Name: ミトコンドリア局在と原子力細胞周期キナーゼ、Cdk1のの機能を研究するための実験的アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 15 s
Description: 学ぶミトコンドリア局在解析法で細胞周期キナーゼCdk1の機能を研究する方法。ミトコンドリア標的配列を用いたタンパク質標識と分画分離技術により、核とミトコンドリアの相互作用を解明し、細胞周期制御メカニズムの理解を深めます。

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この作業は、NIHの助成金CA133402、CA152313、エネルギー省科学局DE-SC0001271の支援を受けました。NCI P30 CA0933730からの資金提供、NIH NCRR C06-RR12088、S10 RR12964、S10 RR 026825 からの資金提供を受けたカリフォルニア大学デービス校のフローサイトメトリー共有リソース研究所、およびフローサイトメトリー実験に協力してくださった Bridget McLaughlin 氏と Jonathan Van Dyke 氏からの技術支援に感謝します。

<ol><li>Weinert, T., Hartwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+G2+delay+by+the+rad9+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci+Suppl%22%5BJournal%5D)">Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).</li>
<li>Takizawa, C. G., Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+mitosis+by+changes+in+the+subcellular+location+of+cyclin-B1-Cdk1+and+Cdc25C%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C.</a> Curr Opin Cell Biol. 12 (6), 658-665 (2000).</li>
<li>Allan, L. A., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+caspase-9+by+CDK1%2Fcyclin+B1+protects+mitotic+cells+against+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis.</a> Mol Cell. 26 (2), 301-310 (2007).</li>
<li>Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+fusion+and+division%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial fusion and division.</a> Trends Cell Biol. 17 (11), 563-569 (2007).</li>
<li>Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+converting+NADH%3Aquinone+oxidoreductase+%28complex+I%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I).</a> Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).</li>
<li>Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+analysis+of+the+peripheral+and+membrane+parts+of+mitochondrial+NADH+dehydrogenase+%28complex+I%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I).</a> J Mol Biol. 221 (3), 1027-1043 (1991).</li>
<li>Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory-chain+NADH+dehydrogenase+%28complex+I%29+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria.</a> Eur J Biochem. 197 (3), 563-576 (1991).</li>
<li>Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+complex+I%3A+structure%2C+function+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial complex I: structure, function and pathology.</a> J Inherit Metab Dis. 29 (4), 499-515 (2006).</li>
<li>Roessler, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+assignment+of+EPR+spectra+to+structurally+defined+iron-sulfur+clusters+in+complex+I+by+double+electron-electron+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 1930-1935 (2010).</li>
<li>Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mitochondrial+retrograde+signals+control+the+G1-S+cell+cycle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint.</a> Nat Genet. 40 (3), 356-361 (2008).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+B1%2FCdk1+coordinates+mitochondrial+respiration+for+cell-cycle+G2%2FM+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression.</a> Dev Cell. 29 (2), 217-232 (2014).</li>
<li>Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-targeting+sequence%2C+a+multi-role+sorting+sequence+recognized+at+all+steps+of+protein+import+into+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria.</a> J Biochem. 123 (6), 1010-1016 (1998).</li>
<li>Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+heavy+ion+tracks+by+labeling+3%27-OH+termini+of+induced+DNA+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Visualization of heavy ion tracks by labeling 3'-OH termini of induced DNA strand breaks.</a> J Radiat Res. 52 (4), 433-440 (2011).</li>
<li>Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history+of+the+initial+application+of+anti-5-BrdU+to+the+detection+and+measurement+of+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase.</a> Cytometry A. 58 (1), 45-52 (2004).</li>
<li>Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+%27click%27+reaction+for+labeling+and+detection+of+DNA+in+proliferating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic 'click' reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells.</a> Biotechniques. 49 (1), 525-527 (2010).</li>
<li>Kondo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+sensitive+fluorescent+dyes+in+linkage+of+laser+microdissection+and+two-dimensional+gel+electrophoresis+as+a+cancer+proteomic+study+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool.</a> Proteomics. 3 (9), 1758-1766 (2003).</li>
<li>Gundry, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+10%2C+Preparation+of+proteins+and+peptides+for+mass+spectrometry+analysis+in+a+bottom-up+proteomics+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Unit 10.25(2009).</li>
<li>Davies, D. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavies%2C+D+%22Flow+Cytometry%22">Flow Cytometry</a>. Macey, M. G. , Humana Press. 257-276 (2007).</li>
<li>van den Heuvel, S., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+cyclin-dependent+kinases+in+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control.</a> Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).</li>
<li>Terry, N. H. A., White, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+after+bromodeoxyuridine+labeling+to+measure+S+and+G2%2BM+phase+durations+plus+doubling+times+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protcols%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo.</a> Nat. Protcols. 1 (2), 859-869 (2006).</li>
<li>Becker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preprotein+translocase+of+the+outer+mitochondrial+membrane%3A+reconstituted+Tom40+forms+a+characteristic+TOM+pore%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore.</a> J Mol Biol. 353 (5), 1011-1020 (2005).</li>
<li>Karniely, S., Pines, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+translation--dual+destination%3A+mechanisms+of+dual+protein+targeting+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Single translation--dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes.</a> EMBO Rep. 6 (5), 420-425 (2005).</li>
<li>Candas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyclinB1%2FCdk1+phosphorylates+mitochondrial+antioxidant+MnSOD+in+cell+adaptive+response+to+radiation+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress.</a> J Mol Cell Biol. 5 (3), 166-175 (2013).</li>
<li>Nantajit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+B1%2FCdk1+phosphorylation+of+mitochondrial+p53+induces+anti-apoptotic+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response.</a> PLoS One. 5 (8), e12341(2010).</li>
<li>Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+based+on+click+chemistry%2C+which+overcomes+limitations+of+cell+cycle+analysis+by+classical+determination+of+BrdU+incorporation%2C+allowing+multiplex+antibody+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining.</a> Cytometry A. 73 (7), 626-636 (2008).</li>
<li>Niwa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+nature+of+the+light+emitter+of+the+Aequorea+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13617-13622 (1996).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Marouga, R., David, S., Hawkins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+DIGE+system%3A+2D+fluorescence+difference+gel+analysis+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology.</a> Anal Bioanal Chem. 382 (3), 669-678 (2005).</li>
<li>Timms, J. F., Cramer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Difference gel electrophoresis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4886-4897 (2008).</li>
<li>Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrane%2C+J+%22BD+Biosciences+Appl+Notes%22">BD Biosciences Appl Notes</a>. , (2011).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

