Name: 突起力顕微鏡: 細胞突起が開発した力を定量化する方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 学ぶ突起力顕微鏡法でポドソームが及ぼす細胞突起力を定量化する方法。薄膜変形を原子間力顕微鏡で計測し、独自の力学モデルで力に換算します。細胞接着メカニズムの理解に貢献します。

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著者は、ビデオ撮影と編集の初期活動をこの仕事とマチュー ・ サンチェスとフランソワーズ Viala アンナ Labernadie、ギヨーム ・ Charrière、パトリック ・ Delobelle に感謝しています。この作業は、l ' アジャンス ナシオナル デ ラ凝った (ANR14-CE11-0020-02)、ラ財団注ぐラ凝った Médicale (FRM DEQ2016 0334894)、INSERM 計画がん、財団トゥールーズがんや人間科学フロンティア (RGP0035/2016) によってサポートされています。

1. ホルムバール コーティング グリッドの準備
<ol><li>純粋なアセトンで電子顕微鏡グリッドをきれいしてろ紙に乾燥させる.純粋なエタノールと顕微鏡スライドをきれい、レンズ ペーパーで拭くし、ブロワーでほこりを取り除きます。</li>
	<li>ホルムバールの下の部分でのソリューションを含むフィルム キャスト装置の漏斗にエタノール洗浄ガラス スライドを垂直方向に配置します。漏斗の上をカバーしてください。</li>
	<li>レベルがスライドの 3 分の 2 に達するまでホルムバール溶液 (二塩化エチレンは 0.5%) 100 mL アトマイザー電球が付いているポンプします。</li>
	<li>1 分のためのソリューションにスライドをしてください。</li>
	<li>安定パラレルテク ホルムバール ソリューションを排出する装置のバルブを開きます。10 15 mL/秒の流量が 30-80 nm のホルムバール フィルムを得られます。フィルムの厚さは、ホルムバール溶液の濃度によって、排水速度によって決まります。 注: バルブをゆっくり開いて、圧力を介して空気弁で排水率を制御できます。排水をより速くより厚いフィルム。実習でホルムバール流量から膜厚を予測することは困難だから我々 ホルムバール映画のいくつかのバッチを準備し、AFM による厚さを制御 (手順 2 を参照)。</li>
	<li>商工会議所からスライドを削除し、繊細な任意の液体ホルムバールを削除するろ紙上で乾燥させます。</li>
	<li>かみそりの刃を持つホルムバール フィルムから 20 mm × 50 mm の四角形をカットします。</li>
	<li>クリーンの蒸留水をビーカーを記入し、ゆっくりと映画をオフにフロートするために水に垂直方向にスライドを突入: フィルムは水面に浮かぶべきであります。</li>
	<li>光沢のあるフィルム上のグリッドを場所乾燥アセトン洗浄が立ち向かいます。</li>
	<li>グリッドのいくつかの上に丸いガラス coverslip (Ø 12 mm) を配置します。この coverslip の膜厚を測定するのに役立つでしょう (手順 2 を参照)。</li>
	<li>それに合うようにサイズ変更された白いステッカーで顕微鏡スライドをカバーします。映画全体がスライドに準拠してまでフローティング ホルムバール フィルムの境界線に垂直方向にスライドを浸しなさい。ろ紙をスライドから余分な水分を削除して、それは室温で一晩乾燥させてください。</li>
</ol>2. 膜厚の測定
<ol><li>ピンセットでスライドからそれをデタッチする、coverslip の周りホルムバールをカットします。</li>
	<li>ペンで、coverslip の下のグリッドの位置をマークします。</li>
	<li>Coverslip からデタッチするマーク グリッドの周りホルムバールをカットします。したがって、穴残りホルムバール シートで、膜厚を測定することができます。PBS の coverslip をカバーし、顕微鏡のスライド ガラスの上に置きます。</li>
	<li>ゴールデン ストライプ春の先端に表示されないかどうかを確かめて、原子間力顕微鏡ガラス ブロックのシリコン窒化カンチレバーをマウントします。 注: 感度とカンチレバーのばね定数する必要があります以前較正されて PBS で。</li>
	<li>AFM モジュール上にガラス ブロックをマウントし、顕微鏡の上にモジュールを配置します。</li>
	<li>観測室ホルムバール コーティング coverslip を置き、500 μ L の PBS でそれをカバーします。</li>
	<li>コンタクト モードと 0.5 nN の力セット ポイントで原子間力顕微鏡を用いたホルムバール シートの穴の境界線をスキャンします。</li>
	<li>高さ測定の参照としてガラス coverslip 表面を使用し、断面の高さとホルムバール厚を評価 (実行ホルムバール バッチごとの少なくとも 10 測定)。</li>
</ol>3. グリッド上のセルのシード
<ol><li>無菌フードの下で上、両面粘着テープのストリップ (12 mm × 3 mm) を配置します。</li>
	<li>ホルムバール コーティング グリッドをピンセットで切り取って逆さまに接着剤ストリップ (グリッドの縁のみがテープに接続する必要があります)。ホルムバール フィルムは、coverslip に直面する必要があります。</li>
	<li>まあ文化にこのデバイスを置きます。</li>
	<li>ひと単球16から区別される 10 の4大食細胞を含む FCS なし RPMI の 10 μ L の液滴を配置します。 注: を確認ホルムバール コーティングの損傷を防ぐためにピペット チップでグリッドに触れないようにします。</li>
	<li>(37 ° C、5% CO2) 細胞付着させる 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>2 ml の 10% の FCS を含む RPMI の井戸を埋めます。</li>
	<li>細胞の AFM 観察する前に付着する CO2を 5% と 37 ° C で 2 時間デバイスを孵化させなさい。</li>
</ol>4 Podosome 誘起変形の地形計測
<ol><li>ガラス底ペトリ皿に倍増した両面粘着テープの 2 つのストリップを固執します。 2 つのストリップ間の距離はグリッドの直径よりも小さくなる必要があります。</li>
	<li>慎重に粘着テープからマクロファージとメッキ グリッドをデタッチします。</li>
	<li>裏返して、グリッド セルをガラスに直面するために、2 つの接着剤のストリップ間グリッドを固執します。</li>
	<li>2 つのグリッドは、新しい倍増両面接着剤のストリップ修正: AFM チップにアクセス可能なグリッドの中央の領域を残して 2 つの接着剤ストリップしたがってサンドイッチされ、グリッド。 グリッドが固定もあり、ねじれていない; 注: を確認します。そうでなければ AFM カンチレバーはホルムバール表面に近づくことができるかもしれない。</li>
	<li>10 mM HEPES (pH 7.4) を添加した予熱の 37 ° C 培養液 (10 %fcs と RPMI) 2 mL をシャーレをご記入ください。</li>
	<li>37 ° C 皿ヒーターに培養皿を置きます。</li>
	<li>原子間力顕微鏡ステージ上皿ヒーターをインストールします。</li>
	<li>37 ° C で安定化システムします。</li>
	<li>0.5 nN の力で接触モード エキスタチンを検索する最初のグローバル イメージを作成し、ホルムバール地形 3 Hz で約 20 nm 大ピクセルします。 メモ: は、グリッドの端近くをスキャンしないでください。</li>
</ol>

