ミトコンドリア局在と原子力細胞周期キナーゼ、Cdk1のの機能を研究するための実験的アプローチ

次の手順の全体的な目標は、正常核細胞周期キナーゼのサブバイコンドリア局在を決定し、そのミトコンドリア局在が細胞サイクルの進行にどのように影響するかを分析することです。この方法は、細胞周期中に核がミトコンドリアとどのように通信するかなど、ミトコンドリア研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。タンパク質にミトコンドリアの先行配列をタグ付けすることで、ミトコンドリア内のタンパク質の特異的な過剰発現を利用することができ、ミトコンドリア特異的な機能を研究することができます。

この方法は、特定のタンパク質を標的とするミトコンドリアに関する洞察を得ることができますが、核、ER、ゴルジ体、リソソームなどの他の細胞小器官にも適用できます。テキストプロトコルに従って細胞を培養、均質化、およびペレット化した後、上清を新しいチューブに移します。そして、サンプルを7, 000 g、摂氏4度で10分間遠心分離します。

次に、200マイクロリットルの氷冷IBCバッファーを使用してペレットを再懸濁し、ホモジネートを2つのアリコートに分割します。サンプルを7, 000 g、摂氏4度で10分間再度遠心分離します。そして洗濯を繰り返します。

上清を廃棄した後、ペレットの1つに30マイクロリットルの細胞溶解バッファーを加え、イムノブロッティングのためにライセートを摂氏80度で保存します。可溶性タンパク質と膜結合タンパク質を分離するために第2のペレットで炭酸ナトリウム抽出を行うには、250マイクロリットルの0.1モル炭酸ナトリウムpH 11.0を加え、氷上で30分間インキュベートします。100, 000 g で 20 分間遠心分離します。

次に、上清を収集し、同じ量の作りたての20%トリクロロ酢酸を加えてタンパク質を沈殿させます。30分間氷の上に置きます。その間に、30マイクロリットルの細胞溶解バッファーをペレットに加え、テキストプロトコルに従って超音波処理してから、イムノブロッティングのために摂氏80度で保存します。

30分間のTCAインキュベーション後、反応を15, 000gで10分間遠心分離します。上清を捨て、80マイクロリットルの細胞溶解バッファーを使用してペレットを再懸濁します。テキストプロトコルに記載されているように細胞からミトコンドリア画分を単離した後、ミトコンドリア画分を10等分します。

サンプルを7, 000 g、摂氏4度で10分間ペレット化します。トリプシンの有無にかかわらず、さまざまな濃度の低張性ショ糖緩衝液を30マイクロリットル使用して、各ペレットを溶解します。.そして、氷上で30分間インキュベートします。

トリプシン含有バイアルに3マイクロリットルの10ミリモルPMSFを加えて、トリプシン消化を停止します。.そして氷上で10分間インキュベートします。サンプルを14, 000 g、摂氏4度で10分間遠心分離します。

そして、上清を新しいチューブに移します。ペレットを溶解するには、30マイクロリットルの細胞溶解バッファーを追加します。テキストプロトコルに記載されているようにサンプルを超音波処理し、摂氏80度で保存します。

ミトコンドリアを標的とするGFP/RFPタグ付きcyclinB-1 Cdk-1ベクターを構築するには、ヒトシトクロム-cオキシダーゼサブユニット8Aの前駆体からミトコンドリア標的配列をクローニングし、標準的な分子クローニング技術を用いて、pEGFP-N1またはpERFP-N1のNhe1およびbAmH1部位にGFPまたはRFPのn末端をフレーム化します。テキストプロトコールで概説されているプライマーを使用して、標準的な技術に従ってCdk1およびcyclinB1遺伝子を増幅します。次に、BamH1を使用してPCR産物を消化します。

1%アガロースゲルで反応を行った後、カミソリの刃で正しいサイズのDNA断片を切り取ります。次に、ゲル抽出キットを使用してDNAを精製します。次に、MTS-pEGFP-N1およびMTS-pERFP-N1プラスミド1マイクログラムと1マイクロリットルのBamH1を摂氏37度で2時間消化します。

次に、1マイクロリットルの子牛腸内アルカリホスファターゼを加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。消化産物を1%アガロースゲル上で実行し、前述のようにDNAを精製した後、テキストプロトコールに記載されている試薬を使用してライゲーション反応を設定します。その後、反応を摂氏4度で一晩インキュベートします。

大腸菌dH5-αコンピテントセルを10マイクロリットルのライゲーション混合物で形質転換します。そして、LB寒天とカナマイシンの1ミリリットルあたり10ミリグラムのプレートでバクテリアを摂氏37度で一晩成長させます。

翌日、滅菌ピペットチップを使用して、プレートからコロニーを取り出します。そして、5ミリリットルのLBカナマイシンが入ったチューブに先端を差し込みます。培養物を一晩インキュベートし、翌朝、テキストプロトコルに従ってミニプレップキットを使用してプラスミドを単離します。

