プレ埋め込み免疫組織化学および電子顕微鏡のための非ヒト霊長類脳組織の調製

本実験の全般的な目的は、電子顕微鏡観察のために、非霊長類脳組織において信頼性の高い埋め込み前免疫染色を行うことです。この手法は、特定の脳構造における特定の神経支配のシナプス発生頻度など、神経解剖学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、電子顕微鏡に適した特定の神経支配を標識するための、簡便かつ低コストな方法であることです。

まず、目的の領域を含むアクロレイン固定済みの非ヒト霊長類脳の50 micron厚の切片を、PBSを入れた12ウェルプレートに移します。遊離切片を室温で5分間、PBSで3回洗浄し、その後、新鮮に調製した水素化ホウ素ナトリウム溶液中で室温で30分間インキュベートします。蓋をせず、穏やかにロッキングします。

30分が経過したら、水素化ホウ素ナトリウムを吸引除去し、各ウェルにPBSを加えます。プレートをロッカーステアラーに載せ、10分間激しく振盪させます。洗浄をさらに2回繰り返すか、反応ガスが完全に消失するまで行ってください。

2%通常血清および0.5%冷魚ゼラチンをPBSで希釈した溶液中で、室温にて緩やかに揺らしながら1時間インキュベートし、切片をブロッキングします。インキュベーション時間が経過した後、一次抗体溶液中で室温にて緩やかに揺らしながら一晩インキュベートします。翌日、前述と同様に切片を洗浄した後、二次抗体溶液中で室温にて緩やかに揺らしながら1時間半インキュベートします。

前述と同様に切片を洗浄した後、アビジン・ビオチン・ペルオキシダーゼまたはABC溶液中で1時間、ロッキングしながらインキュベートします。次に、TBSで希釈した0.05% 3, 3'ジアミノベンジジンおよび0.005%過酸化水素の新鮮な溶液を調製します。洗浄後、DAB溶液中で3〜7分間、穏やかにロッキングしながら切片をインキュベートします。

褐色沈殿が目的の色に達したら、速やかに冷TBSで2回洗浄し、その後、時間を定めたTBSおよびPBでの一連の洗浄を行って反応を停止させます。DAB染色した切片を含むプレートを排気フードへ移動させます。切片をPBを満たした6ウェルプレートに移し、プレートからPBを慎重にピペットで吸い出すことで切片を完全に平坦化させます。その後、平坦化した切片を乱さないよう、四酸化オスミウム溶液を1滴ずつ加えます。

プレートをアルミホイルで覆って切片を遮光し、室温で30分間、静置してインキュベートします。オスミウム固定の間、エポキシ樹脂ミックスの各成分を適切な量だけ大きなプラスチックカップに加え、撥水性エポキシ樹脂を調製します。均一な褐色になるまで木製スティックまたはプラスチックピペットで撹拌し、処理する切片数に応じたサイズのアルミカップに等量の樹脂を分注して静置します。

オスミウム酸固定期間が終了したら、切片をPBで10分間、低速でロッキングしながら3回洗浄します。洗浄後、以下の段階的なエタノール系列を用いて、各液で2分間ずつ切片を脱水します。次に、切片をプロピレンオキシドを満たしたガラスバイアルに移し、プロピレンオキシド中で2分間ずつ3回インキュベートして脱水工程を完了させます。

その後、切片を一つずつ注意深くアルミニウムカップに移し、可能な限り空気に触れないようにします。あらかじめ混合しておいた撥水性エポキシ樹脂を用いて切片を平坦に包埋し、ベンチングフード内で室温にて一晩インキュベートします。翌日、ガラススライドとプラスチックカバーガラスにミネラルオイルを塗布し、その後、アルミニウムカップを60 °Cで最大12〜15分間インキュベートして樹脂を軟化させます。

ガラススライドのグリスを塗布した面で、切片を慎重に平坦にします。グリスを塗布したカバーガラスを載せ、残っている気泡を慎重に押し出します。スライドを60 °Cで48時間インキュベートします。