<ol><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+Homeostasis+and+the+Malignant+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
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</ol>

利害の対立が宣言されていません。

材料特性
ホルムバール、私たちのケースで、変形可能な膜材料の選択は、いくつかの要件を満たす必要があります。材料必要がある可視光線を通す、明視野と蛍光顕微鏡で観察できるように限られた自己蛍光を展示します。薄膜の粗さは、10 をかなり下回っている必要があります nm 細胞接着に対する任意の地形の影響を避けるために、AFM イメージングによる細胞突起のクリアな観察を許可します。最後に、膜のヤング率と材料の厚さに依存する剛性が podosome サイトで発生する典型的な応力のいくつかの観察可能な変形性能を維持しながらエキスタチンの形成を誘導するのに十分高いする必要があります。周りが 10-100 kPa。ホルムバール素材、30-80 nm の薄膜の準備は、これらすべての制約との間の良い妥協点です。ホルムバール膜の厚さを調整することにより、剛性をエキスタチン7の力覚の特性を研究し調整できることに気づいて価値があります。
再現性とホルムバール...

動物細胞は、物理的に行列とその環境1を構成する他の細胞と対話します。これは、移行、体を内面化、外部情報を取得を区別するために必要です。このようなプロセスでセルは機械力を生成する必要がある、その生物学的挙動、例えば増殖の監督と近年多くの研究が示している、力を生成し、その環境をプローブする細胞の能力の影響か分化2,3。ターンでは、細胞の力の測定は力生成の規制を勉強し、細胞行動と組織の運命4,5にその意義を理解する主要な援助です。
近年では、その環境では6セルを出せる力を測定する多数の技術の開発を目撃しました。これらの大半は牽引力細胞出す携帯電話プローブまたは変形可能な基板をはめると、明らかに尽力されています。しかし、細胞外の環境に突起に関連する機械的な力測定技術の不足に苦しむ、日でなく特徴にしています。
この制限を克服するためには基板に直交に加わる力を測定する手法を提案します。それは細胞細胞基質の変形を測定し、軍の関与を推測することが可能となって、直交方向に変形することができます薄い弾性シートをめっきで構成されます。基板形状、原子間力顕微鏡によるナノスケールの分解能で測定し、変形から力の評価は、前方の細胞構造7,8,の幾何学の知識に依存しています9。
ここでは、セットアップとエキスタチン、三次元環境10、11、間葉系移行の大食細胞によって形成される前方接着構造によって生成された力を測定への応用について述べる 12,13,14,15,16,17。この手法が力の発生とその突起を含む多くの細胞プロセス制御の理解を進めると考えています。

