に温痛覚を評価するためのローカルおよびグローバルメソッドショウジョウバエ幼虫

本実験の全体的な目的は、ショウジョウバエ幼虫における熱侵害受容を評価することです。これは、ショウジョウバエ幼虫を採取し、次いで有害な熱刺激にさらすことで達成されます。オプションの第2ステップとして、幼虫にUV照射を行うことができ、これにより組織損傷と熱侵害受容の感作が引き起こされます。次に、熱プローブを用いて局所的に、あるいはホットプレートを用いて全体的に幼虫を刺激し、定量的に測定可能な侵害受容反応を誘発させます。

ヒートプローブを用いた解析により、幼虫の熱に対する侵害受容反応には上限があること、および入力温度と誘発された反応の振幅との間に意外な関係があることが示されました。ヒートプレートアッセイでは、幼虫が周囲の水の温度および侵害受容感覚ニューロンの活性に依存した、定型的な侵害受容行動のシーケンスを示すことが分かっています。ここで説明する手法は、局所的または全体的に提示された有害な熱刺激に対して動物が異なる反応を示すかなど、熱侵害受容分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

一般的に、ヒートプローブアッセイに不慣れな者は、プローブを当てる際の圧力、位置、および角度のばらつきを最小限に抑えるために習熟が必要であるため、苦労することがあります。温度上昇に伴って誘発される行動を十分に理解するには、実際に観察することが不可欠であるため、ヒートプレートアッセイの視覚的なデモンストレーションが重要となります。目的の遺伝子型の後代幼虫を十分に得 hydrophilic ためには、目的の系統を直接飼育するか、または卵播種から5日後に、処女雌20〜30匹と雄15〜20匹を用いて、フライフードの入ったボトル内で交配を行います。3齢幼虫前期を回収し、柔らかくなったフライフードをすくい出し、630 µmの孔径を持つメッシュを用いて緩やかに流水で漉し、洗浄します。飢餓および乾燥を防ぐため、3齢幼虫前期を少量の湿ったフードパッドに移します。

麻酔室を構築後、ピンセットまたは筆を用いて、3齢初期の幼虫10匹を蓋の内側に沿って慎重に配置し、蓋を閉じます。ドラフト内にて、1.5 mLのジエチルエーテルを浸み込ませた脱脂綿を入れた10 mLビーカーを配置したカップリングジャーの中に、麻酔室を入れます。カップリングジャーのキャップを締め、幼虫をエーテル蒸気に2〜2.5分間さらします。

麻酔後、Coplan瓶から麻酔チャンバーを取り出し、残留したエーテル蒸気が消散するまでフード内で数秒間待機させます。水スプレーボトルを使用して、麻酔チャンバーから小型ペトリ皿へ幼虫を穏やかに洗い流します。麻酔された幼虫の水分を吸い取り、3インチ×1インチのガラス製顕微鏡スライドに固定した両面スコッチテープの上に、背側を上にして慎重に固定します。

スライドをUV照射装置の底面に配置し、20 mJ/cm²の強度で6秒間、幼虫にUV光を照射します。照射後、スライドを水に浸し、幼虫を両面スコッチテープから静かに浮かせて剥離させます。ピンセットまたは筆を使用して、照射した幼虫を15 × 45 mmの容器に慎重に移します。

再宿主化させる前に、1 mLのショウジョウバエ餌を入れた1ドラムのガラス培養バイアルを用い、25 °Cまたは希望の培養温度で8～24時間回復させます。熱侵害受容アッセイでは、まずサーマルプローブの温度を希望の設定値に設定します。絵筆またはピンセットを使用して、個々の幼虫を平らなプラットフォーム上に慎重に転送し、幼虫が薄い水膜で覆われていることを確認してください。

圧力の変動を最小限に抑え、熱プローブの正確な位置と角度を確保するためには、習熟が必要です。プローブの先端を、幼虫の第4節（セグメントA4）に軽く押し当てます。このとき、プローブと幼虫の表面との角度が約45度になるように、軽い圧力を加えてください。圧力によって幼虫の表面にわずかなへこみができ、通常はこれで移動を阻止するのに十分な状態になります。

逃避反応が見られるか、または22回目のカットオフに達するまで、幼虫への刺激を続けます。反応を示す幼虫は、通常、まず頭部と尾部を持ち上げる予備動作を示し、続いて少なくとも360度回転するという逃避行動を示します。逃避行動が開始されたら、プローブとの接触を解除し、逃避までの潜時または時間を記録します。

20秒以内に回避行動が観察されない場合、その幼虫は無反応個体となります。十分な高コントラストの照明が確保されるように、ファイバー optic ライトガイドを配置してください。幼虫を観察するために、ヒーティングブロックの平らな面を上にしてホットプレートにセットし、その後ホットプレートを顕微鏡のベース上に設置します。

