Name: に温痛覚を評価するためのローカルおよびグローバルメソッドショウジョウバエ幼虫 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 学ぶショウジョウバエ幼虫の温痛覚評価法。局所熱プローブと全体的熱プレート刺激により、傷害感受性応答を定量化する手法を解説。神経科学と行動生物学の研究に有用です。

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私たちは、原稿の重要な読書のための熱プレートアッセイ、フライ株式のブルーミントンのショウジョウバエストックセンター、Galkoラボのメンバーを提案して幼虫のヒートプローブアッセイ、ショーン·スウィーニーを開発するための熱プローブ設計、ダニエル·バブコックのためにキリスト教のランドリーに感謝します。この作品は、MJG、研究キャリア（AVG）に少数派にアクセスするためのNIH MARC U-STARトレーニンググラント（ヒューストン - ダウンタウン学者アカデミーの大学へのT34GM079088）にNIH R01 NS069828によってサポートされていました。

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我々は、開示することは何もありません。

ここで説明したアッセイは、定性的かつ定量的に有害な熱刺激に対する反応性の異なる遺伝子型の幼虫を評価するために使用することができます。ヒートプローブアッセイの主な機能は、刺激が単一の遺伝子座でしか与えられていることです。これはおそらく、おそらく唯一の小さなプローブが接触セグメントのクラスIVニューロン-もののサブセットと、すぐに隣接するセグメント11のものの発火につながる。ため局所的刺激により、ヒートプローブアッセイは、地域のような熱いストーブに接触する手など、特定の体に局在している有害な刺激を検出する一般的な感覚体験を模倣しています。ヒートプローブアッセイの欠点は、おそらく三つの要素に起因することができますいくつかのユーザ間のばらつきを持っているということです：私は）ユーザーがプローブⅱ）正確な位置、幼虫にプローブを適用すると圧力基本的な侵害受容ニューロン、および、iii）の正確なANGへの相対的な幼虫で幼虫の表面プローブ接点でル。 我々は以前に与えられた温度を1に、非レスポンダー、遅い応答し、その撤退の待ち時間に基づいて、高速応答に分類幼虫の定量的な戦略を報告した。ここではさらに高い温度に幼虫の反応性について報告する。興味深いことに、我々は、幼虫の熱侵害受容応答に天井があることを見つけて、この上限は52と54との間にあることを℃にこれは52よりも高い温度でのゲーティングが可能な一過性受容体電位（TRP）チャネル℃を有していないその幼虫が示している可能性がありますまた、それが神経細胞や筋肉が彼らも嫌悪撤退で機能する前に、破損しモータの応答を開始または遂行するために使用されることを示唆している可能性があります。また、撤退の振幅の異なる分析応答を使用して応答の &quot;堅牢性&quot;の指標としてロールの番号のどちらかを報告します。単純に、1これらのパラメータは刺激の温度の上昇や時間の経過とともに増加することが期待されます。驚くべきことに、我々はこのようなケースではないことを見つける。有害な範囲の下限（42℃）の温度で長い時間刺激した幼虫は多くのロールと、より多くの時間は、幼虫がより高い温度（48から52°C）でプローブしたときよりも、ローリング過ごし表示されます。これは有害な温度のウィンドウ内では、主に応答の振幅を決定する露出の期間であることを示唆している。幼虫は非常に有害な温度にさらされているので（48から52°C）非常に迅速に平均的に反応するの幼虫などの多くのロールは時間の長い長さの少ない有害な温度にさらされるとして、彼らは示さない。ここで報告された応答振幅の分析は、異なる遺伝子型や環境の操作を比較することができるとともに、別の定量的な次元を追加します。 熱プレートアッセイの主な特徴は、それが有害にグローバルな露出を伴うことです。熱。このように、それは熱いストーブに触れてより加熱釜に座っている動物に似ています。幼虫は、野生でグローバルに侵害刺激が発生する可能性がありますときには明らかではないが、ラボではこのグローバル曝露に対する行動応答は局所刺激によって観察されたものよりも複雑です。また、他の3で述べた熱プレートアッセイの強さは、幼虫に触れると、プロトコルのコンポーネントではありませんので、それは少しユーザ間のばらつきがあるということです。唯一の実質的な差異は、各動作が開始し、これが繰り返される表示/親しみやすさを最小限に抑えることができたときに定義することであるように思われる。アッセイの間に興味深い相違点は、嫌悪行動が開始する温度である。これらは、ヒートプローブに比べて熱プレートアッセイではるかに低い。ヒートプローブ（ヘッドとテールの昇給）と接触幼虫によって示された予備的な動作は、°Cの熱プラットフォームで〜27で観測された頭のスラッシュの相関かもしれません電子アッセイ。それは、この応答は、 &quot;痛み&quot;よりも &quot;不快感&quot;を反映している可能性があります。我々は、高温下でも、発作を打つの相関、および麻痺が観察されていない（最大48°C）熱プローブアッセイの温度、それは身体の複数の領域から発射感覚ニューロンのクリティカルマスがあるのか​​もしれないこれらの行動にもたらすために必要としていました。そのグローバルな刺激は、ローカルでの動作をトリガするためには不十分であるニューロンの応答の加算含むことができることを示すヒートプローブで観察された侵害受容閾値の下端以下 - 興味深いことに、発作と麻痺の動作は、温度（37℃〜34）で観測されているヒートプローブのアプリケーション。