Name: EDU信号増幅による個別細胞におけるミトコンドリアDNAの複製の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-15T17:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 学ぶEDU信号増幅を用いた培養神経細胞におけるミトコンドリアDNA複製の可視化手法。この方法により、神経細胞のサブ細胞小器官におけるmtDNA動態を詳細に解析し、ミトコンドリア関連神経疾患の病態理解に貢献する。

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この作品は、健康補助NS - 38849と糖尿病の合併症の研究のためのDK - 076160、少年糖尿病研究財団センター、神経学研究と発見とでA.アルフレッドトーブマン医学研究所のプログラムの国立研究所によってサポートされていましたミシガン大学。この作品は、形態と糖尿病および消化器腎臓病研究所から健康グラント5P60 DK - 20572の国民の協会によって資金を供給ミシガン糖尿病研究研修センター、の画像解析のコアを使用。著者は様々な彼の貴重なアドバイスのための分子プローブ/ InvitrogenからスコットT.クラークに感謝をクリックして、それがEDUの増幅技術の初期の開発を支援するためのキットや試薬の寛大な寄付をラベリングEDU。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は、EDUのチラミド信号増幅を使用して、個々の細胞内で新しく合成されたミトコンドリアDNAを標識するために感度の高いアッセイを開発した。このプロトコルの最適化中の最大の問題の1つは、カバーグラスの間に一貫性のない結果だった。変更は、個々のカバーガラス上で少量を混合し、すべてのカバーガラスに使用するマスターソリューションを避けるためにインビトロジェンのキットのプロトコールに行われました。各12ミリメートルの円形のガラスカバースリップのために使用される75から80μLのサンプル間で一貫性のある結果を得るために十分なソリューションを提供しながら、完全に表面の面積をカバーする理想的なボリュームです。インキュベーション時間と試薬の濃度が最適化されたが、改善は、それらの調整と見られるかもしれません。 プロトコルは、一度、各プロセスを実行するように設計されています。しかし、ステップのいくつかは最初の試みの後に失敗したサンプルを回収する新しいソリューションで繰り返されてきた。特に、EDUのクリック反応のステップ（3.4から3.6）は、バックグラウンドの蛍光が大幅に増加することなく繰り返されてきた。抗オレゴングリーン- HRP抗体のインキュベーション（4.1から4.3）とチラミド増幅（4.4〜4.5）の手順では、また繰り返されて、しかし、増加するため、バックグラウンド蛍光の雑音比と劣悪な信号でより頻繁に結果している。 最も敏感な試薬は、Click - IT EDUマイクロプレートアッセイキットからクリックして- IT EDUバッファ添加物（成分G）とウサギ抗オレゴングリーン- HRP抗体（成分I）です。 4℃で保存されていると6-12ヶ月の間にかなり暗くするときにクリックして- IT EDUバッファの添加剤は、徐々に黄色に変わります。 -20℃でクリックして- IT EDUバッファの添加剤の保管は、Cは、この問題を軽減します。ラベリングとチラミド増幅ステップは、ウサギ抗オレゴングリーン- HRP抗体をミリQのdH 2 Oにそれを再構成するの4-6ヶ月以内に使用されているときに最高の仕事 mtDNAのEDUの軽度のラベリングは、追加の細胞マーカー9月11日との直接比較が可能で、そのような過酷な治療が回復するために必要な5 -ブロモ-2 -デオキシウリジン（BrdU）、などの他のチミジン類似体以上この手法の有用性を、強化さDNA内のそのエピトープ。当研究室で11月12日 、他は13から15を正常ミトコンドリアDNAを標識するためにBrdUを使用している。 BrdU標識法は、EDUのために使用されるものと似ていますが、いくつか重要な違い（図5）があります。 （3.1から3.2まで）上記の透過化工程の後に、BrdUをエピトープが変性ステップ（37℃で30分間2 N塩酸° Cの1X PBSで3回洗浄が続く）で回収される。 BrdUのはその後のBrdUに対する一次抗体で標識されている（ベクターラボラトリーズは、TSAキットから1％ブロッキング液で1:50に希釈し、4℃で一晩インキュベート）。二次抗体のステップの前に（ヤギ抗マウスIgG 1パーセントブロッキング溶液で1:100に希釈しTSAキット＃2と＃5、からHRPにコンジュゲートと、室温で45分間インキュベート）のBrdU信号を増幅するために必要ですTSAの手順（上記4.3から4.5）。ラベルのミトコンドリアDNAに2つのチミジン類似体、EDUとBrdUを、持つことのmtDNAを順次パルスラベリングのパラダイム11で標識することができるデュアルラベル実験を行うために有利で ​​ある。 当研究室では、糖尿病性神経障害、糖尿病の一般的な合併症の文脈におけるミトコンドリア生合成の調節を検討するEDUとミトコンドリアDNAのBrdU標識を使用しています。私たちは正常に個々のニューロン11-12のミトコンドリアDNA生合成の変化を測定するために信号増幅を使用している。この手法は、mtDNAの複製と売上高のかミトコンドリアDNAの合成を阻害する薬剤を識別するためのメカニズムを探求するように設計された他の実験で有用であろう。さらに、EDUとBrdU信号を増幅の基本原理は、他​​の研究でその小節のDNA複製や修復に適用することができる。