他の細胞内小器官宛のタンパク質と同様に、ミトコンドリアの標的タンパク質は、精巧なタンパク質のトランスロケーションと折り機21,22の支援を受けて細胞小器官にそれらを向ける彼らの一次または二次構造内ターゲティングシグナルを有しています。例えばCOX8としてのみミトコンドリア常駐タンパク質から得られた配列（MTS）を標的とするミトコンドリアは、ミトコンドリア11,23,24に特定のタンパク質を標的とする任意の遺伝子配列のN末端 ​​に付加することができます。ここでは、サイクリンおよびCdk1の遺伝子がベクターを含むCOX8のMTSへと発現の際にクローン化した、組換えサイクリンおよびCdk1のは、ミトコンドリアに局在していました。このアプローチの利点は、全体的な遺伝子発現を変化させることなく、この場合、ミトコンドリアに、特定の副細胞区画に遺伝子発現の改変を可能にすることです。この戦略では、ミトコンドリア特異的核キナーゼの機能は、Cdk1のがdeましたtermined。同様に、ドミナントネガティブCdk1のにMTSを添加することにより、ダウンCdk1のミトコンドリア特有の機能のノックミトコンドリアCD...

哺乳類では、細胞周期の進行は、サイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼ（CDK）1によって制御される、高度に秩序イベントに依存しています。その細胞質、核、および中心体の局在化を通じ、サイクリン/ Cdk1のは、核エンベロープの破壊や中心体の分離2などの有糸分裂におけるさまざまなイベントを同期することができます。サイクリン/ Cdk1のは、アポトーシス3に対して有糸分裂細胞を保護し、ミトコンドリアの分裂、新たに形成された娘細胞4にミトコンドリアの平等な分配のための重要なステップを促進します。 哺乳動物細胞の増殖には、ミトコンドリアのATP、5マルチサブユニット複合体で構成されている酸化的リン酸化（OXPHOS）機械（電子伝達系）を介して生成されます。複合体I - 複雑なV（CI-CV）。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）：ユビキノン酸化還元酵素または複合体I（CI）は、5つの複合体5の理解最大と最小です。複雑なC45サブユニットの14のonsistsは、触媒コアを形成します。一旦組み立てられる、複合体は、1マトリックス内に突出するアームと内膜6,7に埋め込 ​​まれ、他方のアームとL字型構造を前提としています。 CIサブユニットの変異は、ミトコンドリア病8の様々な原因です。 OXPHOSで機能的、効率的なCIが、全体的なミトコンドリア呼吸9のためだけでなく、成功した細胞周期進行10のためだけでなく、必要とされます。健康と病気で、この膜結合酵素複合体の機能のメカニズムをUnravellingする新規な診断手順と高度な治療戦略の開発を可能にすることができます。最近の研究では、サイクリン/ Cdk1の複合体が細胞中の細胞の増加したエネルギー需要を相殺する（ギャップ2）G2 /（有糸分裂）M期におけるミトコンドリアに移行し、潜在的に、ミトコンドリアのエネルギー産生を高めるために、CIサブユニットをリン酸化することを見出しましたサイクル11。ここでは、SHO実験手順および他の方法で核/細胞質キナーゼのミトコンドリア転移を研究するために使用することができます戦略、そのミトコンドリアの基質と同様の例として、サイ​​クリン/ Cdk1のを使用して、ミトコンドリア局在の機能的結果をwcase。 必要なときにサイクリン/ Cdk1の複合体はミトコンドリアに移行していることを発見は、この複合体のミトコンドリア固有の過剰発現およびノックダウンの研究を促しました。蛋白質のミトコンドリア特異的発現を達成するためには、目的のタンパク質のN末端にミトコンドリアターゲティング配列（MTS）を追加することができます。配列を標的とするミトコンドリアは、彼らは通常、12を常駐ミトコンドリアへミトコンドリアタンパク質の選別を可能にします。