EDU信号増幅による個別細胞におけるミトコンドリアDNAの複製の可視化

この手順の全体的な目標は、培養ニューロンにおけるM-T-D-N-A複製を標識し、可視化することです。これは、最初にニューロンをチミジンアナログEDUと2〜24時間インキュベートすることによって達成されます。手順の2番目のステップは、アルキンを含むEDUを蛍光オルゴングリーン4 88アジドで銅触媒共有結合反応により標識することです。

手順の最終ステップは、新たに合成されたMT DNAに組み込まれたEDUを視覚化するために、アラミドシグナル増幅ステップでオルゴングリーンシグナルを増幅することです。最終的には、clicka EDUの化学的性質とその後の涙の心のシグナル増幅の組み合わせにより、ニューロンの特定の細胞内コンパートメントにおけるMT DNA複製を示す結果を得ることができます。BRDU標識のような既存の方法と比較した場合のこの技術の主な利点は、EDU標識がより簡単で軽度であり、ニューロンマーカーの免疫蛍光染色を追加で行うことができることです。

この方法は、ニューロンが細胞体、軸索、樹状突起、シナプス終末などの細胞内コンパートメントで変化するエネルギー負荷をどのように満たすかなど、ミトコンドリア数の制御における重要な質問に答えることができます。したがって、この方法は、ニューロパチーや神経変性など、複数のミトコンドリアベースの神経疾患の病因の根底にあるメカニズムについての洞察を提供することができます。しかし、重要なことは、ミトコンドリアDNAコピーの変化が、薬物毒性、がん、老化など、病状の病因の根底にある可能性が高い他のシステムにも適用できるということです。

このビデオでは、無菌の12mmガラスカバースリップで成長した後根神経節ニューロンで、新たに合成されたミトコンドリアDNAの略称M-T-D-N-Aを標識する方法を示します。24ウェル培養プレートで、Clicka EDOアッセイキット1から100までの5つのエタノール2ドキシウリジン(略してEDU)の10ミリモルストックを希釈し、10 XEDUストックの培養培地にします。次に、10 XEDUストックを各ウェルの培地に直接加え、処理されたニューロンを摂氏37度、二酸化炭素5%で2〜24時間、ヒュームフード内でインキュベー

ニューロンを2%パラフォームアルデヒドに室温で10〜15分間固定します。1回のXPBSで2回、各洗浄で2〜5分間洗浄します。固定ニューロンは、新鮮な1つに保存することができます XPBS 摂氏4度で最大1ヶ月間。

添付のテキストで説明されているように、湿ったチャンバーを準備します。先端の細い鉗子を使用して、ポジティブおよびネガティブEDUコントロールを含む28枚の固定カバースリップを、湿度の高いチャンバー内の疎水性パラフォームMのシートに移します。200〜300マイクロリットルのXPBSを1枚塗り直して、各カバースリップの表面を覆います。

本文に記載されているクリックイットアッセイキット、および製造元および説明書に記載されているように、1つのXPBS中に0.1%トリットンXを含む透過性溶液の75〜80マイクロリットルでミトコンドリアDNAを標識し、各カバー、スリップ、カバー、室温で10分間インキュベートします。端に200マイクロリットルの先端が固定された電球トランスファーピペットを使用してください。細胞を失うことなく液体をやさしく取り除きます。

電球ピペットを使用して、カバーをそっと満たします。200〜300マイクロリットルのXPBSを1つ入れて、前の溶液を完全に洗い流します。各カバースリップを2回洗います。

1つのXPBSに75〜80マイクロリットルの新鮮な1%過酸化水素を各カバースリップにピペットで固定します。蓋をして室温で30分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチします。前と同じように1つのXPBSで2回すすぎ、添付のテキストに詳述されているように、反応カクテルでクリックを新たに準備します。

上下にパイプでつなぎ合わせます。75〜80マイクロリットルのクリックでニューロンをボルテックスポストフィックスしないでください、カバースリップごとにEDU固定剤は室温で5分間インキュベートします。ポストフィックスインキュベーション中に、リアクションカクテルを等量のclicka EDU固定液で希釈します。

各カバースリップカバーにリアクションカクテルを追加して光から保護し、室温で25分間インキュベートします。エピ蛍光顕微鏡下で、希釈したOne x ブロッキングバッファーで反応カクテル洗浄液を2回静かに取り出します。EDU染色が完了したら、核内のオルゴングリーン染色を確認します。

シロアリシグナル増幅またはTSAを開始し、各カバースリップに1%TSAブロック溶液を添加し、室温で30分間インキュベートします。TSAの2〜24時間前に調製したアンチワングリーンセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗体ストックを短時間回転させ、一次抗体をTSAブロッキング溶液で1〜300に希釈し、反転またはピペットで混合して結び目渦を混合します。各カバーに75マイクロリットルを加え、スリップして摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌日、室温で1つのXPBSで3回すすいでください。最終洗浄でカバースリップをさらに30〜60分間インキュベートし、未結合の一次抗体が除去されることを確認します。IDE反応は、使用直前にこのプロトコルのテキスト部分に従って調製してください。

カバースリップをIDE反応と室温で15分間インキュベートします。1つのXPBSを最終洗浄でインキュベートし、前回と同様に顕微鏡下で30〜60分間インキュベートして3回洗浄します。MT DNAラベリングのチェック:DPIを含むANTIFA封入剤を使用してスライドガラス上に正常に染色されたニューロンをマウントする例は、通常分析に使用される胚および成体の後根神経節ニューロンの代表的な差動干渉コントラスト画像です。

これらの概略図は、MTD NAのEDUを緑色蛍光シグナルで標識する手順を表しています。有糸分裂活性F11神経芽腫細胞は、ポジティブコントロールとして機能し、これらの代表的な蛍光画像に核DNAおよびミトコンドリアDNAに組み込まれたEDUの標識パターンを明視野上に重ね合わせて示しています。緑色の点状信号は、胚性および成人の背根神経節ニューロンの新しく合成されたM-D-D-N-Aに組み込まれた増幅されたEDU信号を示しています。

EDU標識手順により、ニューロフィラメントなどのニューロンマーカーのその後の免疫蛍光染色が可能になります。これらの概略図は、EDUおよびMTD NAを赤色蛍光シグナルで標識する手順を表しています。有糸分裂的に活性なF 11神経芽腫細胞は、ポジティブコントロールとして機能し、核DNAおよびミトコンドリアDNAに組み込まれたEDUの標識パターンを示しています。

この概略図は、新たに合成されたM-T-D-N-A中のBRDUを緑色または赤色の蛍光シグナルで標識する手順を示しています。この手順を試行する際は、この手順に従ってMT DNA標識を視覚化するための増幅ステップに進む前に、EDU標識と細胞核が成功したことを確認するために、有糸分裂活性細胞を使用してコントロールを実行することを忘れないでください。標準的な免疫蛍光法のような他の方法は、ミトコンドリアDNA合成がニューロンまたはニューロンコンパートメントの特定の亜集団でどのように調節されているかのような追加の質問に答えるために実行することができますその開発のために、この技術は、神経生物学の分野の研究者が正常な生理学の培養モデルだけでなく、障害のある疾患をシミュレートする培養モデルでミトコンドリア数の調節を探求するための道を開くでしょう。

神経学的状態。