これらの温度は、実際に幼虫に有害として認識されていることは、ほとんどのケースではありません麻痺の動作を開始し、続いてフライ食品に回復させ、幼虫が（図5C）生き残るという観察によってサポートされています。さらに熱PLという主張を支持する食べたアッセイは、侵害受容性応答を読んでいると知られている侵害受容性感覚ニューロンにシナプス伝達をブロックして観測された行動（図6）のほとんどのレイテンシを増加させるという事実である。高温度ホイップ動作のレイテンシの増加はありませんという観察は、MD-GAL4を発現しない他の感覚ニューロンは、この動作のために必要とされることを示唆している。 グローバルなアッセイで急速に加熱水滴のローカルアッセイと液浸の小さな金属製のプローブのホットチップ - 和では、両方のアッセイは、定義された温度の有害な熱刺激に個々の幼虫を露出伴う。遺伝的背景および/ ​​または環境条件（例えば、プラスまたはマイナスの組織の損傷のために）変化にさらされるの変化のショウジョウバエの幼虫の行動応答は、学び、これらのアッセイを用いて定量することができます。最終的に、これらのアッセイの結果から、私たちはより良いNOCを制御する遺伝子ネットワークを理解するのに役立ちますショウジョウバエや他の近縁種でiception。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>温度プローブ</td><td>プロ-Devにエンジニアリング</td><td>オンデマンドカスタムビルド</td><td>連絡先情報は、リクエストに応じて提供することができ</td></tr><tr><td>乾いたバスインキュベーター</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 11から718 </td><td> 1固体の加熱ブロックと16mmの井戸1加熱ブロック</td></tr><tr><td>ライカDFC290 12v/400mA カラーカメラ</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td> 12730080 </td><td>それと同等の カメラが行います。 </td></tr><tr><td>ライカMZ6顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td> MZ6ズーム本体の部品番号（光学キャリア）は10445614です。 </td><td></td></tr><tr><td>ショットエースModulampユニット</td><td>ショットノースアメリカ株式会社</td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td>ショットデュアルグースネック23インチ光ファイバライトガイド</td><td>ショットノースアメリカ株式会社</td><td>ショットA08575 </td><td></td></tr><tr><td>温度制御ユニット</td><td> TSCI株式会社。 </td><td>カスタムビルド</td><td>詳細はご要望に応じて提供することができ</td></tr><tr><td>ツァイスSTEMI 2000顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> NT55-605 </td><td>それと同等の 顕微鏡を行います。 </td></tr><tr><td>鉗子</td><td> FST </td><td> FS-1670 </td><td></td></tr><tr><td> 1ミリメートルのメッシュ</td><td>ジェネシー科学</td><td> 57から101 </td><td></td></tr><tr><td>絵筆</td><td>ディックブリックアート材料</td><td> 06762-1002 </td><td></td></tr><tr><td> UV架橋</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 1199289 </td><td></td></tr><tr><td>コプリンジャー</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 08から816 </td><td></td></tr><tr><td> 10mlのビーカー</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 02-540C </td><td></td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> E138-500 </td><td></td></tr><tr><td> 35 X 10 mmのポリスチレンシャーレ</td><td>ファルコン</td><td> 351008 </td><td>我々はテストしていません 別の料理をお楽しみいただけます。 </td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡スライド</td><td>コー​​ニング</td><td> 26003 </td><td></td></tr><tr><td>熱電対</td><td>オメガエンジニアリング株式会社</td><td> HH802U </td><td></td></tr><tr><td>ビニールのワンピース</td><td>オフィス·デポ</td><td> 480009 </td><td></td></tr><tr><td>微小遠心管</td><td>デンヴィル科学（株） </td><td> C-2170 </td><td></td></tr></tbody></table>