我々は、サイクリンまたは赤色蛍光をタグ付きヒトシトクロムcオキシダーゼサブユニット8A（COX8）の前駆体から誘導された87塩基ミトコンドリアターゲティング配列を使用し、緑色蛍光タンパク質（GFP）にそれをクローン化してきましたタンパク質（RFP）がCdk1のがフレーム内にプラスミドを含むタグ付き。この方法は、具体的には、それらの核のプールに影響を与えることなく、これらのタンパク質のミトコンドリアの表現を変え、私たちはミトコンドリアにサイクリンとCdk1のをターゲットにすることができました。蛍光これらのタンパク質をタグ付けすることによって、我々はリアルタイムでそれらの局在をモニターすることができました。同様に、私たちは私たちは、特にCdk1のミトコンドリアの発現と機能をノックダウンすることができRFPタグ付きドミナントネガティブCdk1のを含むプラスミドにMTSを導入しています。 Cdk1のような二重のローカライズ版を持っているキナーゼのミトコンドリアと核の機能を区別することが不可欠です。これらの二重機能性キナーゼのN末端へのエンジニアリングMTSを採用することが容易かつ効果的である偉大な戦略を提供しています。 Cdk1のは、細胞周期キナーゼであるので、Cdk1のは、ミトコンドリアに局在している場合、細胞周期の進行を決定するために基本的です。これを達成するために、我々は、新しいメトを利用していますdは細胞におけるDNA含有量を監視します。従来の方法は、チミジンを置換するために、細胞周期のS期の間に新たに合成されたDNAに組み込まれたBrdU（ブロモデオキシウリジン）、合成チミジン類似体を用いることを含みます。そして積極的にそれらのDNAを複製している細胞を、抗BrdU抗体を用いて検出することができます。この方法の一つの欠点は、結果13,14の間で矛盾を生じ得る酸または熱処理などの過酷な方法によってBrdU抗体のためのアクセスを提供するために、DNAの変性を必要とすることです。代わりに、我々は異なるチミジンアナログ、EDUで活発に分裂する細胞を監視するために、同様のアプローチを利用しました。中性洗剤処理は新たに合成されたDNAにEDUにアクセスするための検出試薬を可能としてEDU検出は、過酷なDNA変性を必要としません。 EDUの方法は、より信頼性の高い一貫性および高スループット分析15のための潜在的であることが証明されています。 最後に、トンO Cdk1のミトコンドリアの基質を決定、我々は古典的な2次元ゲル電気泳動の高度なバージョンである2D-DIGEと呼ばれるプロテオミクスツールを使用していました。二次元電気泳動は、第二の最初の次元と分子量のそれらの等電点に応じてタンパク質を分離します。例えば、リン酸化などの翻訳後修飾は、タンパク質の等電点および分子量に影響を与えるので、2Dゲルは、異なる試料内のタンパク質のリン酸化状態の違いを検出することができます。タンパク質スポットの大きさ（面積および強度）は、複数のサンプル間の定量的な比較を可能にするタンパク質の発現レベルの変化します。この方法を使用して、我々は、変異ミトコンドリア標的Cdk1の発現細胞に対する野生型ではリン酸化タンパク質を区別することができました。野生型で示したが、ミトコンドリアを標的とした突然変異体Cdk1の準備に欠落していた特定のタンパク質スポットを単離し、質量分析により同定。 従来の2Dゲル中で、トリフェニルメタン染料、ゲル上のタンパク質を可視化するために使用されます。 2D-DIGEは、タンパク質電気泳動移動度への影響を最小限に抑えながら蛍光タンパク質のラベルを使用しています。異なるタンパク質サンプルは、単一のゲル16上の複数のサンプルの同時電気泳動を可能にする、一緒に混合し、同じゲルにより分離し、異なる蛍光色素で標識することができます。これは、ゲルベースの​​プロテオミクス研究における重要な問題であるゲルからゲルへの変化を、最小限に抑えることができます。

