Name: マウスの横大動脈狭窄 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-21T18:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学ぶマウスの横大動脈狭窄（TAC）手術法。気管挿管、部分開胸、大動脈結紮、ドップラー血流測定による圧負荷評価を含む詳細なプロトコルで、心肥大と心不全のメカニズム研究に活用できます。

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XHTWは、医学研究でWMケック財団特別若い学者であり、そしてまた、NIH / NHLBIの助成金R01 - HL089598とR01 - R01HL091947、および筋ジストロフィー協会の助成金＃69238でサポートされています。 RJvOは生理ゲノミクスにおける2008年から2010年、アメリカ生理学会ポストドクトラルフェローシップの受賞者です。この作品は、CaMKIIはハートでシグナリングのための財団Leducqアライアンスによって部分的にサポートされています。

パート1：術野の準備<ol><li>動作フィールドは、75％イソプロピルアルコールで消毒されています。 </li><li>加熱パッドは上と右の温度でであることを確認してください。推奨されるシステムは、37℃で維持されている治療のパッドに接続されている水の循環ポンプGaymar℃± 1℃です。心拍数の急激な低下を避けるために手術中に正常な体温を維持することが重要です。 </li><li>手術器具は、手術前にホットビーズ滅菌器で滅菌されています。鈍はさみ、もちろん曲がったピンセットX 2、罰金45 °傾斜鉗子X 2、角度の春のはさみ、胸リトラクタ、およびニードルホルダー：この手順では、以下の手術器具が必要になります。 </li><li>コットンアプリケーターは、出血の場合には手にしてください。 </li></ol>パート2：マウスの​​調製と挿管<ol><li>マウスは0.5 -1.0 L /分100％O 2と混合イソフルラン2％の誘導室内で麻酔する。 </li><li>バリカンは、ネックラインからミッド胸の高さに毛を剃るために使用されます。 </li><li>マウスは、体温を維持するために加熱パッドの上仰臥位に配置されます。 </li><li>ゴムバンドを首を拡張するために動物の前歯の上に置かれる。片手で湾曲した鉗子を使用して、舌を優しく側に操作されます。一方で、気管内挿管はPE 90チューブを使用して実行されます。気管内チューブは、125〜150回/分および0.1〜0.3ミリリットルの一回換気量で、ハーバードのボリュームを再投入齧歯類の人工呼吸器のサイクリングに接続されています。 1.0 L /分100％O 2 -手術中、麻酔は0.5とイソフルラン1.5から2パーセントに維持されている。麻酔の適切なレベルは、マウスの爪床（つま先ピンチ反射）に圧力を適用することによって検証されます。 </li><li>手術野を70％アルコール、続いbetadine液で消毒されています。この手順を3回繰り返されます。 </li><li>運転中に手術野の汚染を防ぐために、滅菌ドレープは、操作フィールドが公開されたまま、マウスの上に配置されています。 </li><li>滅菌手袋のセットは、個々のマウスに使用されます。 </li></ol>パート3：横大動脈のライゲーション<ol><li>第二肋骨までの部分的開胸術は、手術用顕微鏡下で行われ、胸骨は胸のリトラクターを使用して、収納されています。 </li><li>ファイン先端45 °傾斜鉗子を穏やかに大動脈弓から胸腺と脂肪組織を分離するために使用されています。 </li><li>横大動脈の識別に続いて、6.0絹縫合糸の小片は、腕頭と左総頸動脈（図1）の間に配置されます。 </li><li>二つの緩い結び目が横大動脈と27の小片の周囲に関連付けられています½ゲージ鈍針が横大動脈に平行に配置されます。第一結び目はすぐに、針で引き分けた第二に続くと針は速やかに直径0.4mmの収縮を得るために削除されます。偽対照マウスでは、全体の手順は、大動脈のライゲーションを除いて同一です。 </li><li>胸のリトラクタが取り外され、再度膨らませる肺に2秒間人工呼吸器ピンチオフの流出された。 </li><li>胸郭は、結節縫合パターンを6.0 proleneの縫合糸を使用して閉じられます。 </li><li>皮膚は連続縫合パターンを6.0 proleneの縫合糸を使用して閉じられます。 </li></ol>パート4：手術後の回復<ol><li>術後鎮痛のために、マウスは、ブプレノルフィン（0.1 mg / kg）を腹腔内に注入されます。手術後の脱水の兆候がある場合は、滅菌生理食塩水を腹腔内に与えられます。 </li><li>麻酔が徐々にオフの位置に下げ、自発呼吸の兆候が発生したときに気管内チューブは削除されます。 </li><li>マウスは、発生しやすい位置に移動し、加熱パッドを回復するために許可されています。 </li></ol>第5部：横大動脈の成功ライゲーションの確認<ol><li> TAC 1週間後、マウスは横大動脈の結紮により誘発される圧負荷の程度を決定するために再麻酔です。上述したように、麻酔は0.5とイソフルラン1.5から2パーセントに維持されている- 37℃に維持1.0 L /分100％O 2と体温℃± 1℃の</li><li> 20 MHzのドップラープローブは、流速を検出するために45 °の角度で首の左右両側に配置されます。コンピュータベースのドップラー信号プロセッサ（インダスインスツルメンツ、ヒューストン、テキサス州）は、ドップラー信号を表示および格納するために使用されました5。 </li><li>実験的なプロトコルに必要な圧負荷の程度に応じて、一定の範囲内で右頸動脈（RC）/左頸動脈（LC）流量比を持つ唯一のマウスはさらなる分析のために含まれています。深刻な圧負荷を伴う厳密なくびれがtを導くのに対し、例えば、圧負荷中程度は、5-8の比率につながる8-10 OAの比（図5.3A）。シャム動物は（運営が連結していない）、しかし、〜1（図5.3B）の比率が期待される。 </li></ol> 6：代表的な結果野生型マウスでTACを以下の典型的な手術の生存率は約80〜90％です。横大動脈の手術が成功結紮は5-​​10の右と左総頸動脈との間のドップラー流速比（RC / LC）（図1）につながる。偽手術したマウス（図2A）と比較すると、圧負荷を持つマウスは、くびれの気密性（図2B）に応じて、6〜8週後1-2週間以内に心臓肥大、および心拡張を開発することが期待されています。遺伝子組み換えマウスは別の生存率を示すかもしれないがTACの後の最初の月の間に死亡率は、野生型マウスに（&lt;20％）一般的に低いです。6,7 <img src="/files/ftp_upload/1729/1729fig1tmb.jpg" alt="図1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。ドップラー速度計測を用いて横大動脈ライゲーションの確認。右の代表ドップラー速度信号（RC）と左頸動脈（LC）動脈6日後のTAC。これらの録音は、〜6.8のRC / LC流量比で成功したライゲーションを示しています。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1729/1729fig1.jpg">ここをクリックして</a>図1の拡大バージョンを参照すること。 <img src="/files/ftp_upload/1729/1729fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 TACに続いて代表的な心臓全体の画像。 。擬似手術野生型マウスの心臓。B。野生型マウスの心臓16週後のTAC。各ライン= 1ミリメートル。

