突起力顕微鏡: 細胞突起が開発した力を定量化する方法

この手順の全体的な目標は、原子間力顕微鏡を使用して突起力を定量化することです。これは、最初にフォーミュラコーティングされたグリッドを準備し、このフィルムの厚さを測定することによって達成されます。このプロセスの3番目のステップは、グリッド上にセルを座らせ、それらを接着させるというものです。

手順の最後のステップは、原子間力顕微鏡を使用して細胞の下のフォーマフィルムをイメージングすることです。マイクロファージは、基質に付着すると、ポドソームと呼ばれるサブミクロの接着構造を形成します。最終的に、ポドソームが使用するフィルムの変形は定量化され、自家製の機械モデルを使用して力に変換されます。

エタノールクリーンガラスライトを漏斗フィルムキャスティング装置に置き、漏斗の上部を覆います。fomvar溶液を漏斗にパンアップして、レベルがスライドの3分の2に達するまでパンします。1分間そのままにしてから、formvar溶液を安定した流れで排出します。

フィルムの厚さは、流量と形態溶液の濃度の両方に依存することに注意してください。この光を暗く軽くたたいて乾かし、鋭利なかみそりの刃で長方形を切り取ります。蒸留水を入れたビーカーにスライドを浸し、fomvarフィルムが水面に浮くようにします。

アセトンのきれいなグリッドをフィルムに慎重に置き、光沢のある面を上にして、一部のフィルムの上に直径12ミリメートルのカバースリップを取り付けます。これらは、厚さ評価実験に使用されます。最後に、ステッカーで覆われたスライドを浸して、フィルムとグリッド全体を復元します。

ガラスで覆われたスリップの輪郭をピンセットで囲み、フォームバーをカットしてスライドから取り外します。グリッドの位置を覆われたスリップの下に取り付け、ピンセットでグリッドの輪郭を描き、引き抜きます。このようにして作成されたfomvarフィルムの穴は、その厚さを測定するために画像化されます。

硝酸ケイ素をAFMガラスブロックに取り付けて、金色のストライプがスプリングの先端の下にないことを確認します。ガラスブロックをAFMモジュールに取り付け、AFMモジュールを顕微鏡ステージに置きます。fomvarコーティングされたカバースリップを観察チャンバーに置き、PBSを上にします。

接触モードで、0.5ナノニュートンポイントでfomvarとガラスの境界をスキャンします。データ処理ソフトウェアでは、ガラス表面を高さの基準として使用し、断面上のfomvarの厚さを測定します。滅菌フードの下で、12ミリメートルのカバースリップを選び、穴の裏側テープのストリップを貼り付けます。

ピンセットでfomavrコーティングされたグリッドの輪郭を描き、光沢のある面を上にして置き、側面のみが接着剤に付着するようにします。これは、テープからグリッドを取り外すときにfomvarが破れるのを防ぐためです。カバーストリップを滅菌済みの6ウェルプレートに入れ、10mmの液滴の無血清培地にパイプで入れます。

それは約10,000個の細胞を含むべきであり、この場合、これらはヒト単球から分化したマイクロファージです。fomvarコーティングを傷つけないように、その過程でパイパーチップでグリッドに触れないように注意してください。細胞を接着させるために30分間インキュベートし、次にウェルに血清添加培地を充填し、AFM観察の前に再度2時間インキュベートします。

ガラス底のペトリ皿に両面テープの平行なストリップを2つ置き、それらの間の幅がグリッドの直径に比べてわずかに小さいことを確認します。次に、以前にセルを播種したグリッドを取り外し、セルを下に向けて 2 つのテープ ストリップの上に置きます。グリッドを固定するには、前のストリップの上に他の2つのストリップを配置します。

予熱した培地にヘペを補充した培養液を皿に入れます。以前に摂氏37度に設定したディッシュヒーターに皿を置きます。セットをAFMステージに取り付けます。

システム温度が摂氏37度で安定している場合は、接触モードで実行する必要があるfomvar表面のスキャンに進みます。これは、0.95ナノニュートンの設定値を使用して、たわみデータビューウィンドウで原生動物に関連する変形を視覚的に確認します。ここでは、AFMでフォーメーションをグラフィカルな測定にするための代表的な結果と処理手順を示します。この画像でわかるように、fomvar 表面の膨らみが検出されています。

この写真情報を力の値に変換するためには、まず局所的な高い差にアクセスできる必要があります。これを行うには、3次多項式近似をそのスキャンラインに個別に減算する必要があります。次に、自家製の専用画像アルゴリズムを使用して、AFM高さマップから原生動物媒介突起の機械的モデルから突起力の値を評価できます。

この手順のおかげで、原虫の突起力発生に関与するメカニズムを調べることができます。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に幸運を祈ります。