に温痛覚を評価するためのローカルおよびグローバルメソッドショウジョウバエ幼虫

次の実験の全体的な目標は、ショウジョウバエの幼虫の熱侵害受容を測定することです。これは、ショウジョウバエの幼虫を収穫して、その後、オプションの第2ステップとして有害な熱刺激にさらすことによって達成されます。次に、幼虫をヒートプローブで局所的にプローブするか、ヒートプレートを使用して全体的にプローブして、定量的に測定できる侵害受容反応を誘発することができます。

この熱プローブは、幼虫が熱に対する侵害受容反応に上限を設けており、入力温度と誘発反応の振幅との間に驚くべき関係があることを明らかにした。ヒートプレートアッセイは、幼虫が周囲の水の温度と侵害受容性感覚ニューロンの活動に依存する侵害受容行動のステレオタイプなシーケンスを示すことを示しています。ここで説明する方法は、局所的または世界的に提示される有害な熱刺激に対して動物が異なる反応を示すかなど、熱侵害受容分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

一般に、ヒートプローブアッセイに不慣れな個人は、アッセイを習得するには、適用されたプローブの圧力、位置、および伝導角度の変動を最小限に抑えるための練習が必要であるため、苦労するでしょう。温度の上昇に伴って誘発される行動は、最もよく評価されるためには見る必要があります。目的の定義された遺伝子型の十分な子孫の幼虫を得るためには、所望の株を直接育てるか、または産卵収穫の5日後に20〜30人の処女の雌と15〜20人の雄を使用してハエの餌を含むボトルに交配を設定し、どろどろしたハエの餌をすくい取り、630ミクロンの細孔サイズのメッシュを介して穏やかに流水で濾すことにより、初期の第3の幼虫をきれいにします。飢餓や乾燥を防ぐための小さくて湿った食品のパッド。

認証チャンバーを構築した後、鉗子または絵筆を使用して、10匹の初期の3番目の幼虫を蓋の内側に沿ってそっと置き、閉じます。ヒュームフードで作業し、1.5ミリリットルのダチルエーテルを浸した綿球を運ぶ10ミリリットルのビーカーが入ったカップリングジャー内に認証チャンバーを配置しました。コプランジャーのキャップをねじ込み、幼虫をエーテルヒュームに2〜2.5分間さらします。

e認証に続いて、Coplanジャーからe認証チャンバーを取り外し、フード内で数秒間待って、残留エーテルの煙が消えるまで待ちます。水噴出ボトルを使用して、認可チャンバーから小さなペトリ皿に幼虫を優しくすすぎます。麻酔をかけた幼虫を拭き取り、次に背側を上にして、3インチ×1インチのガラス顕微鏡スライドに固定した両面スコッチテープのストリップにそっと貼り付けます。

スライドをUV照射チャンバーの底面に置き、幼虫を20ミリジュール/センチメートルの二乗強度で6秒間UV光にさらします。照射後、スライドを水に浸して、両面スコッチテープから幼虫をやさしく浮かせます。鉗子または絵筆を使用して、照射された幼虫を15 x 45ミリメートルにそっと置きます。

1ミリリットルのフライフードを含む1ドラムガラス培養バイアルで、摂氏25度または所望の培養温度で8〜24時間回復してから再保存します。熱侵害受容アッセイの場合、最初にサーマルプローブの温度を目的の設定値にプリセットします。絵筆または鉗子を使用して、個々の幼虫を平らなプラットフォームにそっと移し、幼虫が薄い水の膜で覆われていることを確認します。

圧力の変動を最小限に抑え、熱プローブの正しい位置と角度を確保するために、練習は完璧になります。プローブの先端をセグメントA4で幼虫にそっと押し付け、プローブと幼虫の表面との間に約45度の角度で先端を軽く圧迫します。圧力は幼虫の表面にわずかなくぼみを引き起こすはずであり、通常は移動を防ぐのに十分です。

離脱反応が示されるまで、または22番目のカットオフに達するまで、幼虫を刺激し続けます。応答する幼虫は、通常、最初に頭と尾を持ち上げる予備的な行動を示し、次に少なくとも360度回転する引き込み行動を示します。引き出し動作が開始されたら、プローブとの接触を解除し、引き出しにかかった遅延または時間を記録します。

20秒以内に離脱行動が観察されない場合、幼虫はノンレスポンダーです。光ファイバーライトガイドを配置して、適切な高コントラスト照明があることを確認します。幼虫を見るには、加熱ブロックを平らな面を上にしてヒートプレートに置き、次にヒートプレートを顕微鏡ベースに置きます。