<table><tbody><tr><td>32P ATP&nbsp;</td><td>パーキンエルマー</td><td>BLU002001MC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス二次抗体</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A-11003</td><td>Alexa-546標識</td></tr><tr><td>抗ウサギ二次抗体</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A11029</td><td>Alexa-488 標識</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Research Organics</td><td>1166A</td><td>in vitro キナーゼアッセイ用</td></tr><tr><td>Cdk1 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9112</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1 kinase buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020S</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td>EdU 標識</td></tr><tr><td>による細胞周期解析用COX IV抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>4844S</td><td>ミトコンドリア免疫染色用</td></tr><tr><td>サイクリンB1抗体</td><td>サンタクルーズバイオテクノロジー</td><td>sc-752</td><td></td></tr><tr><td>サイクリンB1/Cdk1酵素複合体</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>P6020S</td><td>凍結/融解を避ける</td></tr><tr><td>CyDye DIGE Fluorラベリングキット</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td>25-8009-83</td><td></td></tr><tr><td>DIGEゲルおよびDIGEバッファーキット</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td>28-9480-26AA</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルホルムアミド&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319937</td><td>DMF</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0611</td><td>DTT</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>EMD Millipore</td><td>71004</td><td>部位特異的変異導入用</td></tr><tr><td>Dpn I 酵素</td><td>Stratagene</td><td>200519-53</td><td>部位特異的変異導入用</td></tr><tr><td>ドライストリップカバー液</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1335-01</td><td>鉱物油として使用</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>4040-03</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>アクロス オーガニックス</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ 真空濃縮器</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>07-748-13</td><td>真空遠心分離濃縮器として使用</td></tr><tr><td>フルオロマウントG</td><td>サザン・バイオテック</td><td>0100-01</td><td>アンチフェードマウントソリューション</td></tr><tr><td>フォルテッサ・フローサイトメーター</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>649908</td><td>細胞周期用EdU標識による分析</td></tr><tr><td>Histone H1</td><td>Calbiochem</td><td>382150</td><td>in vitroキナーゼアッセイ用</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>アガロースゲルからDNA断片を精製するため</td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip Gels</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>18-1016-61</td><td>IEF(等電点電気泳動)ストリップ</td></tr><tr><td>固定化グルタチオン</td><td>Thermo Scientific</td><td>15160</td><td>グルタチオン-アガロースビーズ</td></tr><tr><td>ヨードアトアミド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>IAA</td></tr><tr><td>IPGphor 3 等電点集型装置</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>11-0033-64</td><td>IPGphor ストリップホルダー</td></tr><tr><td>イソプロピル-b-D-チオ-ガラクトピラノシド&nbsp;</td><td>RPI Corp</td><td>156000-5.0</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9783</td><td>細胞溶解バッファー用</td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>リジン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5501</td><td>CyDye 標識用</td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>EMD Chemicals</td><td>5960</td><td></td></tr><tr><td>Mitoctracker 赤/緑</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>M7512/M7514</td><td>ミトコンドリア蛍光色素</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>EMD Chemicals</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1</td><td>Clonetech</td><td>6085-1</td><td>GFP発現ベクター</td></tr><tr><td>Pfu</td><td>Stratagene</td><td>600-255-52</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-5X-1&nbsp;</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td>28-9545-53</td><td>GST発現ベクター</td></tr><tr><td>フェニルメチルスルホニルフッ化物</td><td>シェルトンサイエンティフィック</td><td></td><td>IB01090 PMSF</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>ライフサイエンステクノロジー</td><td>ズ 14040</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Spectra/Por 4透析チューブ</td><td>Spectrum Labs</td><td>132700</td><td>透析用多孔質膜チューブとして</td></tr><tr><td>Pro-Q ダイヤモンドリン酸化タンパク質ゲル染色</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ P-33300</td><td>2Dゲル上のリン酸化タンパク質の染色用</td></tr><tr><td>プロテイナーゼ阻害剤 カクテル</td><td>カルバイオケム</td><td>539134</td><td>細胞溶解バッファー用</td></tr><tr><td>QuikChange部位特異的突然変異導入キット</td><td>Stratagene</td><td>200519-5</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>MiniPrep プラスミド単離キット</td></tr><tr><td>RO-3306</td><td>Alexis Biochemicals</td><td>270-463-M001</td><td>Cdk1阻害剤</td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>MP Biomedicals 150154</td><td></td><td>Complex I阻害剤</td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S93359</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>EMDケミカルズ</td><td>SX0420-5</td><td>細胞溶解バッファー用</td></tr><tr><td>オルトバナジン酸ナトリウム</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>細胞溶解バッファー用</td></tr><tr><td>ピロリン酸ナトリウム十水和物</td><td>Alfa Aesar</td><td>33385</td><td>細胞溶解バッファー用</td></tr><tr><td>ナトリウム &β;-グリセロリン酸</td><td>Alfa Aesar</td><td>L03425</td><td>細胞溶解バッファー用</td></tr><tr><td>SpectraMax M2e&nbsp;</td><td>モレキュラーデバイス</td><td>M2E</td><td>マイクロプレートリーダー</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュグラインダー 乳棒</td><td>キンブルチェイス</td><td>885301-0007</td><td>ミトコンドリア分離用</td></tr><tr><td>ティッシュグラインダーチューブ</td><td>キンブルチェイス</td><td>885303-0007</td><td>ミトコンドリア分離用</td></tr><tr><td>トリクロロ酢酸溶液</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>T0699</td><td>TCA</td></tr><tr><td>Tris</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Teknova</td><td>T1105</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Calbiochem</td><td>650211</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-09</td><td>レーザーゲルスキャナー 2D-DIGE</td></tr><tr><td>Ubiquinone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7956</td><td></td></tr></tbody></table>