指数関数的に増殖するMCF-10A細胞をトランスフェクションするには、Cdk1またはcyclinB-1プラスミドを使用して、100マイクロリットルの血清および抗生物質を含まない培地に1:2の割合でプラスミドトランスフェクション試薬を調製します。細胞をトランスフェクションし、摂氏37度で48時間インキュベートします。テキストプロトコルに従ってミトコンドリアを染色し、視覚化します。

細胞選別を行うには、2.5ミリリットルの血清および抗生物質を含まない培地で調製したDNAとトランスフェクション試薬の1:2の比率を使用して、6ウェルプレートで目的のベクターを用いて、2×10を5番目の細胞にトランスフェクションします。トランスフェクションを48時間インキュベートした後、フローサイトメトリーを使用して、テキストプロトコルに従ってGFPタグ付きCdk-1およびRFPタグ付きclyclinB1タンパク質を安定して発現する細胞をライブソーティングします。EdU標識フローサイトメトリーアッセイを用いて細胞周期長を測定するには、ウェルあたり10の2.5倍から5番目の細胞の密度で6ウェルプレートで細胞をシードソーティングします。

一晩インキュベーションした後、最終濃度25マイクロモルで培地にEdUを加え、さらに1時間インキュベートします。次に、2時間間隔で、500マイクロリットルのPBSに1%BSAを使用して、1ウェルの細胞を洗浄します。そして1.5ミリリットルのチューブに集めます。

細胞を350 gで5分間遠心分離します。次に、上清を捨てます。100マイクロリットルの固定液を加えてペレットを取り除きます。

よく混ぜ合わせ、室温で15分間インキュベートします。次に、PBS中の1ミリリットルの1%BSAを使用して、細胞を3回洗浄します。次に、0.5ミリリットルの70%エタノールを使用して、細胞を摂氏4度で一晩固定します。

GFPおよびRFPタグ付きタンパク質をトランスフェクトした細胞でEdU標識を行う場合、GFPおよびRFPからの蛍光シグナルをクエンチすることが重要です。これを達成するために、70%エタノールを使用して一晩細胞固定する追加のステップを追加します。翌日、テキストプロトコルに従って細胞を洗浄し、透過処理した後、各チューブに0.5ミリリットルの反応カクテルを加え、よく混合します。

暗所でのインキュベーションと再度の洗浄に続いて、1mリットルあたり50マイクログラムのヨウ化プロピジウムまたはPIを1%BSA PBS中に使用してDNAを染色します。フローサイトメトリーで細胞を解析し、EdU陽性集団を追跡します。DNA含有量とEdUについて染色したEdU標識細胞の散在するドットプロットを提示します。

Alexa 647 EdUのAPCチャネルは、すべての光が685ナノメートル未満の670 30バンドパスフィルターを使用し、PIのフィコエリトリンチャネルとその前に581 15バンドパスフィルターを使用し、すべての光がそのフィルターに当たる600ナノメートル未満です。取得のための標準的なゲーティング戦略では、形態についてはFSC面積をSSC面積ごとにプロットし、続いて細胞染色のためにAlexa 647 EdUによるPIをプロットします。すべてのチューブのデータを 1 つずつ記録し、サンプルごとに 10 、 000 のイベントを取得します。

この図では、ミトコンドリアマトリックスタンパク質Hsp60と膜間空間タンパク質Timm13をサブミトコンドリア局在マーカーとして用いています。Hsp60と似ていますが、Timm13とは異なり、cyclinB1とCdk1はトリプシン消化から保護されており、ミトコンドリアマトリックスに局在していることを示しています。ここに示すように、MTSおよびGFPタグ付きcyclinB1およびCdk-1コンストラクトを用いて単離されたミトコンドリア画分のウェスタンブロッティングにより、ミトコンドリアにおけるcyclinB1および/またはCdk-1の過剰発現が達成された。

EdUパルスチェイスアッセイを用いて、標識S期細胞がG2M期を経て進行し、野生型ミトコンドリアcyclinB1 Cdk-1を発現する細胞において、4時間という速さでG1期に出現することが実証されました。ベクターコントロールまたは変異型cyclinB1 Cdk-1をトランスフェクトした細胞では、6時間と比較して、ミトコンドリアcyclinB1 Cdk-1の増強が細胞周期の進行を加速することを示しています。この手順に続いて、ミトコンドリアATPの生成、酸素消費量、膜電位、活性酸素種などの他の方法を測定して、細胞周期キナーゼCdk-1のミトコンドリア局在がミトコンドリアの呼吸とエネルギー出力をどのように変化させるかなどの追加の質問に答えることができます。

このビデオを見れば、核キナーゼのミトコンドリア局在とミトコンドリア特異的な機能の研究方法について十分に理解できるはずです。