に温痛覚を評価するためのローカルおよびグローバルメソッド<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

本稿では、 ショウジョウバエの幼虫の熱痛覚を勉強するためのアッセイを示しています。第二は、ほとんどの卸売（グローバル）アクティベーションまたはすべてのそのようなニューロンの3が含まれている間1つのアッセイは、熱侵害受容器1,2の（ローカル）空間的に制限された刺激が含まれます。一緒に、これらの技術は、 ショウジョウバエの侵害受容感覚ニューロンの行動機能の可視化と定量化を可能にします。 ショウジョウバエの幼虫は、熱痛覚、進化種の1,2を越えて保存されている潜在的に有害な温度に感覚応答を研究するために確立されたモデルシステムです。そのような研究のためのショウジョウバエの利点は、すべての後生動物のように、responsその神経系やショウジョウバエでは基礎生物学4-6の分子的基礎を分析するために使用することができ遺伝学的手法の高度化の相対的なシンプルさです。有害な熱刺激への電子は、一般的に提示刺激7 &quot;nocifensive&quot;嫌悪撤退を伴います。このような刺激は自由神経終末または侵害受容器を介して検出され、生物体の応答の振幅は、侵害刺激8を受信した侵害受容器の数に依存しています。 ショウジョウバエでは、感光体10のような彼らの最近発見された役割に加えて有害な熱的、機械的刺激9を検出するクラスIV樹状分枝の感覚ニューロンである。非常によく発達レベルで研究されているこれらのニューロンは、バリアの表皮シートの上に樹枝状になると11,12のほぼすべての表皮細胞との接触を行います。彼らは二次ニューロンに接続することが中枢神経系11の腹側神経索に各クラスIVニューロンのプロジェクトの一つの軸索は、脳へのプロジェクト。 ベースライン条件の下で、侵害受容性知覚神経相対的に高いしきい値に達するまで、nsは発生しません。アッセイは、研究者はベースラインの行動応答または、おそらく、次の組織の損傷をすさまじい感を定量化することができますここで説明する。各アッセイは、有害な熱刺激に異なるが、関連する運動器官の行動反応を引き起こし、 ショウジョウバエの幼虫の熱痛覚のさまざまな側面を可視化し定量化する研究を可能にします。アッセイは、所望の遺伝子型の幼虫や痛覚に影響を与える可能性があり、異なる環境条件下で飼育幼虫​​に適用することができます。熱痛覚が種間で保存されているので、 ショウジョウバエの遺伝的解剖から集められた知見は、おそらく脊椎動物を含む他の種で熱痛覚の我々の理解をお知らせします。