ミトコンドリア局在と原子力細胞周期キナーゼ、cdk1のの機能を研究するための実験的アプローチ

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

ミトコンドリアは独自の転写機構を持っていますが、ミトコンドリアタンパク質のわずか1%がオルガネラ内で合成されます。核にコードされたタンパク質は、ミトコンドリアターゲティング配列(MTS)によってミトコンドリアに輸送されます。しかし、ミトコンドリアに局在するタンパク質の大部分は、識別可能なMTSを欠いています。それにもかかわらず、MTS がタンパク質をミトコンドリアに入れるように指示できるという事実は、正常な核タンパク質および/または細胞質タンパク質のミトコンドリア機能を研究するための貴重なツールを提供します。私たちは最近、ミトコンドリアの細胞周期キナーゼCyclinB1/Cdk1複合体を同定しました。この複合体のミトコンドリア機能を特異的に研究するためには、この複合体の核機能や細胞質機能を妨げることなく、ミトコンドリアの過剰発現とノックダウンが不可欠でした。CyclinB1/Cdk1をMTSで標識することにより、この複合体のミトコンドリア過剰発現を達成し、そのミトコンドリア標的と機能を研究することができました。ドミナントネガティブCdk1をMTSでタグ付けすることにより、特にミトコンドリアでCdk1活性の阻害が達成されました。CyclinB1/Cdk1複合体の潜在的なミトコンドリア標的は、ゲルベースのプロテオミクスアプローチを使用して特定されました。従来の2Dゲル解析とは異なり、2次元差分ゲル電気泳動(2D-DIGE)技術とそれに続くリン酸化タンパク質染色を使用して、ミトコンドリアCdk1発現細胞中の差次的リン酸化タンパク質を蛍光標識しました。野生型とドミナントネガティブCdk1でミトコンドリアを持つヒト型で変化したリン酸化タンパク質スポットの同定により、Cdk1のミトコンドリア標的の同一性が明らかになりました。最後に、細胞周期の進行におけるCyclinB1/Cdk1ミトコンドリア局在の影響を判断するために、合成チミジン類似体EdU(5-エチニル-2′-デオキシウリジン)を使用した細胞増殖アッセイを使用して、細胞が細胞周期を通過し、DNAを複製するときに細胞をモニターしました。全体として、細胞周期キナーゼのミトコンドリア局在と活性を研究するために利用可能なさまざまなアプローチを実証しました。これらは高度でありながら、多くの細胞生物学研究者にとって有益な方法に従うのが簡単です。

サイクリンおよびCdk1ののサブミトコンドリア局在 炭酸ナトリウム抽出は、タンパク質がミトコンドリア内部又は外部表面、すなわち、外膜上に位置しているかどうかを決定するために使用されます。タンパク質は、ミトコンドリア内部で局在することが示されたら、サブミトコンドリア局在のさらなる決意は、プロテアーゼ消化と組み合わせmitoplastingを介して行うことができます。サイクリンまたはCdk1ののサブミトコンドリア局在を指定するには、ミトプラストは25 mmまでの200mMから浸透圧のスクロースの濃度を減少させて低張緩衝液中のミトコンドリアを希釈することによって単離しました。内膜は、ショ糖の25 mMの（ 図1A）での最終濃度まで無傷のまま外膜は、ショ糖の150 mMので破裂し始めます。 mitoplastingと組み合わせて、プロテアーゼ保護アッセイはtrypsを用いて行うことができます...