<table><tbody><tr><td>200メッシュニッケルグリッド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>G200-Ni</td><td></td></tr><tr><td>濾紙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10235612</td><td></td></tr><tr><td>白いステッカー 26 x 70 mm</td><td>エイブリー</td><td>DP033-100</td><td></td></tr><tr><td>出口にバルブを備えたフィルム鋳造装置</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>71305-01</td><td></td></tr><tr><td>かみそり刃</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWR</td><td>1.08543.0250</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>VWR</td><td>20066.321</td><td></td></tr><tr><td>二塩化エチレンの Formvar 0.5% 溶液</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15820</td><td></td></tr><tr><td>12 mm カバースリップ</td><td>VWR</td><td>631-0666</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr>原子<tr><td>間力顕微鏡</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard III</td><td></td></tr><tr><td>温度制御サンプルホルダー&nbsp;</td><td>JPKインスツルメンツ</td><td>バイオセル バイオセル</td><td></td></tr><tr><td>窒化ケイ素カンチレバー、公称スプリング定数 N/m</td><td>Veecoインスツルメンツ</td><td>MLCT-AUHW</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>両面粘着テープ</td><td>APLI AGIPA</td><td>118100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>35 mmガラス底ペトリ皿</td><td>WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr></tbody></table>

突起力顕微鏡: 細胞突起が開発した力を定量化する方法

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

多数の生物学的文脈で動物細胞を機械的な力を開発することによって、環境物理的にやり取りする必要があります。これらのうち、牽引力はよ特徴付けられた、されているが、基板に直交細胞突起力測定技術の不足があります。付着性のセルの基板上で突出力を測定する実験装置を考案しました。準拠ホルムバール シート メッキ細胞変形この基板、ナノメートル スケールでの原子間力顕微鏡 (AFM) によって生成された地形にマップされます。フォース値は、前方の細胞構造の幾何学に基づく変形分布の解析から、抽出されます。したがって、時間の経過とともに細胞の個々 の突出の単位によって力を測定できます。この手法は、力の発生とその突起を含む多くの細胞プロセス制御の研究を有効になります。ここでは、その人間の大食細胞によって形成されるエキスタチンによって生成された前方力を測定への応用について述べる.

上記のプロトコルでは、マクロファージ エキスタチン ホルムバール基板上で前突荷重を定量化する実験のセットアップを準備する方法について説明します。これは原子間力顕微鏡を使って実現されますが、図 1に示します。
エキスタチン JPK データ処理ソフトウェアを使用しての下の膨らみの地形イメージを分析する場合、3 次多項式適合は各スキャン ラインから独立して減算する必要があります。Podosome 誘起バンプの高さの最大値は、画像の側に z カラー スケールを追加することによって評価できます。TIFF 形式でエクスポートされた後、三次元地形画像では専用自家製 ImageJ マクロ利用可能なオンライン8を使用してをさらに解析します。このマクロは修正された高さイメージ上の膨らみが決まりし、力マップ (図 2</str...

ここでは、エキスタチン適用対応フィルム地形画像の自動解析するフィルムの調製から突出力を評価するために使用する実験手法を詳しく説明します。

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

この手順の全体的な目標は、原子間力顕微鏡を使用して突起力を定量化することです。これは、最初にフォーミュラコーティングされたグリッドを準備し、このフィルムの厚さを測定することによって達成されます。このプロセスの3番目のステップは、グリッド上にセルを座らせ、それらを接着させるというものです。手順の最後のステップは、原子間力顕微鏡を使用して細胞の下のフォーマフィルムをイメージングすることです。マイクロファージは、基質に付着すると、ポドソームと呼ばれるサブミクロの接着構造を形成します。最終的に、ポドソームが使用するフィルムの変形は定量化され、自家製の機械モデルを使用して力に変換されます。エタノールクリーンガラスライトを漏斗フィルムキャスティング装置に置き、漏斗の上部を覆います。fomvar溶液を漏斗にパンアップして、レベルがスライドの3分の2に達するまでパンします。1分間そのままにしてから、formvar溶液を安定した流れで排出します。フィルムの厚さは、流量と形態溶液の濃度の両方に依存することに注意してください。この光を暗く軽くたたいて乾かし、鋭利なかみそりの刃で長方形を切り取ります。蒸留水を入れたビーカーにスライドを浸し、fomvarフィルムが水面に浮くようにします。アセトンのきれいなグリッドをフィルムに慎重に置き、光沢のある面を上にして、一部のフィルムの上に直径12ミリメートルのカバースリップを取り付けます。これらは、厚さ評価実験に使用されます。最後に、ステッカーで覆われたスライドを浸して、フィルムとグリッド全体を復元します。ガラスで覆われたスリップの輪郭をピンセットで囲み、フォームバーをカットしてスライドから取り外します。グリッドの位置を覆われたスリップの下に取り付け、ピンセットでグリッドの輪郭を描き、引き抜きます。このようにして作成されたfomvarフィルムの穴は、その厚さを測定するために画像化されます。硝酸ケイ素をAFMガラスブロックに取り付けて、金色のストライプがスプリングの先端の下にないことを確認します。ガラスブロックをAFMモジュールに取り付け、AFMモジュールを顕微鏡ステージに置きます。fomvarコーティングされたカバースリップを観察チャンバーに置き、PBSを上にします。接触モードで、0.5ナノニュートンポイントでfomvarとガラスの境界をスキャンします。データ処理ソフトウェアでは、ガラス表面を高さの基準として使用し、断面上のfomvarの厚さを測定します。滅菌フードの下で、12ミリメートルのカバースリップを選び、穴の裏側テープのストリップを貼り付けます。ピンセットでfomavrコーティングされたグリッドの輪郭を描き、光沢のある面を上にして置き、側面のみが接着剤に付着するようにします。これは、テープからグリッドを取り外すときにfomvarが破れ

