ミトコンドリア局在と原子力細胞周期キナーゼ、Cdk1のの機能を研究するための実験的アプローチ

以下の手順の全般的な目的は、通常は核に存在する細胞周期キナーゼのミトコンドリア内局在を決定し、そのミトコンドリアへの局在が細胞周期の進行にどのように影響するかを分析することです。この手法は、細胞周期中に核がどのようにミトコンドリアと通信しているかなど、ミトコンドリア研究分野における重要な疑問への答えを得るのに役立ちます。タンパク質にミトコンドリア移行シグナルを付加することで、ミトコンドリアにおける特定のタンパク質の過剰発現を利用でき、そのミトコンドリア特異的な機能を研究することが可能になります。

この手法は、特定のタンパク質のミトコンドリアへの標的化に関する知見を得るために有用ですが、核、小胞体（ER）、ゴルジ体、リソソームなどの他のオルガネラにも適用可能です。テキストプロトコルに従って細胞の培養、ホモジナイズ、およびペレット化を行った後、上清を新しいチューブに移します。そして、サンプルを 7,000 g、4 °C で 10 分間遠心分離します。

次に、200 µLの氷冷IBCバッファーを用いてペレットを再懸濁し、ホモジネートを2つの分注分に分けます。サンプルを再び7,000 g、4 °Cで10分間遠心分離します。そして、洗浄を繰り返します。

上清を捨てた後、ペレットの1つに細胞溶解バッファーを30 µL加え、溶解物を-80 °Cで保存して免疫ブロットに用います。もう一方のペレットを用いて可溶性タンパク質と膜結合性タンパク質を分離するための炭酸ナトリウム抽出を行うには、0.1 M 炭酸ナトリウム（pH 11.0）を250 µL加え、氷上で30分間インキュベートします。その後、100,000 gで20分間遠心分離します。

次に、上清を回収し、タンパク質を沈殿させるために、調製したばかりの20%トリクロロ酢酸を同量加えます。氷上で30分間保持します。その間に、ペレットに30 µLの細胞溶解バッファーを加え、テキストのプロトコルに従って超音波処理を行い、その後、イムノブロッティング用に-80 °Cで保存します。

30分間のTCAインキュベーション後、反応液を15,000 gで10分間遠心分離します。上清を捨て、80 µLの細胞溶解バッファーを用いてペレットを再懸濁します。テキストプロトコルに記載の方法で細胞からミトコンドリア分画を単離した後、ミトコンドリア分画を10等分に分けます。

サンプルを7,000 g、4 °Cで10分間遠心分離してペレット化します。トリプシンを含む、または含まない様々な濃度の低張ショ糖バッファーを30 µL使用して、各ペレットを溶解させます。その後、氷上で30分間インキュベートします。

トリプシン消化を停止させるため、トリプシンを含むバイアルに10 millimolar PMSFを3 µL加えます。その後、氷上で10分間インキュベートします。サンプルを14,000 g、4 °Cで10分間遠心分離します。

そして、上清を新しいチューブに移します。ペレットを溶解させるために、30 µLの細胞溶解バッファーを加えます。テキストプロトコルに記載されている通りにサンプルをソニケーションし、-80 °Cで保存します。

ミトコンドリア標的型GFP/RFPタグ付きcyclinB-1 Cdk-1ベクターを構築するために、ヒトシトクロムcオキシダーゼサブユニット8A前駆体からミトコンドリア標的配列をクローニングし、標準的な分子クローニング手法を用いて、pEGFP-N1またはpERFP-N1のNhe1およびbAmH1部位でGFPまたはRFPのN末端とフレームを合わせて挿入します。テキストプロトコルに記載されたプライマーを使用し、標準的な手法に従ってCdk1およびcyclinB1遺伝子を増幅します。その後、BamH1を用いてPCR産物を消化します。

反応物を1%アガロースゲルで電気泳動し、カミソリを使用して適切なサイズのDNA断片を切り出します。次に、ゲル抽出キットを用いてDNAを精製します。続いて、1 µgのMTS-pEGFP-N1およびMTS-pERFP-N1プラスミドを、1 µLのBamH1を用いて37 °Cで2時間消化します。

次に、1 µLの calf intestinal alkaline phosphatase を加え、37 °C で30分間インキュベートします。消化産物を1% アガロースゲルで電気泳動し、前述の方法でDNAを精製した後、テキストプロトコルに記載されている試薬を用いてライゲーション反応を行います。その後、反応液を4 °C で一晩インキュベートします。

ライゲーション混合液 10 µL を用いて e. coli dH5-alpha コンピテントセルを形質転換します。その後、10 mg/mL の kanamycin を添加した LB 寒天培地プレート上で、37 °C で一晩培養します。

翌日、滅菌済みのピペットチップを使用してプレートからコロニーをピックアップします。そして、5 millilitersのLB kanamycinを含むチューブにチップを挿入します。培養液を一晩インキュベートし、翌朝、テキストのプロトコルに従ってミニプレップキットを使用してプラスミドを単離します。