ここでは、(細胞周期)キナーゼのミトコンドリア局在を研究する方法と、その亜ミトコンドリア位置と潜在的なミトコンドリア基質/標的を決定する方法を概説します。タンパク質のミトコンドリアへの強制発現は、目的のタンパク質のミトコンドリア局在の機能的影響を研究するための有用なツールを提供します。

ミトコンドリア局在と原子力細胞周期キナーゼ、Cdk1のの機能を研究するための実験的アプローチ

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

以下の手順の全般的な目的は、通常は核に存在する細胞周期キナーゼのミトコンドリア内局在を決定し、そのミトコンドリアへの局在が細胞周期の進行にどのように影響するかを分析することです。この手法は、細胞周期中に核がどのようにミトコンドリアと通信しているかなど、ミトコンドリア研究分野における重要な疑問への答えを得るのに役立ちます。タンパク質にミトコンドリア移行シグナルを付加することで、ミトコンドリアにおける特定のタンパク質の過剰発現を利用でき、そのミトコンドリア特異的な機能を研究することが可能になります。この手法は、特定のタンパク質のミトコンドリアへの標的化に関する知見を得るために有用ですが、核、小胞体（ER）、ゴルジ体、リソソームなどの他のオルガネラにも適用可能です。テキストプロトコルに従って細胞の培養、ホモジナイズ、およびペレット化を行った後、上清を新しいチューブに移します。そして、サンプルを 7,000 g、4 °C で 10 分間遠心分離します。次に、200 µLの氷冷IBCバッファーを用いてペレットを再懸濁し、ホモジネートを2つの分注分に分けます。サンプルを再び7,000 g、4 °Cで10分間遠心分離します。そして、洗浄を繰り返します。上清を捨てた後、ペレットの1つに細胞溶解バッファーを30 µL加え、溶解物を-80 °Cで保存して免疫ブロットに用います。もう一方のペレットを用いて可溶性タンパク質と膜結合性タンパク質を分離するための炭酸ナトリウム抽出を行うには、0.1 M 炭酸ナトリウム（pH 11.0）を250 µL加え、氷上で30分間インキュベートします。その後、100,000 gで20分間遠心分離します。次に、上清を回収し、タンパク質を沈殿させるために、調製したばかりの20%トリクロロ酢酸を同量加えます。氷上で30分間保持します。その間に、ペレットに30 µLの細胞溶解バッファーを加え、テキストのプロトコルに従って超音波処理を行い、その後、イムノブロッティング用に-80 °Cで保存します。30分間のTCAインキュベーション後、反応液を15,000 gで10分間遠心分離します。上清を捨て、80 µLの細胞溶解バッファーを用いてペレットを再懸濁します。テキストプロトコルに記載の方法で細胞からミトコンドリア分画を単離した後、ミトコンドリア分画を10等分に分けます。サンプルを7,000 g、4 °Cで10分間遠心分離してペレット化します。トリプシンを含む、または含まない様々な濃度の低張ショ糖バッファーを30 µL使用して、各ペレットを溶解させます。その後、氷上で30分間インキュベートします。トリプシン消化を停止させるため、トリプシンを含むバイアルに10 millimolar PMSFを3 µL加えます。その後、氷上で10分間インキュベートします。サンプルを14,000 g、4 °Cで10分間遠心分離します。そして、上清を新しいチューブに移します。ペレットを溶解させるために、30 µLの細胞溶解バッファーを加えます。テキストプロトコルに記載されている通りにサンプルをソニケーションし、-80 °Cで保存します。ミトコンドリア標的型GFP/RFPタグ付きcyclinB-1 Cdk-1ベクターを構築するために、ヒトシトクロムcオキシダーゼサブユニット8A前駆体からミトコンドリア標的配列をクローニングし、標準的な分子クローニング手法を用いて、pEGFP-N1またはpERFP-N1のNhe1およびbAmH1部位でGFPまたはRFPのN末端とフレームを合わせて挿入します。テキストプロトコルに記載されたプライマーを使用し、標準的な手法に従ってCdk1およびcyclinB1遺伝子を増幅します。その後、BamH1を用いてPCR産物を消化します。反応物を1%アガロースゲルで電気泳動し、カミソリを使用して適切なサイズのDNA断片を切り出します。次に、ゲル抽出キットを用いてDNAを精製します。続いて、1 µgのMTS-pEGFP-N1およびMTS-pERFP-N1プラスミドを、1 µLのBamH1を用いて37 °Cで2時間消化します。次に、1 µLの calf intestinal alkaline phosphatase を加え、37 °C で30分間インキュベートします。消化産物を1% アガロースゲルで電気泳動し、前述の方法でDNAを精製した後、テキストプロトコルに記載されている試薬を用いてライゲーション反応を行います。その後、反応液を4 °C で一晩インキュベートします。ライゲーション混合液 10 µL を用いて e. coli dH5-alpha コンピテントセルを形質転換します。その後、10 mg/mL の kanamycin を添加した LB 寒天培地プレート上で、37 °C で一晩培養します。翌日、滅菌済みのピペットチップを使用してプレートからコロニーをピックアップします。