、脳の除去と切片だけでなく、免疫ペルオキシダーゼ染色、樹脂の埋め込み、および脳切片の切片極薄のためのプロトコルについて説明します。これらの手順が完了すると、免疫染色の材料は、透過型電子顕微鏡による検査のための準備ができています。...

免疫電子顕微鏡のためのマウスの脳組織の準備

我々は、齧歯類と異なる年齢のヒト以外の霊長類の脳スライスの神経細胞に、そのようなDIIなどの蛍光色素を、導入する遺伝子銃の使用を示します。この特定のケースでは、我々は、成体マウス（3-6ヶ月齢）と成人cynomologusサル（9-15歳）を使用します。もともと博士リヒトマン（ガンの研究室で記述されたこの技術、...

げっ歯類からの神経細胞とヒト以外の霊長類の脳スライスのDiOLISTIC標識

脳標本の準備からデータの可視化と分析に、ナイフエッジの走査型顕微鏡を使用してシリアルのセクショニング画像への完全なプロセスが記載されている。この手法は、現在のマウスの脳のデータを取得するために使用されますが、それは他の臓器、他の種に適用可能です。...

ナイフエッジスキャン顕微鏡用試料作製、イメージング、および解析プロトコル

出典:Eid, L. &amp; Parent, M. Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy. J. Vis. Exp.

非ヒト霊長類脳組織に対する免疫組織化学の実施

ここで説明するプロトコルは、全量網膜製剤の構造評価のためのものです。これには、組織解剖、親水性ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)メンブレンインサートへのマウント、蛍光マーカーによるボーラスローディング、細胞およびシナプス成分の免疫組織化学的分析のためのカルボジイミドおよびパラホルムアルデヒドによる固定の比較の説明が含まれます。...

イメージングと免疫組織化学のための網膜ホールマウントの準備のために最適化されたプロトコル

この入門レベルのプロトコルは、ミクログリアとニューロン要素のマーカーを例に、げっ歯類の脳の免疫組織化学的染色を完了するために必要な試薬、機器、および技術を説明しています。...

ミクログリアとニューロンのための例染色：凍結切片ラット脳組織の免疫組織化学のためのプライマー

ここでは、ウイルス粒子または蛍光マイクロビーズを新生児マウスの脳に脳室内および血管内に注入する簡単な方法について説明します。ウイルスとナノ粒子の局在パターンは、顕微鏡評価またはin...

新生児の脳へのウイルス粒子と蛍光マイクロビーズの脳室内および血管内注入

溶媒除去された器官の究極の3Dイメージングのような新しい、免疫染色互換組織クリアリング技術は、狂犬病ウイルス脳感染症とその複雑な細胞環境の3D可視化を可能にします。厚い、抗体標識された脳組織スライスは、画像深さを高め、共焦点レーザー走査顕微鏡による3D解析を可能にするために光学的に透明に作られています。...

溶媒クリア脳組織における狂犬病ウイルス感染の高解像度3Dイメージング

このプロトコルはmultilabel FISHおよび蛍光性のIHC信号を達成することを目標に、新しい凍結および固定マウス頭脳セクションの蛍光性in situ の交配(魚)および蛍光性のimmunohistochemistry...

マルチプレックス蛍光 In Situ ハイブリダイゼーションと蛍光免疫組織化学の融合による新鮮、凍結、または固定マウスの脳切片の結合(英語)

学ぶ非ヒト霊長類脳組織のプレ埋め込み免疫組織化学法。アクロレイン固定と電子顕微鏡適用により、シナプス構造の神経解剖学的研究を効率的かつ低コストで実現します。

プレ埋め込み免疫組織化学および電子顕微鏡のための非ヒト霊長類脳組織の調製

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