対数増殖期のMCF-10A細胞をトランスフェクションするには、Cdk1またはcyclinB-1プラスミドを用い、血清および抗生物質を含まない培地100 µL中で1:2の比率でプラスミドトランスフェクション試薬を調製します。細胞をトランスフェクションし、37 °Cで48時間インキュベートします。テキストプロトコルに従ってミトコンドリアを染色し、可視化します。

セルソーティングを行うには、血清および抗生物質を含まない培地 2.5 milliliters で調製した DNA とトランスフェクション試薬を 1:2 の比率で用い、6ウェルプレート内の 2 times 10 to the 5th 個の細胞に目的のベクターをトランスフェクションします。トランスフェクション後 48 時間インキュベートし、テキストプロトコルに従ってフローサイトメトリーを用い、GFPタグ付き Cdk-1 および RFPタグ付き cyclinB1 タンパク質を安定的に発現している細胞をライブソートします。EdU ラベリングフローサイトメトリーアッセイを用いて細胞周期の長さを測定するには、ソートした細胞を 6ウェルプレートに 1ウェルあたり 2.5 times 10 to the 5th 個の密度で播種します。

一晩インキュベートした後、最終濃度25 micromolarになるようにEdUを培地に追加し、さらに1時間インキュベートします。その後、2時間間隔で、500 microlitersのPBSに1%BSAを添加した溶液を用いて細胞のウェルを1つ洗浄します。そして、1.5-milliliterチューブに回収します。

細胞を350 gで5分間遠心分離します。その後、上清を除去します。100 µLの固定液を加えてペレットを懸濁させます。

十分に混ぜ合わせ、室温で15分間インキュベートします。次に、PBSで希釈した1%BSAを1 mL使用して、細胞を3回洗浄します。その後、70%エタノールを0.5 mL使用し、4 °Cで一晩細胞を固定します。

GFPおよびRFPタグ付きタンパク質をトランスフェクトした細胞を用いてEdUラベル化を行う際は、GFPおよびRFPからの蛍光信号を消光させることが極めて重要です。これを達成するために、70% ethanolを用いた細胞のオーバーナイト固定という工程を追加します。翌日、テキストプロトコルに従って細胞の洗浄と透過処理を行った後、各チューブに0.5 millilitersの反応カクテルを加え、十分に混ぜ合わせます。

暗所でのインキュベーション後、再度洗浄を行い、1%BSA含有PBSで調製した50 µg/mLのプロピジウムヨード（PI）を用いてDNAを染色します。フローサイトメトリーで細胞を解析し、EdU陽性集団を追跡します。DNA量およびEdUで染色したEdU標識細胞の散布図を提示します。

Alexa 647 EdUには、685 nm未満のすべての光が透過する670 30-bandpassフィルターを用いたAPCチャネルを、PIには、600 nm未満のすべての光が透過する581 15-bandpassフィルターを用いたフィコエリスリンチャネルを使用します。標準的なゲーティング戦略を用いて、まず形態学的評価のためにFSC areaとSSC areaをプロットし、続いて細胞染色のためにPIとAlexa 647 EdUをプロットします。すべてのチューブのデータを順次記録し、1サンプルあたり10,000イベントを取得します。

この図では、ミトコンドリアマトリックスタンパク質であるHsp60と、膜間腔タンパク質であるTimm13をミトコンドリア内局在マーカーとして使用しました。Timm13とは異なり、Hsp60と同様にcyclinB1およびCdk1はトリプシン消化から保護されており、これらがミトコンドリアマトリックスに局在していることが示されました。ここに示すように、MTSおよびGFPタグ付きのcyclinB1およびCdk-1コンストラクトを用いた分離ミトコンドリア画分のウェスタンブロッティングにより、ミトコンドリアにおけるcyclinB1および/またはCdk-1の過剰発現が達成されました。

EdUパルスチェイスアッセイを用いて、野生型ミトコンドリアcyclinB1 Cdk-1を発現する細胞では、標識されたS期の細胞がG2M期を経て、早ければ4時間でG1期に現れることが示されました。これは、ベクターコントロールまたは変異型cyclinB1 Cdk-1を導入した細胞で6時間かかった場合と比較して、ミトコンドリアcyclinB1 Cdk-1の増強が細胞周期の進行を促進することを示唆しています。本手順の後、ミトコンドリアのATP産生、酸素消費量、膜電位、および活性酸素種の測定などの他の手法を用いることで、細胞周期キナーゼCdk-1のミトコンドリア局在が、ミトコンドリアの呼吸およびエネルギー出力にどのように影響するかといった追加の疑問を検討することが可能です。

このビデオを視聴することで、核キナーゼのミトコンドリア局在およびミトコンドリア特異的な機能を研究する方法について、十分な理解を深めることができます。