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Biology

生物学

GFP -アクチンを発現するライブ内皮細胞におけるアクチン細胞骨格の研究

本論文では、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて、microindentationにより、生きた細胞の機械的性質を特徴づけるためのプロトコルを示しています。...

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

このプロトコルでは生きている細胞の核に直接制御力を適用するマイクロ...

核と細胞骨格との間の機械的統合を測定するための直接力プローブ

ここでは、ギャップ接合コネクシン43を破壊する力学ベースのプロトコルを提示し、トラクションと細胞間応力の観察を通じて内皮バイオメカニクスに及ぼすその後の影響を測定する。...

コネクシン43構造破壊による内皮バイオメカニクスの摂動

このプロトコルは、ポリ(エチレングリコール)ベースのヒドロゲルに埋め込まれた蛍光線マーカーの3次元配列を製造するための多光子リソグラフィーを実装するための指示を提供し、参照フリー、トラクション力顕微鏡として使用します。プラットフォーム。これらの指示を使用して、3D材料ひずみの測定および細胞牽引の計算は高スループット牽引力の測定を促進するために簡単にされる。...

リファレンスフリートラクションフォース顕微鏡プラットフォームの製造と実装

ここでは、B細胞に対する牽引力顕微鏡実験を行うために用いられるプロトコルを提示する。柔らかいポリアクリルアミドゲルの調製とその機能化、顕微鏡でのデータ取得、データ分析の概要について述べています。...

Bリンパ球活性化を研究するための牽引力顕微鏡

ここでは、光学トラップによる直接力測定を用いて、3次元閉じ込めで単離した胚ゼブラフィッシュ細胞の細胞内の機械的特性を調べるプロトコルを提示する。...

光ピンセットを用いた閉じ込めにおける細胞下力学の直接力測定

細胞信号を分析する統合ツールキット(iTACS)プラットフォームは、接着細胞内の多種多様な化学および機械的信号を同時に測定するプロセスを自動化します。iTACSは、コミュニティ主導の開発を容易にし、研究者が学歴に関係なくすべてのプラットフォーム機能を使用できるように設計されています。...

細胞信号を解析する統合ツールキット:力、運動、形態、蛍光

このプロトコルは、広がる細胞の端にある突起の動的パラメータ(突起、収縮、フリル)を測定することを目的としています。...

生細胞顕微鏡による拡散時の細胞端突出ダイナミクスの測定

前進するためには、成長コーンは外部環境に対して牽引力を発揮しなければならない。牽引力の生成はアクチンの動態およびクラッチの結合に依存する。本研究では、成長コーンアドバンスのためのアクチンダイナミクス、クラッチカップリングおよび牽引力を分析する方法について説明する。...

アクチンダイナミクス、クラッチカップリング、成長コーンアドバンスの牽引力の解析

我々は、軟質ヒドロゲル上の細胞外マトリックスタンパク質のドットアレイの単一の減法パターニングステップによるマイクロコンタクト印刷に基づく、細胞牽引力を測定するための標準的な方法の改善を説明する。この方法は、細胞クラスター形状を制御するために不可欠な島パターンのより簡単でより一貫した作製を可能にする。...

マイクロパターントラクション顕微鏡のパターン生成

学ぶ突起力顕微鏡法でポドソームが及ぼす細胞突起力を定量化する方法。薄膜変形を原子間力顕微鏡で計測し、独自の力学モデルで力に換算します。細胞接着メカニズムの理解に貢献します。

突起力顕微鏡: 細胞突起が開発した力を定量化する方法

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