48時間後、プラスチックのカバーガラスを取り除き、切片を樹脂に包まれた状態にします。まず、双眼鏡を用いて関心領域を特定し、次にメスを使用して約1mm²の小さな正方形の組織片を切り出します。次に、樹脂ブロックの先端をやすりで削り、そこに正方形の組織片を接着します。

乾燥後、樹脂ブロックをウルトラミクロトームのデッキに垂直に設置し、鋭利なカミソリを用いて樹脂ブロックの各面を徐々に切削し、側面が滑らかな台形に整えます。次に、デッキを水平に戻し、台形の最長辺が下を向くまでブロックを回転させます。専用のホルダーにダイヤモンドトリミングツールまたはガラスナイフをセットします。

ウルトラミクロトームを、切削速度 1 mm/s、切削厚 300 µm に設定します。ナイフを四角形の試料に対して垂直平行に調整し、水平方向の角度を約 1 度という非常に小さい角度に設定して、組織が現れるまで試料表面をトリミングします。次に、蒸留水を満たしたボートを備えた 45 度ダイヤモンドナイフに切り替え、厚さ 80 µm の切片を切り出します。

キシレンを含ませた吸水紙で、水面に触れないように切片の上をなぞって平滑にし、連続切片を裸の150メッシュ銅製グリッドに回収します。グリッドをグリッド保存箱に入れ、クエン酸鉛ストック溶液と蒸留水を1:1の割合で混合した溶液を調製し、0.2ミクロンのシリンジフィルターでろ過します。光から保護するため、バイアルをアルミホイルで覆います。

希釈したクエン酸鉛溶液の液滴の上に、切片が溶液に接するように各グリッドを配置します。次に、小型ピンセットでグリッドを保持し、蒸留水を入れた2つのビーカーで十分に洗浄します。吸い取り紙で余分な水分を優しく取り除き、グリッドをグリッドボックスに入れます。30分後、透過電子顕微鏡で切片を観察することができます。

リスザルの内側淡蒼球のこの電子顕微鏡写真は、アクロレイン-PFAを用いた経心腔灌流および免疫ペルオキシダーゼ-ジアミノベンジジン法の後でも、物質が良好に保存されていることを示しています。写真に見られるように、この手順により、矢印で示された太い軸索の髄鞘を観察することが可能です。外側淡蒼球のこの電子顕微鏡写真では、文字dで示された樹状突起の断面、aで示された小さな無髄軸索、およびavと表記された軸索静脈瘤が容易に識別できることがわかります。

矢印は、軸索バリコシティが樹状突起プロファイルと対称的なシナプス接触を形成している例を示しています。免疫標識された要素は、電子密度の高いDAB沈殿物で満たされた細胞質または軸索質によって容易に識別できます。ここでは、GPiにおいてコリンアセチルトランスフェラーゼで免疫染色された樹状突起が、未標識の軸索バリコシティからシナプス接触を受けています。

この電子顕微鏡写真は、GPeにおける髄鞘が比較的維持された有髄軸索を示しており、その軸索質はチロシン水酸化酵素で免疫標識されています。この例は、セロトニントランスポーターで免疫標識され、樹状突起と対称的なシナプス接合を形成しているGPiの軸索静脈腫を示しています。この例では、DAB沈殿物が細胞膜およびオルガネラの外表面に沿って形成されています。

ここに示す軸索静脈瘤はGPeで観察され、チロシン水酸化酵素で免疫染色されたものである。これは、DAB沈殿物が軸索質を完全に満たしている例であり、シナプス小胞は確認できるものの、その輪郭を明確に描き出すことはより困難である。この手順の後、タンパク質や受容体のシナプスレベルでの共局在などのさらなる疑問を解決するために、埋め込み前二重免疫組織化学などの他の手法を実施することができる。

このビデオを視聴することで、非霊長類脳組織の包埋前免疫組織化学染色の調製方法、エポキシ樹脂への包埋手順、および電子顕微鏡観察に適した厚さ 80 µm の関心領域のウルトラカット切片の作成方法について十分に理解することができます。