本稿では、熱痛覚を勉強するためのアッセイを実証<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫。 1つのアッセイは、熱侵害受容器の（ローカル）空間的に制限された刺激を伴う<sup&gt; 1,2</sup&gt;中に2番目のは、ほとんどの卸売（グローバル）、アクティベーションまたはそのようなすべてのニューロンを含む<sup&gt; 3</sup&gt;。一緒に、これらの技術は、行動機能の可視化と定量化を可能にする<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;侵害受容感覚ニューロン。

本記事では、ショウジョウバエ幼虫における温度痛覚を研究するためのアッセイを実演します。一つのアッセイでは、…の空間的に限定された（局所的な）刺激を用います。

本実験の全般的な目的は、ショウジョウバエ幼虫における熱受容能を測定することです。これは、ショウジョウバエ幼虫を回収し、続いて有害な熱刺激にさらすことで達成されます。オプションとなる第2のステップとして、幼虫にUV照射を行い、組織損傷と熱受容能の感作を誘発させることができます。次に、熱プローブを用いて局所的に、またはヒートプレートを用いて全体的に幼虫を刺激し、定量的に測定可能な侵害受容反応を誘発させます。熱プローブを用いることで、幼虫の熱に対する侵害受容反応には上限があること、および入力温度と誘発された反応の振幅との間に驚くべき関係があることが示されます。熱プレートアッセイでは、幼虫が周囲の水の温度と侵害受容感覚ニューロンの活性に依存した、定型的な一連の侵害受容行動を示すことが分かります。ここで説明する手法は、有害な熱刺激が局所的に与えられた場合と全体的に与えられた場合で動物の反応が異なるかなど、熱侵害受容分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。一般的に、ヒートプローブアッセイに不慣れな者は、プローブを適用する際の圧力、位置、および角度のばらつきを最小限に抑えるために習熟が必要であるため、困難に直面します。温度上昇に伴って誘発される行動を十分に理解するには、実際に観察することが不可欠であるため、ヒートプレートアッセイの視覚的なデモンストレーションが極めて重要となります。目的の遺伝子型の後代幼虫を十分に得るために、目的のストックを直接育成するか、あるいは20〜30匹の処女雌と15〜20匹の雄を用いて、フライフードを含むボトル内で交配を行います。産卵から5日後、柔らかくなったフライフードをすくい上げ、630 micronの孔径のメッシュを用いて緩やかに流れる水でろ過し、3齢初期の幼虫を回収・洗浄します。飢餓および乾燥を防ぐため、3齢初期の幼虫を少量の湿ったフードの上に移動させます。麻酔チャンバーを作成した後、ピンセットまたは絵筆を使用して、3齢初期の幼虫10匹を蓋の内側に沿ってそっと配置し、蓋を閉めます。ドラフトチャンバー内で、1.5 mLのジエチルエーテルを浸み込ませた脱脂綿を入れた10 mLビーカーが入ったカップリングジャーの中に、麻酔チャンバーを入れます。カップリングジャーのキャップを締め、幼虫を2～2.5分間エーテル蒸気にさらします。麻酔後、Coplanジャーから麻酔室を取り出し、残留したエーテル蒸気が消散するまでフード内で数秒間放置します。水が入った洗浄瓶を用いて、麻酔室から小さなペトリ皿へ幼虫を穏やかに洗い出します。麻酔された幼虫の水分を吸い取り紙で取り除き、3インチ×1インチのガラス製顕微鏡スライドに固定した両面テープの上に、幼虫を背面側が上になるように注意深く貼り付けます。スライドをUV照射チャンバーの底面に置き、20 millijoules per centimeter squaredの強度で6秒間、幼虫にUV光を照射します。照射後、スライドを水に浸し、両面スコッチテープから幼虫をゆっくりと浮かせて剥がします。ピンセットまたは筆を用い、照射した幼虫を15 by 45 millimeterの容器に静かに移します。再宿主化させる前に、1 mLのショウジョウバエ飼料を入れた1ドラムのガラス培養バイアル内で、25 °Cまたは任意の培養温度で8～24時間回復させます。温度侵害受容アッセイでは、まず温度プローブの温度を目的の設定値にプリセットします。筆またはピンセットを使用して、幼虫個体を平らなプラットフォーム上に慎重に移動させ、幼虫が薄い水の膜で覆われていることを確認してください。圧力のばらつきを最小限に抑え、熱プローブの正確な位置と角度を確保するためには、習熟が必要です。プローブの先端を、分節A4の幼虫に対して、プローブと幼虫の表面とのなす角が約45度になるように、軽い圧力をかけてそっと押し当てます。この圧力によって幼虫の表面にわずかな窪みができ、通常はこれで移動を抑制するのに十分な状態となります。逃避反応が示されるか、または22回目のカットオフに達するまで、幼虫への刺激を継続します。反応を示す幼虫は、通常、まず頭部と尾部を持ち上げる予備行動を示し、続いて少なくとも360度回転するという逃避行動を示します。逃避行動が開始されたら、プローブから離し、逃避までの潜時または所要時間を記録します。20秒以内に逃避行動が観察されない場合、その幼虫は非反応者とします。