<ol><li>Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J. Jr, Chein, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+atrial-specific+and+inducible+expression+of+an+atrial+natriuretic+factor+transgene+in+an+in+vivo+murine+model+of+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).</li>
<li>Heineke, J., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cardiac+hypertrophy+by+intracellular+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signaling pathways.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 7, 589-600 (2006).</li>
<li>Hartley, C. J., Reddy, A. K., Madala, S., Michael, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doppler+estimation+of+reduced+coronary+flow+reserve+in+mice+with+pressure+overload+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Doppler estimation of reduced coronary flow reserve in mice with pressure overload cardiac hypertrophy.</a> Ultrasound Med. Biol. 34, 892-901 (2008).</li>
<li>Reddy, A. K., Taffett, G. E., Li, Y. -H., Lim, S. -W., Pham, T. T., Pocius, J. S., Entman, M. L., Michael, L. H., Hartley, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doppler+signal+processing+for+use+in+mice%3A+applications%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Doppler signal processing for use in mice: applications.</a> IEEE Trans. Biomed. Eng. 52, 1771-1783 (2005).</li>
<li>Li, Y. -H., Reddy, A. K., Ochoa, L. N., Pham, T. T., Hartley, C. J., Micheal, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+age+on+peripheral+vascular+response+to+transverse+aortic+banding+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Effect of age on peripheral vascular response to transverse aortic banding in mice.</a> J. Gerontol. 58A, 895-899 (2003).</li>
<li>Bourajjaj, M., Armand, A. S., Martins, daC. osta, Weijts, P. A., Nagel, B. V. ander, Heeneman, R., Wehrens, S., Windt, X. H. D. e, J, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFATc2+is+a+necessary+mediator+of+calcineurin-dependent+cardiac+hypertrophy+and+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">NFATc2 is a necessary mediator of calcineurin-dependent cardiac hypertrophy and heart failure.</a> J. Biol. Chem. 28, 22295-22303 (2008).</li>
<li>Oort, R. J. van, Respress, J. L., Li, N., Reynolds, C., Almeida, A. C. D. e, Skapura, D. G., Windt, L. J. D. e, Wehrens, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+development+of+pressure+overload+induced+cardiac+hypertrophy+and+dysfunction+in+an+RyR2-R176Q+knockin+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Accelerated development of pressure overload induced cardiac hypertrophy and dysfunction in an RyR2-R176Q knockin mouse model.</a> Hypertension. 55, (2010).</li>
<li>Tarnavski, O., McMullen, J. R., Schinke, M., Nie, Q., Kong, S., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cardiac+surgery%3A+comprehensive+techniques+for+the+generation+of+mouse+models+of+human+diseases+and+their+application+for+genomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies.</a> Physiol Genomics. 16, 349-360 (2004).</li>
</ol>