<table><tbody><tr><td>12 mm カバーガラス</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>245 mm x 245 mm BioAssay ディッシュ</td><td>Corning</td><td>431111</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Fisher Scientific</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10倍溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399</td><td></td></tr><tr><td>転送ピペット</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素水 (30%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2633</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU マイクロプレートアッセイキット</td><td>Invitrogen</td><td>C10214</td><td></td></tr><tr><td>TSA キット #12 (HRP&amp;#8212;ヤギ抗ウサギ IgG および Alexa Fluor 488 チラミド含有)</td><td>Invitrogen</td><td>T20922</td><td></td></tr><tr><td>TSA キット #15 (HRP&amp;#8211;ヤギ抗ウサギ IgG および Alexa Fluor 594 チラミド含有)</td><td>Invitrogen</td><td>T20925</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 含有 ProLong Gold 退色防止剤</td><td>Invitrogen</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>ポリクローナルウサギ抗ニューロフィラメント抗体</td><td>Chemicon International</td><td>AB1981</td><td></td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗 BrdU 抗体</td><td>Vector Laboratories</td><td>VP-B209</td><td></td></tr><tr><td>TSA キット #2 (HRP&amp;#8212;ヤギ抗マウス IgG および Alexa Fluor 488 チラミド含有)</td><td>Invitrogen</td><td>T20912</td><td></td></tr><tr><td>TSA キット #5 (HRP&amp;#8212;ヤギ抗マウス IgG および Alexa Fluor 594 チラミド含有)</td><td>Invitrogen</td><td>T20915</td><td></td></tr></tbody></table>

edu信号増幅による個別細胞におけるミトコンドリアdnaの複製の可視化

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

ミトコンドリア細胞のエネルギーとミトコンドリアの生合成の重要な調節因子は1-3健康な細胞のミトコンドリア数を調節するのに不可欠なコンポーネントですがあります。ミトコンドリア発生を監視するための一つのアプローチは、ミトコンドリアDNA（mtDNA）の複製4の速度を測定することです。我々は、ミトコンドリアDNAの生合成を研究するために、個々の細胞で新たに合成されたミトコンドリアDNAを標識するために感度の高い手法を開発した。テクニックは、ニューロンの細胞内コンパートメント内にミトコンドリアDNAの複製を視覚化するチラミドシグナル増幅（TSA）8プロトコル5-7 5 -エチニル-2&#39; -デオキシウリジン（EDU）の混入を兼ね備えています。 EDU 5-7をラベル付けするために最初のクリックの反応がBrdUのエピトープを露出させるために必要とされるその過酷な酸処理または酵素消化を必要としないため、EDUは、例えば5 -ブロモ-2 -デオキシウリジン（BrdU）のような他のチミジン類似体よりも優れている。 EDUの穏やかなラベリングは、他の細胞のマーカー90から10と、その設立の直接比較が可能になります。ミトコンドリアDNAの生合成を可視化し定量化する能力は、ミトコンドリアの生合成を調節するために、薬剤の毒性、老化、がんや神経変性疾患に関連付けられている病因への洞察を提供する使用されるメカニズムを調査するための不可欠なツールを提供しています。私たちの技術は、感覚神経だけでなく、他のタイプの細胞に適用可能です。ミトコンドリアDNAの生合成を測定するためにこのテクニックの使用は、両方とも正常な細胞生理学だけでなく、障害者の疾病状態の理解をすすめるための重要な意味を持っている。

