酵素結合Immunospotアッセイ（ELISPOT）：微生物の抗原に対してのTh - 1細胞​​性免疫応答の定量化

この手順の全体的な目標は、目的の抗原に対するT細胞応答を検出することです。これは、まず捕捉抗体を用いてコーディングすることで達成されます。手順の2番目のステップは、目的の細胞と抗原を追加し、一晩インキュベートすることです。

手順の3番目のステップは、検出抗体を追加することです。手順の最終ステップは、基質試薬を含むプレートを開発し、スポットを分析することです。最終的には、スポット形成単位の解析により、目的のサイトカインを選択した結果を得ることができます。

こんにちは、私の名前は Dr.Ki Richterで、ヴァンダービルト大学の感染症部門のワンダードレイク博士の研究室の研究講師です。本日は、酵素結合免疫スポットアッセイとしても知られるEllie Spot法を実演します。Dr.Isfahan chambersとTiffany Coneが今日あなたのためにテクニックを実演します。

細胞培養の基準を維持するために、フード内の無菌条件下で操作を行い、アリースポットプレートを開き、PBSで3回洗浄します。捕捉抗体のコーティング溶液をPBSに調製します。便宜上、ボルテックスでよく混ぜます。

抗体溶液をマルチチャンネル用のリザーバーに移し、ピペッターで100マイクロリットルのコーティング溶液をそれぞれに分注します。プレートをパーフィルでしっかりと密封し、冷蔵庫に一晩置きます。これらの抗体コーティングプレートは数週間有効です。

経験則では、ウェルにまだ液体が残っている場合はプレートを使用できるとされています。このアッセイのための細胞を準備するには、新たに分離された末梢血単核細胞をトリエンブルーで染色して生存率を確保し、それらをカウントします:pbmcを1ミリリットルあたり200万個の細胞で当社の10培地にプレートし、5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩インキュベートします。実験を追跡するために、Aliスポットプレートの蓋に試料識別番号、ウェル条件、日付をラベル付けします。

プレートを滅菌PBSで6回洗浄し、ダンプ&ブロット法で洗浄します。ダンプ中にプレートをはねかけないように注意してください、プレートのウェルが紫色に変わる可能性があります。各ウェルに20個の培地を加え、プレートを摂氏37度で1時間インキュベートします。

プレートのインキュベート中に、一晩休ませた細胞を数えます。遠心分離機でpbmcを収穫します。上清をデカントし、10培地にペレットを1ミリリットルあたり100万細胞の濃度で再懸濁します。

アリースポットプレートを1時間インキュベートした後、ダンプアンドブロット法を使用してR 20培地を取り出します。捨てるときにプレートをはねないように注意してください。それぞれに100マイクロリットルの細胞懸濁液を加えます。

ペプチドと抗原を対応するテストウェルに添加する実験デザインによく従います。ペプチドを含まない細胞のネガティブコントロールと、フィトヘマグルチニンを添加したポジティブコントロールウェルを常に含めます。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートし、5%の二酸化炭素とインキュベートします。

150マイクロリットルの1つのXPBSでプレートを6回洗浄します。プレートの各ウェルに100マイクロリットルのPBSを加え、プレートを冷蔵庫または室温で15分間置きます。その間、PBSでビオチン抗体溶液を調製します。

ALIスポットプレートを冷蔵庫から取り出し、PBSをフリックしてゴミ箱に捨てます。ビオチン抗体溶液を各ウェルに詰め込みながらプレートを飛沫させないように注意し、プレートを組織培養フード内で室温で1時間インキュベートします。最後の洗浄で、ダンプアンドブロット法を使用してPBSでプレートを6回洗浄します。

PBSをプレートに残しておきます。PBSでストレプトアビジン抗体溶液を調製し、溶液をボルテックスして混合するようにしてください。ウェルから最後のPBS洗浄液をよく捨て、ALIスポットプレートをプロットします。

各ウェルにストレプトアビジン抗体溶液を添加し、プレートを組織培養フード内で室温で1時間インキュベートします。余分なトレバン抗体を除去するためには、最後の洗浄でPBSでプレートを6回洗浄し、PBSをプレートにリードします。B-C-I-P-M-B-Tアルカリホスファターゼ基質溶液の光感度を考慮します。

アルカリホスファターゼ基質キットの説明書に記載されているように、ストーク溶液を調製するときは暗闇で作業し、ウェルから残りのPBSを廃棄し、lyスポットプレートを吸い取ります。各ウェルに基質溶液を添加し、ライトをオンにします。発色が5〜10分後、スポットが紫色に変わり始めてかなり暗くなるまで、試薬をプレート上に残します。

これには最大 20 分かかります。Aliスポットプレートを水道水で3回洗い、風乾させます。各プレートには、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、および最小限で二重に実施された目的のペプチドが含まれています。

ポジティブコントロールウェルは、細胞のコンフルエント層を反映した濃い紫色で、白い背景はほとんどありません。ネガティブコントロールウェルには、予想通り紫色の背景や斑点はありません。試験サンプルウェルは、ここで微生物ペプチドに対する細胞応答を示しています。

紫色の斑点は、LAスポット技術を実施する際に目的のサイトカインを発現する単一の応答性細胞を表しています。ピペットチップでメンブレンに穴を開けたり、プレートを乾燥させたりしないように注意してください。