人間の大動脈弁狭窄症を模倣TACは、マウスでは心肥大や心不全を誘発することが一般的な方法です。大動脈狭窄のための代替サイトは、昇順および腹部大動脈が含まれています。大動脈狭窄を昇順とは、左心室（LV）上に極端な、より迅速な過負荷を提供します。対照的に、腹部大動脈狭窄は、可能な補償の手段として、循環の無傷の大部分を残します。従って8には、調査へのより従順時間依存の方法で十分なLVの過負荷を提供するとして、TACは、しばしば好ましいモデルです。この手順は練習で、技術的に困難なことができますが、我々は、野生型マウスで80〜90％の生存率を達成しています。 横大動脈狭窄の気密性は、肥大の開発の度合いと心不全と拡張が発達する時間枠を決定する。また、マウスの年齢は、心不全の開発の回収率と反応速度に影響を与えます。それ以上の年齢のマウス（年齢の&gt; 12ヶ月）は、TACに頸動脈の適応応答を開発するために時間がかかり、そしてより速くより若いマウス（生後3〜4ヵ月）より拡張型心筋症を発症する可能性があります。5 <p class="jove_c...

<table><tbody><tr><td>Gaymar T/pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Model TP-500</td><td>循環水ポンプ</td></tr><tr><td>温度治療パッド</td><td>Harvard Apparatus</td><td>60-3414</td><td></td></tr><tr><td>ホットビーズ滅菌器</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>鈍端剪刀</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5980</td><td></td></tr><tr><td>角度付きスプリング剪刀</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5668</td><td></td></tr><tr><td>胸部開創器</td><td>Fine Science Tools</td><td>17002-02</td><td></td></tr><tr><td>粗い曲線ピンセット</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5138</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 精密 45&amp;#x00B0; 角度付きピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-25</td><td></td></tr><tr><td>持針器</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>電気シェーバー</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>マウスの被毛切除用</td></tr><tr><td>PE 90 チュービング</td><td>BD Biosciences</td><td>427420</td><td>挿管用</td></tr><tr><td>MiniVent（人工呼吸器）</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Type 845</td><td></td></tr><tr><td>ベタジン</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027132</td><td>医療用品店で購入可能</td></tr><tr><td>滅菌手袋</td><td>Mckesson</td><td>20-1565</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Unico</td><td>ZM186</td><td></td></tr><tr><td>6-0 シルク縫合糸</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>27 &amp;frac12; ゲージ針</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>6-0 プロレン縫合糸</td><td>Mckesson</td><td>3286</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン</td><td>Institutional Animal Facility</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスの横大動脈狭窄