そして、5 millilitersのLB kanamycinを含むチューブにチップを挿入します。培養液を一晩インキュベートし、翌朝、テキストのプロトコルに従ってミニプレップキットを使用してプラスミドを単離します。対数増殖期のMCF-10A細胞をトランスフェクションするには、Cdk1またはcyclinB-1プラスミドを用い、血清および抗生物質を含まない培地100 µL中で1:2の比率でプラスミドトランスフェクション試薬を調製します。細胞をトランスフェクションし、37 °Cで48時間インキュベートします。テキストプロトコルに従ってミトコンドリアを染色し、可視化します。セルソーティングを行うには、血清および抗生物質を含まない培地 2.5 milliliters で調製した DNA とトランスフェクション試薬を 1:2 の比率で用い、6ウェルプレート内の 2 times 10 to the 5th 個の細胞に目的のベクターをトランスフェクションします。トランスフェクション後 48 時間インキュベートし、テキストプロトコルに従ってフローサイトメトリーを用い、GFPタグ付き Cdk-1 および RFPタグ付き cyclinB1 タンパク質を安定的に発現している細胞をライブソートします。EdU ラベリングフローサイトメトリーアッセイを用いて細胞周期の長さを測定するには、ソートした細胞を 6ウェルプレートに 1ウェルあたり 2.5 times 10 to the 5th 個の密度で播種します。一晩インキュベートした後、最終濃度25 micromolarになるようにEdUを培地に追加し、さらに1時間インキュベートします。その後、2時間間隔で、500 microlitersのPBSに1%BSAを添加した溶液を用いて細胞のウェルを1つ洗浄します。そして、1.5-milliliterチューブに回収します。細胞を350 gで5分間遠心分離します。その後、上清を除去します。100 µLの固定液を加えてペレットを懸濁させます。十分に混ぜ合わせ、室温で15分間インキュベートします。次に、PBSで希釈した1%BSAを1 mL使用して、細胞を3回洗浄します。その後、70%エタノールを0.5 mL使用し、4 °Cで一晩細胞を固定します。GFPおよびRFPタグ付きタンパク質をトランスフェクトした細胞を用いてEdUラベル化を行う際は、GFPおよびRFPからの蛍光信号を消光させることが極めて重要です。これを達成するために、70% ethanolを用いた細胞のオーバーナイト固定という工程を追加します。翌日、テキストプロトコルに従って細胞の洗浄と透過処理を行った後、各チューブに0.5 millilitersの反応カクテルを加え、十分に混ぜ合わせます。暗所でのインキュベーション後、再度洗浄を行い、1%BSA含有PBSで調製した50 µg/mLのプロピジウムヨード（PI）を用いてDNAを染色します。フローサイトメトリーで細胞を解析し、EdU陽性集団を追跡します。DNA量およびEdUで染色したEdU標識細胞の散布図を提示します。Alexa 647 EdUには、685 nm未満のすべての光が透過する670 30-bandpassフィルターを用いたAPCチャネルを、PIには、600 nm未満のすべての光が透過する581 15-bandpassフィルターを用いたフィコエリスリンチャネルを使用します。標準的なゲーティング戦略を用いて、まず形態学的評価のためにFSC areaとSSC areaをプロットし、続いて細胞染色のためにPIとAlexa 647 EdUをプロットします。すべてのチューブのデータを順次記録し、1サンプルあたり10,000イベントを取得します。この図では、ミトコンドリアマトリックスタンパク質であるHsp60と、膜間腔タンパク質であるTimm13をミトコンドリア内局在マーカーとして使用しました。Timm13とは異なり、Hsp60と同様にcyclinB1およびCdk1はトリプシン消化から保護されており、これらがミトコンドリアマトリックスに局在していることが示されました。ここに示すように、MTSおよびGFPタグ付きのcyclinB1およびCdk-1コンストラクトを用いた分離ミトコンドリア画分のウェスタンブロッティングにより、ミトコンドリアにおけるcyclinB1および/またはCdk-1の過剰発現が達成されました。EdUパルスチェイスアッセイを用いて、野生型ミトコンドリアcyclinB1 Cdk-1を発現する細胞では、標識されたS期の細胞がG2M期を経て、早ければ4時間でG1期に現れることが示されました。これは、ベクターコントロールまたは変異型cyclinB1 Cdk-1を導入した細胞で6時間かかった場合と比較して、ミトコンドリアcyclinB1 Cdk-1の増強が細胞周期の進行を促進することを示唆しています。本手順の後、ミトコンドリアのATP産生、酸素消費量、膜電位、および活性酸素種の測定などの他の手法を用いることで、細胞周期キナーゼCdk-1のミトコンドリア局在が、ミトコンドリアの呼吸およびエネルギー出力にどのように影響するかといった追加の疑問を検討することが可能です。このビデオを視聴することで、核キナーゼのミトコンドリア局在およびミトコンドリア特異的な機能を研究する方法について、十分な理解を深めることができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