我々は、ミトコンドリアDNAの生合成を研究するために、個々の細胞内で新しく合成されたミトコンドリアDNA（mtDNA）を標識するために感度の高い手法を開発した。テクニックは、ニューロンの細胞内コンパートメント内にミトコンドリアDNAの複製を視覚化するチラミドシグナル増幅（TSA）プロトコルと一緒にEDUの取り込みを兼ね備えています。

EDU信号増幅による個別細胞におけるミトコンドリアDNAの複製の可視化

ミトコンドリアは細胞エネルギーの主要な調節因子であり、ミトコンドリア生合成は、健康な状態におけるミトコンドリア数を調節するための不可欠な要素である。

本手順の目的は、培養ニューロンにおけるmtDNA複製を標識し、可視化することです。まず、ニューロンをチミジンアナログであるEDUとともに2〜24時間インキュベートします。次に、銅触媒による共有結合反応を用いて、アルキンを含むEDUを蛍光色素Oregon Green 488 azideで標識します。手順の最終ステップは、新たに合成されたMT DNAに取り込まれたEDUを可視化するために、アラミド信号増幅ステップを用いてオルゴン 그린信号を増幅させることです。最終的に、クリック EDU 化学とそれに続くティアマインド信号増幅を組み合わせることで、ニューロンの特定の細胞内区画におけるMT DNA複製を示す結果を得ることができます。BRDU ラベリングなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、EDU ラベリングの方がより簡便かつ低刺激であり、ニューロンマーカーの追加の免疫蛍光染色が可能である点にあります。本手法は、細胞体、軸索、樹状突起、およびシナプス末端を含むサブセルラーコンパートメントにおいて、ニューロンが変化するエネルギー負荷にどのように対応しているかなど、ミトコンドリア数の調節に関する重要な問いに答えることができます。したがって、本手法は、ニューロパチーや神経変性を含む、ミトコンドリアを基盤とする多くの神経疾患の病態生理の根底にあるメカニズムへの洞察を提供できます。さらに重要なことに、薬物毒性、がん、老化など、ミトコンドリアDNAコピー数の変化が疾患状態の病態生理の根底にあると考えられる他の系にも適用可能です。このビデオでは、滅菌済みの12 mmガラスカバースリップ上で培養した後根神経節ニューロンにおいて、新たに合成されたミトコンドリアDNA（略称：M-T-D-N-A）をラベルする方法を実演します。24ウェル培養プレート内で、Click-iT EDU Microplate assay kitに含まれる10 mM 5-エチニル-2'-デオキシウリジン（略称：EDU）ストック溶液を、培養培地で1対100に希釈して10X EDUストック溶液を調製します。次に、この10X EDUストック溶液を各ウェルの培地に直接添加します。処理したニューロンを、ドラフトチャンバー内で37 °C、5% CO2の条件下で2〜24時間インキュベートしてください。ニューロンを2%Paraform aldehydeで室温にて10〜15分間固定します。1 XPBSで2〜5分間ずつ2回洗浄します。固定したニューロンは、新鮮な1 XPBS中で4°Cにて最大1か月間保存可能です。付属のテキストに従い、加湿チャンバーを準備します。先端の細いピンセットを使用して、ポジティブおよびネガティブのEDUコントロールを含む、固定済みのカバーガラス28枚を、加湿チャンバー内の疎水性パラフォームMのシート上に移動させます。各カバーガラスの表面を覆うように、1XPBSを200〜300 µL再添加します。本文および製造元の説明書に従ってClick-itアッセイキットを調製し、1XPBSに0.1% Triton Xを含む透過化溶液 75〜80 µLを各カバーガラスに加えてミトコンドリアDNAを標識し、室温で10分間インキュベートします。細胞を流失させずに液体を穏やかに除去するため、200 µLチップを先端に装着したバルブトランスファーピペットを使用してください。バルブピペットを使用して、カバーガラスに緩やかに液を満たします。1X PBSを200〜300 µL滴下し、前の溶液を完全に洗い流します。各カバーガラスを2回洗浄してください。