Transverse Aortic Constriction in Mice

マウスの横大動脈狭窄（TAC）は、圧負荷誘発性心肥大および心不全のための一般的に使用される実験的なモデルです。<sup&gt; 1</sup&gt; TACは、最初は多くの場合、心臓の収縮性の一時的な強化に関連付けられている心臓、の補償肥大につながります。時間が経つにつれて、しかし、慢性的な血行動態の過負荷に対する応答は、心拡張と心不全の結果、不適応となります。<sup&gt; 2</sup&gt;マウスTACのモデルは、最初のロックマンによって検証された<em&gt;ら</em&gt;。<sup&gt; 1</sup&gt;、と以来、広く人間の心血管系疾患を模倣し、心臓肥大応答と心不全の開発に関わる基本的なシグナル伝達プロセスを解明する貴重なツールとして使用されています。このような左前下行（LAD）冠状動脈の完全閉塞などの心不全の他の実験モデル、と比較すると、TACは、心肥大や心不全の発症に、より緩やかな時間経過の再現性の高いモデルを提供します。ここで、我々はマウスに外科TACを実行するためにステップバイステップ手順を説明します。大動脈結紮によって生成圧負荷のレベルを決定するために、高い周波数ドップラープローブは、左右の頸動脈の血流速度との比率を測定するために使用されます。<sup&gt; 3、4</sup&gt; 80〜90％の手術の生存率では、バンディング横大動脈は、マウスの左室肥大や心不全を誘導する有効な手法です。

マウスの横大動脈狭窄（TAC）は、心肥大や心不全の開発の基礎となるメカニズムを研究するために一般的に使用される実験的なモデルです。ここで、我々は、マウスの心肥大の再現性の学位を作成するために大動脈を収縮する手順を説明します。