ホットプレートを強設定にして電源を入れ、温度が95 °Cで安定するまで約15分間待ちます。マイクロピペットを用いて、蒸留水を 80 µL 測り、60 × 15 mmのポリスチレン製ペトリ皿の中央に滴下します。ピンセットを使用して、清潔な3齢中期の幼虫を、可能な限り余分な水を付着させないように注意しながら、水滴の中央に静かに配置します。

シャーレをホットプレート上の固体加熱ブロックにそっと置きます。幼虫全体と水滴がすべて視野に入るように、素早くシャーレの位置を調整してください。タイマーを開始します。

この時点で、ペトリ皿をホットプレートの固体加熱ブロック上に配置し、各行動が始まった時間を記録します。5. 水に浸された幼虫をホットプレートに移すと、定型的な移動行動が観察されます。熱がない状態での正常な行動には、探索的な頭部の動きを伴うパラソル移動が含まれます。

次に、幼虫が頭部を前方または側方に素早く動かすヘッドスラッシング行動（head thrash behavior）が現れることがあります。この動作は水中での通常の移動に似ていますが、より不規則で、持続的に回転するように起こります。この行動は、幼虫が側方へ少なくとも360度完全に回転したときに認められます。

これは回数が変動し、時には不完全な回転を伴うことがあります。行動スコアを付ける際は、360度の完全な回転のみをカウントしてください。この行動は、ホイップ行動中の熱プローブの局所適用時の場面に最も類似しています。

幼虫は前後軸に沿って急速な収縮と弛緩を繰り返す動きを見せ、頭部がごく短時間、尾端に接近します。ホイッピング（鞭打動作）は、ローリング（回転動作）と同時に、あるいはそれに続いて急速に観察されることがよくあります。最終的に、幼虫は痙攣様行動を示し、多くの場合、その後に麻痺が続きます。痙攣様行動の間、幼虫は前後軸に沿って体を伸ばし、全身で高頻度の震えを示します。

屈曲麻痺を伴わない震え行動は、幼虫が動きを止めたときに起こります。一部の幼虫ではこれが永続的ですが、他の個体ではその後、低頻度の拍動運動が見られます。各カテゴリーに属する反応個体の割合を示したこのプロットでは、幼虫の熱侵害受容反応に上限があることがわかります。熱プローブアッセイにおいて、プローブ温度が52 °Cまでは、幼虫の100%が速い反応を示します。

しかし、54 °C以上の温度では、20秒間接触させた後でも幼虫の90%以上が反応しません。これらの幼虫は22回目のカットオフ後も動き続けますが、回転数や嫌悪回避行動に費やされた時間を測定し、プロットすることが可能です。驚くべきことに、プローブの入力温度と反応の強さの間には逆相関があるようで、温度が低いほど回転数が増加する傾向が見られます。

水に浸した幼虫をホットプレートに移すと、5つの定型的な移動行動が観察されます。ここでは、これらの行動が観察される平均潜時と、本法で提示する最適アッセイ条件下で各潜時において測定された平均水滴温度を示します。各々の特有の行動を示した幼虫の割合は77から100%の範囲でしたが、稀にローリングやホイッピング行動が省略されたり、重複したり、あるいは逆の順序で発生したりすることがありました。また、ホットプレートアッセイにおける麻痺行動の開始後に生存した幼虫の割合をここに示します。幼虫は麻痺が生じるまで加熱され、その後、回復させるために標準的な培養条件に戻されました。

擬似処置（モック処理）を施した幼虫には、熱曝露以外の同等の処置を行い、生存した成虫におけるPPEの形成を7日目から13日目に定量化した。ここで、MD G fourは、4つのクラスすべてにわたる多樹状突起末梢感覚ニューロンにおいて、UAS制御下の外来遺伝子の発現を誘導する。UAS or one delta Cは、シナプス伝達に必要なショウジョウバエのオープンレクティファイアカリウムチャネルの改変型を発現し、UAS orrc one delta NCは、シナプス伝達を妨げないようさらに改変された同チャネルを発現する。

MD GALF４ドライバーとUAS ORC1 delta Cトランスジェンの両方を保持する幼虫のみが、観察された5つの行動のうち4つにおいて潜時（latency）の延長を示すことに注意してください。このビデオを視聴することで、有害な熱刺激に対するGEs幼虫の局所的および全身的な反応の両方を測定する方法について、十分な理解が得られるはずです。これらの手順を遺伝学的解析などの他の手法と組み合わせることで、熱受容に不可欠な遺伝子を特定することが可能です。熱プローブアッセイを行う際は、プローブの加圧、位置、および接触角度によるばらつきを最小限に抑えることが重要です。