温度勾配アッセイ:ショウジョウバエの幼虫の温度選好性を試験する方法

- ショウジョウバエの幼虫の温度嗜好をテストするには、アルミニウムアッセイプレートの片側を加熱し、もう片側を冷却して温度勾配を作成します。アルミニウムは熱伝導率が高いため、熱が効率的に伝達され、安定した線形温度勾配が生じます。システムが平衡化したら、プレート全体の温度を同じサイズの温度ゾーンで記録し、プレートの中央にきれいな幼虫をロードします。

明るい光からの干渉を排除するためにシステム全体を覆い、試用を開始します。幼虫は勾配を通じて分布し、暖かすぎたり寒すぎたりする嫌悪ゾーンを避け、好ましい温度のゾーンに落ち着きます。この動作はサーモタクシーと呼ばれます。幼虫の温度選好を評価するには、各温度ゾーンの動物の数を記録します。

このプロトコル例では、摂氏18度から28度の間の一方向の温度勾配を設定する方法と、アッセイ中に幼虫がどのように処理されるかを見ていきます。

- 一方向グラジエントを調製するには、まず、アッセイ用の湿度の高い周囲環境を作り出します。10cm離した濡れたペーパータオルの上に、別々のウォーターバスに接続された2つのアルミニウムブロックを置きます。ウォーターバスは事前に温める必要があります。次に、100ミリリットルの1%アガロースを作成し、水平な表面の各アッセイプレートに25ミリリットルを追加します。アガロースが固まったら、メラミンスポンジで表面をやさしくこすり、表面を少し粗くします。

次に、効率的な温度移動を促進するために、アッセイプレートのアルミニウムブロック間の隙間をスプレーボトルから供給される水で埋めます。次に、アッセイプレートをアルミニウムブロックに置き、境界がどちらかの端から2センチメートル離れていることを確認して、アルミニウムブロックの端と正確に一致させます。

次に、ゲルが乾かないように、プレートの表面に水の膜をスプレーします。次に、システムを段ボール箱で覆って蒸発を減らし、ゲル表面の温度を安定させます。温度が平衡化するまで5〜10分待ちます。次に、プレートの表面温度を少なくとも12か所でチェックして、全体が摂氏2度前後の温度が均一であることを確認します。その後、アッセイが実行されるまでボックスカバーを元に戻します。

まず、ジェルの上に段ボール箱を取り出し、すぐにゲルの表面温度を確認します。表面が乾燥している場合は、表面に少量の水をスプレーします。ゲルが良好な場合は、小さな絵筆を使用して各プレートの中央に100〜200匹の幼虫をロードします。次に、各アッセイプレートに蓋をして幼虫を捕獲し、光への曝露を防ぐためにセットアップを段ボール箱で覆います。現在、アッセイが進行中です。

10〜30分後、段ボール箱とマイクロプレートの蓋を外します。次に、プレートを上から撮影して、幼虫の位置を記録します。ジェルの表面での反射を避けるために、ボックスをカメラの上に置きます。プレートをクリーンアップするには、散らばった可能性のある場所にすべての幼虫を吸引します。

次に、画像解析ソフトウェアを使用して、各ゾーンの幼虫の分布の割合を計算します。アッセイプレートの境界線に基づいて2cmごとに線を描き、各ゾーンの幼虫の数を数えます。

- カウントするときは、各エッジから0.5センチメートルの領域に分布する幼虫を無視してください。ゲルの厚さと温度条件は、エッジ付近で均一ではありません。