In vitro光毒性アッセイ:肺がん細胞における光増感剤の光毒性の可能性を評価するためのPDTベースの方法

- 光線力学療法またはPDTは、特定の波長の光によって活性化される分子である光増感剤を利用した光療法の一種です。励起された光増感剤は、細胞内に存在する分子状酸素を活性酸素種に変換し、細胞死を引き起こします。アッセイを開始するには、適切な濃度の光増感剤を単独で、または試験薬と組み合わせて、所望のナノ粒子ベースの薬物送達システムを調製します。

このナノ粒子懸濁液の好ましい濃度を肺癌細胞の培養物に加えます。ナノ粒子の細胞内取り込みを促進するために、培養物を暗所で適切な時間インキュベートします。懸濁液を目的の培地と交換します。その後、光線力学療法用ファイバーレーザーを培養物の上に最適な距離で配置し、均一な照明を促進します。細胞を適切な波長で所望の時間に照射し、一晩インキュベートします。

培地を適切な細胞毒性測定溶液と交換します。マイクロプレートリーダーを使用して細胞生存率を測定し、実験的治療の細胞毒性効果を定量化します。光増感剤を含む放射線照射された細胞は、生存率の低下を示します。以下のプロトコールでは、A549肺がん細胞のヒアルロン酸セラミドナノ粒子に内包した光増感剤のヒポクレリンBと抗がん剤のパクリタキセルのin vitro光毒性解析を行います。

- まず、添付のテキストプロトコルに記載されているように、ヒアルロン酸 - セラミドを合成します。3.5キロダルトンの透析膜を使用して製品を精製し、凍結乾燥します。

次に、ヒアルロン酸-セラミドナノ粒子を単独で調製し、ヒアルロン酸-セラミドナノ粒子と光増感剤、ヒアルロン酸-セラミドナノ粒子を抗がん剤と光増感剤で調製します。

肺がん細胞株A549を24ウェル細胞培養プレートのウェルに、1ウェルあたり10の1倍から5番目の細胞の密度で播種し、細胞を24時間インキュベートします。翌日、培地を取り出し、1ミリリットルのPBSで細胞を洗浄します。

次に、調製したナノ粒子をPBSに溶解し、ボルテックスにより、光増感剤であるヒポクレリンBの最終濃度を1ミリリットルあたり2マイクロモルにします。

それぞれ4つのウェルに、PBS1ミリリットル、空のヒアルロン酸セラミドナノ粒子1ミリリットル、光増感剤を含むナノ粒子1ミリリットル、光増感剤と抗がん剤の両方を含むナノ粒子1ミリリットルを追加します。

終了したら、プレートを覆い、暗所で摂氏37度で4時間インキュベートして、ナノ粒子が細胞に取り込まれるようにします。次に、すべての溶液を取り除き、1ミリリットルの冷たいPBSを追加して細胞を洗浄します。

洗浄手順をもう一度繰り返してから、新しい培地を追加します。次に、24ウェル培養プレートを光線力学療法用ファイバーの下に置き、ファイバーを最初のウェルから1cmの位置に配置します。

- 光線力学療法のファイバーから細胞までの距離は、この研究の重要な要因でした。細胞全体を光でカバーできる最適な距離を見つけることが重要でした。

- 次に、安全メガネをかけてライトを消します。暗闇でレーザーで細胞を5〜40秒間照らし、光増感剤を含むナノ粒子中の反応性の高い一重項酸素およびその他のフリーラジカルを活性化します。

光に曝露した後、細胞を暗所で24時間インキュベートします。次に、培地を吸引し、1ミリリットルの冷たいPBSで細胞を洗浄します。洗浄ステップをもう一度繰り返してから、各ウェルに100マイクロリットルの培地と10マイクロリットルの細胞毒性測定溶液を追加します。

溶液中で暗所で2時間細胞をインキュベートし、その後、すべてのサンプルを96ウェルプレートに移します。マイクロプレートリーダーを使用して450ナノメートルの吸光度を測定します。