蛍光顕微鏡法のための昆虫の脚の処理:イメージングのための神経筋構造を保存する方法

- まず、麻酔をかけた昆虫を70%エタノール溶液に浸して、キューティクルの疎水性を減らします。次に、界面活性剤を含むリン酸緩衝生理食塩水で組織を洗浄し、浸透させて、固定中に組織が浸透できるようにします。

次に、胸部から頭と腹部を取り出します。鉗子を使用して、肋骨と胸部の接合部に穏やかな圧力をかけ、脚を取り外します。脚を氷冷した4%パラホルムアルデヒド溶液に一晩慎重に置き、組織に浸透させます。パラホルムアルデヒドは、タンパク質を架橋することで組織を固定します。

その後、固定液を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水含有界面活性剤で組織を数回洗浄します。マウントする前に、バッファーが組織に入るのに十分な時間を確保するために、脚を純粋なまたはわずかに希釈したマウントバッファーに少なくとも1日間置きます。

最後に、埋込剤の滴に脚を取り付けます。顕微鏡スライドとカバーガラスの間にスペーサーを使用して標本の損傷を防ぎ、マウントをマニキュアで固定します。

次の例では、Drosophila melanogasterの脚の解剖、固定、および取り付けを見ていきます。

- まず、ガラスマルチウェルプレートに適切な数のウェルを70%エタノールで充填します。ブラシを使用して、年齢や性別を問わず15〜20匹の二酸化炭素麻酔をかけたハエを各ウェルに追加し、ハエが完全に沈むまでハエタノールに軽くたたきます。

1分以内に、0.3%非イオン性界面活性剤洗剤溶液をリン酸緩衝生理食塩水で3回洗い流し、1回の洗浄につき少なくとも10分間すすぎます。最後の洗浄後、鉗子を使用して胸部や脚を傷つけずに各フライの頭と腹部を取り除き、細い鉗子の先端を使用して肛門部と胸部の接合部に優しく、しかししっかりと圧力をかけ、片方の脚を胸部から切り離します。

新たに調製した4%パラホルムアルデヒドを氷上に含んだ新しいマルチウェルプレートの1ウェルにレッグを置き、摂氏4度で一晩インキュベーションします。

- 脚を浮かせずに固定バッファーに優しく押し込むことが大切で、しっかりと固定された脚を得ることができます。

- 翌日、新鮮な0.3%非イオン性界面活性剤洗剤溶液で脚を5回、1回の洗濯につき20分間洗います。最後の洗浄後、洗剤を封入剤と交換し、脚を少なくとも24時間封入剤に入れたままにしてください。

翌日、ガラス顕微鏡スライドのコーティングされた端の隣に約20マイクロリットルの70%グリセロールを追加し、グリセロールを22 x 22ミリメートルのカバースリップで覆います。次に、カバーガラスの右側に約10マイクロリットルの封入剤のラインを追加し、10マイクロリットルのラインの右側に2番目の30マイクロリットルの封入剤のラインを適用します。

細い鉗子を使用して、マルチウェルプレートから片方の脚を媒体の滴下で、外部側が上向きまたは下向きの10マイクロリットルの封入剤ストリップに移します。6〜8本の脚が取り付けられて位置合わせされるまで繰り返し、2番目のカバースリップが最初のカバースリップにわずかに載るように、2番目のカバースリップを脚の上に置きます。次に、カバーガラスの各角にマニキュアを使用して、カバーガラスを所定の位置に固定します。