十分な高コントラストの照明が確保されるよう、ファイバーオプティックライトガイドを配置してください。幼虫を観察するには、ヒーティングブロックの平坦な面を上に向けた状態でホットプレートに設置し、その後、ホットプレートを顕微鏡のベース上に配置します。ホットプレートを強設定でオンにし、温度が95 °Cで安定するまで約15分間待ちます。マイクロピペットを用いて、80 µLの蒸留水を量り取り、60 × 15 mmのポリスチレン製ペトリ皿の中央に水滴として滴下します。ピンセットを用いて、清潔な3齢中期の幼虫を、可能な限り余分な水を加えずに、水滴の中央にそっと配置します。シャーレをホットプレート上の固体加熱ブロックにそっと置きます。幼虫全体と水滴が視野に入るよう、速やかにシャーレの位置を調整してください。タイマーを開始します。この時点で、ペトリ皿をホットプレートの固体加熱ブロックの上に置き、各行動の開始時間を記録します。5. 水に浸した幼虫をホットプレートに移すと、定型的な運動行動が観察されます。熱がない状態での正常な行動には、頭部の探索運動を伴うパラソル運動が含まれます。次に、幼虫が頭部を前方または側方に素早く動かすヘッドスラッシュ動作（Head thrash behavior）が発生することがあります。この動作は水中での通常の移動に似ていますが、より不規則で持続的な回転を伴います。幼虫が側方に少なくとも360度完全に回転した際に、この行動であると定義します。これは回数が変動して起こり、時には不完全な回転を伴うことがあります。行動のスコアリングにおいては、360度完全に回転した場合のみをカウントしてください。この行動は、鞭打ち行動（whip behavior）の最中に熱プローブを局所的に適用した際のシーンに最も類似しています。幼虫は前後軸に沿って急速な収縮と弛緩を繰り返す動きを見せ、頭部がごく短時間に尾部に接近します。この「ホイッピング」と呼ばれる動きは、しばしば「ローリング」と同時、あるいは連続して観察されます。最終的に、幼虫は痙攣行動を示し、多くの場合その後に麻痺が続きます。痙攣行動の間、幼虫は前後軸に沿って体を伸ばし、全身に高頻度の震えを見せます。屈曲麻痺を伴わない震え行動は、幼虫が移動を停止した際に発生します。一部の幼虫ではこれが永続的に続きますが、他の個体ではその後、低頻度の脈動的な動きを示します。各カテゴリーに属する反応個体の割合を示すこのプロットでは、幼虫の熱痛覚反応に上限があることがわかります。熱プローブアッセイにおいて、プローブ温度が 52 °C に達するまで、100% の幼虫が迅速な反応を示します。しかしながら、54 °C以上の温度では、20秒間接触させた後でも幼虫の90%以上が反応しません。これらの幼虫は22回目のカットオフ後も動き続けますが、回転数や嫌避的逃避行動に費やされた時間を測定してプロットすることが可能です。驚くべきことに、プローブの入力温度と反応の強さの間には逆相関があるようで、より低い温度の方が回転数が増加する傾向にあります。水に浸した幼虫をヒートプレートに移すと、5つの定型的な運動行動が観察されます。これらの行動が観察される平均潜時と、本稿で提示する最適条件において各潜時で測定された平均水滴温度をここに示します。それぞれの個別の行動を示した幼虫の割合は77%から100%の範囲でしたが、稀にローリングやウィッピング行動が省略されたり、重複したり、あるいは逆の順序で発生したりすることがありました。ヒートプレートアッセイにおいて麻痺行動が開始した後に生存した幼虫の割合をここに示します。幼虫を麻痺するまで加熱し、その後、回復させるために標準的な培養条件に戻しました。模擬処理した幼虫には、熱曝露を除いて同等の処理を施し、生存した成虫におけるPPEの形成を7日目から13日目にかけて定量化しました。ここで、MD G fourは、4つのクラスすべての多樹状突起末梢感覚ニューロンにおいて、UAS制御下のトランスジェンの発現を誘導します。UAS or one delta Cは、シナプス伝達に必要なショウジョウバエのオープンレクティファイアカリウムチャネルの修飾版を発現し、UAS orrc one delta NCは、シナプス伝達を妨げないようさらに修飾された同チャネルのバージョンを発現します。MD GALF 4ドライバーとUAS ORC 1 delta Cトランスジェニックの両方を保持する幼虫のみが、観察された5つの行動のうち4つにおいて潜時が延長することに注意してください。このビデオを視聴することで、有害な熱刺激に対するGEs幼虫の局所的および全身的な反応の両方を測定する方法を十分に理解できたはずです。これらの手順を遺伝学的解析などの他の手法と組み合わせることで、熱受容に必要となる遺伝子を特定することができます。熱プローブアッセイを行う際は、プローブの圧力、位置、接触角度のばらつきを最小限に抑えることが重要であることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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ここで時間と空間で高速かつ正確な温度変化を生成するプログラム可能な温度制御のアリーナを使用して温度変化でショウジョウバエの歩行のパフォーマンスを自動的に決定するためのプロトコルを提案する.