FRETに基づく記者はますます、生細胞におけるキナーゼとホスファターゼの活動を監視するために使用されています。ここでは、ターゲットのリン酸化の細胞周期依存性の変化を評価するためのFRETに基づくレポーターを使用する方法の方法を説明します。...

FRETはレシオメトリックで細胞周期のキナーゼおよびホスファターゼの活動を監視

全細胞集団の単一細胞レベルでサイクリンBの分解を勉強

ミトコンドリアの機能制御メカニズムを完全に理解するためには、ミトコンドリアの構造と機能の関係の分析が必要です。この論文では、生きたショウジョウバエの卵巣と固定された卵巣のミトコンドリアの構造と機能を研究するための具体的な方法について説明し、実証しています。...

ミトコンドリアの構造と機能の研究にショウジョウバエ卵巣

このプロトコルは、細胞分化およびアフリカツメガエル胚発生の間にマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）活性を調節するための光発生戦略を記載する。この方法は、哺乳動物細胞培養物およびアフリカツメガエル胚のような多細胞生きている生物において、高い空間的および時間的分解能を有するMAPKシグナル伝達経路の可逆的活性化を可能にする。...

細胞分化中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の光媒介可逆的調節<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚発生

高分解能共焦点顕微鏡を用いた解析に続いて HeLa 細胞の二重チミジン同期するためのプロトコルを提案します。このメソッドは、多数の有糸分裂、また界面機能を有する多機能性蛋白質の細胞分裂の役割の解明を可能にする S...

有糸分裂の多機能の細胞周期蛋白質の役割を研究する有糸分裂細胞同期と高分解能共焦点顕微鏡を組み合わせた

サイクリン依存性キナーゼ 1 (Cdk1) 細胞周期 G2 段階で活性化し、多くの細胞経路を調節します。この重要なキナーゼの細胞内標的を確立するため Cdk1 固有のリン酸化部位の同定を可能にする Cdk1...

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

ここでは、スピンドル形成と人工的進行のダイナミクスを評価するプロトコルを提示する。当社のタイムラプスイメージングの応用により、ユーザーは、人芽細胞の様々な段階で細胞を同定し、人芽細胞の欠陥を追跡および同定し、抗マイト薬への曝露時にスピンドルダイナミクスと人工細胞の運命を分析することができます。...

水動紡錘摂動後のメタフェイズタイミングと細胞運命のダイナミクスを評価するライブ細胞イメージング

ベーカーの酵母ミトコンドリアゲノムは8つのポリペプチドをコードする。現在のプロトコルの目的は、すべてのラベルを付け、後で別々のバンドとして視覚化することです。...

ベーカー酵母サッカロミセス・セレビシエにおけるミトコンドリアゲノム発現産物の表示と可視化

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この記事では、共焦点顕微鏡とImageJを使用して、Dendra2光スイッチング蛍光 を介して...

腎臓近位尿細管細胞におけるミトコンドリア分裂/融合ダイナミクスの評価

学ぶミトコンドリア局在解析法で細胞周期キナーゼCdk1の機能を研究する方法。ミトコンドリア標的配列を用いたタンパク質標識と分画分離技術により、核とミトコンドリアの相互作用を解明し、細胞周期制御メカニズムの理解を深めます。

ミトコンドリア局在と原子力細胞周期キナーゼ、Cdk1のの機能を研究するための実験的アプローチ

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