マウスにおける大動脈横断的結紮（TAC）は、圧力負荷誘発性の心肥大および心不全の一般的な実験モデルである。

この手順では、まずマウスを麻酔し、無菌的な手術の準備を整え、加熱パッドの上に仰向けに配置します。PE 90チューブを用いて気管内挿管を行い、その後、マウス用人工呼吸器に接続します。次に、第2肋骨まで部分的な開胸術を行い、胸骨を牽引します。横大動脈を確認し、その後、腕頭動脈と左総頸動脈の間で結紮します。肋骨を閉じ、続いて皮膚を連続縫合で閉じます。最後に、気管内チューブを抜去し、マウスを回復させます。こんにちは。ベイラー医科大学分子生理学・生物物理学部のZander Wars博士の研究室のAngela Dal Medaです。本日は、マウスにおける大動脈横断的狭窄の手順をご紹介します。当研究室では、心肥大および心不全の発症メカニズムを研究するためにこの手法を用いています。それでは、始めていきましょう。横大動脈狭窄（TAC）手術を開始する前に、術野を75% isopropyl alcoholで消毒します。ヒートパッドの電源を入れ、適切な温度に設定してください。推奨されるシステムは、37 ± 1 °Cに維持される温熱療法パッドに接続されたゲーミング用循環水ポンプです。手術前に、ホットビーズ滅菌器で手術器具を滅菌してください。外科的手術には、以下の手術器具が必要です。鈍端剪刀1本、粗い曲がった鉗子2本（または45度角度付き鉗子）、角度付きスプリング剪刀1本、胸部開創器、および持針器を用意します。出血に備えて、綿棒も手元に準備しておく必要があります。術野の準備が整い次第、マウスの挿管に進みます。挿管の準備として、マウスを導入チャンバー内で麻酔し、バリカンを用いて首のラインから胸部中央までまで被毛を刈り取ります。マウスを加熱パッドの上に仰臥位で安置します。心拍数の急激な低下や突然死を避けるため、手術中は正常な体温を維持することが重要です。マウスの爪床に圧力を加え、完全に麻酔がかかっていることを確認します。動物の前歯にラバーバンドをかけ、首を伸ばします。片手の曲がったピンセットを用い、もう一方の手で舌を優しく横に寄せます。気管にPE 90チューブを挿入します。次に、気管内チューブをハーバード社製ボリュームサイクル式小型動物用人工呼吸器に接続します。人工呼吸器は、マウスの体重に応じて、呼吸数を1分間に125〜150回、1回換気量を0.1〜0.3 millilitersに設定して作動させます。術野内の皮膚をベタジン溶液、続いて70% alcoholで消毒します。術中の術野汚染を防ぐため、この手順を3回繰り返します。マウスの上に滅菌ドレープを掛け、術野のみを露出させます。これから、本手術における横大動脈の結紮を行います。麻酔は、1.5〜2%のイソフルランと、毎分0.5〜1リットルの100%酸素を用いて維持します。マウスの爪床に圧力を加え、麻酔レベルが適切であることを確認してください。トークン反射がないことを確認します。部分胸腔切開を行い、手術を開始します。胸骨の頭側端から第2肋骨のレベルまで切開します。手術用顕微鏡を用いて、胸壁開創器で胸骨を牽引します。次に、45度角度付きの微細チップ鉗子を使用し、大動脈弓から胸腺と脂肪組織を慎重に分離します。横大動脈を確認後、無名動脈と左総頸動脈の間に、少量の6.0シルク縫合糸を配置します。横大動脈に2つの緩い結び目を作り、27.5ゲージの鈍針の破片を横大動脈と平行に配置します。まず1つ目の結び目を針に沿って素早く締め、次に2つ目の結び目を締め、その後すぐに針を抜くことで、直径0.4 mmの狭窄を作成します。横大動脈の結紮後、胸壁開展器を取り除き、人工呼吸器の流出路を2秒間遮断します。肺を慎重に再膨張させるため、6.0 proline縫合糸を用いて断続縫合で肋骨を閉じます。最後に、6.0 proline縫合糸を用いて連続縫合で皮膚を閉じます。術後の鎮痛のため、マウスにブプレノルフィンを腹腔内投与します。手術後に脱水症状が見られる場合は、0.3から1 mLの滅菌生理食塩水を腹腔内投与します。麻酔を徐々にオフの位置まで下げます。自発呼吸の兆候が見られたら、気管内チューブを抜去し、マウスを腹臥位にして加熱パッドの上で回復させます。横大動脈狭窄術から1週間後、マウスを再度麻酔し、横大動脈の結紮によって誘発された圧負荷の程度を判定します。麻酔および体温の維持は、既報の方法に従って行います。20 megahertzのドップラープローブを、頸部の左右に45度の角度で当てます。頸動脈の血流速度を検出するために、コンピュータベースのドップラー信号処理装置を用いてドップラー信号を表示および保存します。実験プロトコルで必要とされる圧力負荷の程度に応じて、右総頸動脈（RC）と左総頸動脈（lc）の血流比が一定の範囲内にあるマウスのみを、以降の解析の対象とします。例えば、中等度の圧力負荷では比率は5〜8となり、より強い結紮による重度の圧力負荷では比率は8〜10となります。一方、シャム手術個体では比率は約1になると想定されます。野生型マウスにおけるTAC後の標準的な手術生存率は、約80～90%です。横大動脈の手術的結紮により、シャム手術群と比較して、右頸動脈と左頸動脈のドップラー血流速度比（RC/LC）は5～10倍になります。圧力負荷をかけたマウスでは、結紮の強さに応じて、1～2週間以内に心肥大が、6～8週間後に心拡大が起こることが予想されます。マウスにおける横大動脈狭窄術の実施方法について解説しましたが、この処置を行う際は、正常な体温を維持し、出血を最小限に抑えることが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。

Research

JoVE Journal

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