新鮮な1%過酸化水素を含む1 XPBSを75～80 µL、各カバースリップにピペッティングします。内因性ペルオキシダーゼ活性を消去するため、カバーをして室温で30分間インキュベートします。前述と同様に1 XPBSで2回洗浄し、付属テキストに詳述されている手順に従ってクリック反応カクテルを調製します。ピペッティングにより上下に混ぜ合わせます。ボルテックス処理は行わないでください。カバースリップ1枚につき75〜80 µLのClick-iT EDU固定液を加え、神経細胞を後固定し、室温で5分間インキュベートします。後固定のインキュベート中に、反応カクテルを等量のClick-iT EDU固定液で希釈します。各カバーガラスに反応カクテルを加え、遮光して室温で25分間インキュベートします。エピ蛍光顕微鏡下で、反応カクテルを穏かに除去し、希釈した1xブロッキングバッファーで2回洗浄します。EdU染色の完了後、核におけるOregon Green染色の有無を確認してください。 TSA（ターミナイト信号増幅法）を開始するため、各カバースリップに1% TSAブロッキング溶液を加え、室温で30分間インキュベートします。あらかじめTSAの2〜24時間前に調製しておいた抗Anti-NE Green horseradish peroxidase（西洋わさびペルオキシダーゼ）結合抗体ストックを軽くスピンダウンさせます。一次抗体をTSAブロッキング溶液で1:300に希釈し、転倒混和またはピペッティングで混ぜ合わせます。ボルテックス（攪拌機）は使用しないでください。各カバースリップに75 µLを加え、4°Cで一晩インキュベートします。翌日、室温でXPBSを用いて3回洗浄します。未結合の一次抗体を確実に除去するため、最後の洗浄液にカバーガラスをさらに30～60分間浸漬させます。使用直前に、本プロトコルの本文に従ってIDE反応液を調製してください。カバーガラスをIDE反応液とともに室温で15分間インキュベートします。XPBSで3 times洗浄し、前述と同様に顕微鏡下で最後の洗浄液中で30〜60分間インキュベートします。MT DNAのラベル化を確認し、DPIを含むANTIFA封入剤を用いて、染色に成功したニューロンをガラススライドに封入します。ここに示しているのは、解析に通常用いられる胚および成体の後根神経節ニューロンの代表的な微分干渉コントラスト（DIC）像です。これらの概略図は、MTD NAにおけるEDUを緑色蛍光シグナルで標識する手順を示しています。有糸分裂活性のあるF 11神経芽細胞腫細胞をポジティブコントロールとして使用し、これらの代表的な明視野重ね合わせ蛍光画像において、核およびミトコンドリアDNAに取り込まれたEDUの標識パターンを示しています。緑色の点状のシグナルは、胚および成体の後根神経節ニューロンの両方において、新たに合成されたM-D-D-N-Aに取り込まれ、増幅されたEDUシグナルを示しています。EdUラベルの手順により、その後、ニューロフィラメントなどの神経マーカーを赤色の免疫蛍光染色することが可能です。これらの模式図は、EdUおよびMTD NAを赤色蛍光シグナルで標識する手順を示しています。有糸分裂活性を持つF 11神経芽細胞腫細胞をポジティブコントロールとして用い、核およびミトコンドリアDNAに取り込まれたEdUの標識パターンを示しています。この概略図は、新たに合成されたM-T-D-N-A中のBRDUを、緑色または赤色の蛍光シグナルで標識する手順を示しています。この手順を行う際は、増幅ステップに進んでMT DNAの標識を可視化させる前に、有糸分裂活性のある細胞を用いてコントロールを行い、EDU標識および細胞核が正常に確認できるかチェックすることが重要です。本手順に加えて、標準的な免疫蛍光染色などの他の手法を用いることで、神経細胞の特定のサブポピュレーションや神経細胞区画においてミトコンドリアDNA合成がどのように制御されているかなど、さらなる疑問に対する検討が可能です。本手法の開発により、神経生物学分野の研究者が、正常な生理学的状態の培養モデルおよび疾患による機能不全を模倣した培養モデルの両方において、ミトコンドリア数の調節を探索するための道が開かれることになります。神経学的状態。

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