ヒートプレートを高設定にし、温度が摂氏95度で安定するまで約15分間待ちます。80マイクロリットルの蒸留水を測定し、マイクロピペッターを使用して60 x 15ミリメートルのポリスチレン製ペトリ皿の中央に水滴を置きます。鉗子を使用して、きれいな中期の3番目の幼虫を水滴の中央にそっと置き、追加の水をできるだけ少なくします。

ペトリ皿をヒートプレートの固体加熱ブロックにそっと置きます。幼虫全体と水滴が見えるように、皿の位置をすばやく調整します。タイマーを開始します。

この時点で、ペトリ皿はヒートプレートの固体加熱ブロックに置かれ、各動作の開始時間を記録します。5。常同型の機関車の振る舞いは、水に浸された幼虫をヒートプレートに移すと観察されます。熱がない場合の通常の行動には、頭の動きの検索を伴うパラソルの移動が含まれます。

次に、幼虫が頭を前方または横方向に素早く動かすと、ヘッドスラッシュの行動が発生する可能性があります。この動きは、水中での通常の移動運動と似ていますが、よりぎくしゃくと持続的に転がります。行動は、幼虫が少なくとも360度横方向に転がるときに発生します。

これは変動する回数で発生する可能性があり、ロールが不完全である場合もあります。行動を採点する目的では、360度ロールのみをカウントします。この動作は、ホイップ動作中にヒートプローブをローカルで適用するシーンに最も似ています。

幼虫は、頭を尾に非常に短時間近づけるアンティオ後軸に沿った急速な収縮放出運動を示します ホイップは、ローリングと2回または同時にすばやく連続して観察されることがよくあります。最後に、幼虫はしばしば麻痺に続く発作行動を示します。発作行動中、幼虫は内輪後軸に沿って伸び、高頻度の全身を示します。

屈曲麻痺のない揺れ行動は、幼虫が動きを止めたときに発生します 一部の幼虫では、これは永続的ですが、他の幼虫は低周波の脈動運動を示します。このプロットでは、各カテゴリに属する応答者の割合を示しており、幼虫の熱侵害受容反応には上限があります。ヒートプローブアッセイでは、幼虫の100%がプローブ温度52°Cまで高速応答します。

しかし、54°C以上になると、90%以上の幼虫が20秒接触しても反応しなくなります。これらの幼虫は22回目のカットオフ後も動き続けますが、ロールの数や嫌悪離脱行動に費やされた時間も測定してプロットすることができます。驚くべきことに、プローブの入力温度と応答の堅牢性との間には反比例の関係があるようです。温度が低いほどロール数が多くなるようです。

水に浸された幼虫をヒートプレートに移すと、5つの常同的な機関車の挙動が観察されます。これらの挙動が観察される平均待ち時間は、ここに示された最適なアッセイ条件下で各待ち時間について測定された平均水滴温度と同様にここに示されており、それぞれの異なる行動を示す幼虫の割合は77〜100%の範囲であったが、時折、ローリングおよびホイップ動作が省略されたり、重なったり、逆の順序で発生したり、 ヒートプレートアッセイで麻痺行動の開始後に生存した幼虫の割合をここに示しています。幼虫は麻痺するまで加熱され、その後、回復するために標準的な培養条件に移されました。

模擬治療された幼虫は、熱曝露を除いて同等の治療を受け、生存可能な成体におけるPPEの形成は7日目から13日目に定量的でした。ここでは、MD G 4は、多樹状末梢感覚ニューロンの4つのクラスすべてにおいて、UAS調節導入遺伝子の発現を促進します。UASまたはone delta Cは、シナプス伝達に必要なショウジョウバエの開放整流カリウムチャネルの修正版を発現し、UAS orrc one delta NCは、シナプス伝達を妨げない同チャネルのさらなる修正版を発現します。

MD GALF 4ドライバーとUAS ORC 1デルタC導入遺伝子の両方を持つ幼虫のみが、観察された5つの行動のうち4つで遅延の増加を示していることに注意してください。このビデオを見れば、有害な熱刺激に対するGEの内臓幼虫の局所的および全体的な反応を測定する方法について十分に理解できるはずです。これらの手順は、熱侵害受容に必要な遺伝子を特定するための遺伝子分析などの他の方法と組み合わせることができます 熱プローブアッセイを試みる際には、プローブの変動と圧力、位置、接触角を最小限に抑えることを覚えておくことが重要です。