空間と時間の温度変化に対応したショウジョウバエのパフォーマンスを決定する自動化された方法

熱制限は、急速な気候変動に直面した場合に貴重な情報である生物が許容する環境を予測することができます。ここでは、昆虫の重要な熱ミニマと熱ノックダウン時間を評価するためのハイスループットプロトコルを説明します。両方のプロトコルは、スループットを最大化し、アッセイのコストを最小限に抑えます。...

昆虫の臨界熱限界のハイスループットアッセイ

このプロトコルの目的は、 ショウジョウバエ 幼虫の機械的発性の改善アッセイを実行する方法を示すものです。ここでは、ショ ウジョウバエ...

ショウジョウバエ幼虫における機械的な結知を測定するための改善されたアッセイとツール

幼児は口頭での経験を報告できないので、乳児の疼痛の評価と治療が困難です。このビデオでは、乳児神経系からの有害事象に対する反応を測定するために使用できる定量的な電気生理学的手法や分析手法を説明します。...

電気生理学的測定とヒト幼児における痛覚の分析

キイロショウジョウバエでは、世紀の1以上にわたり、多くの重要な生物学的過程の分子および細胞基盤を理解するために使用されている遺伝的に行動的に扱いやすいモデル系である。...

アッセイのメソッドショウジョウバエ行動

学ぶショウジョウバエ幼虫の温痛覚評価法。局所熱プローブと全体的熱プレート刺激により、傷害感受性応答を定量化する手法を解説。神経科学と行動生物学の研究に有用です。

に温痛覚を評価するためのローカルおよびグローバルメソッド

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