酵素結合Immunospotアッセイ（ELISPOT）：微生物の抗原に対してのTh - 1細胞性免疫応答の定量化
2010年11月23日
特発性疾患における適応免疫の微生物のターゲットの同定、酵素結合immunospotアッセイの使用により達成することができます。
この手順の全体的な目標は、目的の抗原に対するT細胞応答を検出することです。これは、まず捕捉抗体を用いてコーディングすることで達成されます。手順の2番目のステップは、目的の細胞と抗原を追加し、一晩インキュベートすることです。
手順の3番目のステップは、検出抗体を追加することです。手順の最終ステップは、基質試薬を含むプレートを開発し、スポットを分析することです。最終的には、スポット形成単位の解析により、目的のサイトカインを選択した結果を得ることができます。
こんにちは、私の名前は Dr.Ki Richterで、ヴァンダービルト大学の感染症部門のワンダードレイク博士の研究室の研究講師です。本日は、酵素結合免疫スポットアッセイとしても知られるEllie Spot法を実演します。Dr.Isfahan chambersとTiffany Coneが今日あなたのためにテクニックを実演します。
細胞培養の基準を維持するために、フード内の無菌条件下で操作を行い、アリースポットプレートを開き、PBSで3回洗浄します。捕捉抗体のコーティング溶液をPBSに調製します。便宜上、ボルテックスでよく混ぜます。
抗体溶液をマルチチャンネル用のリザーバーに移し、ピペッターで100マイクロリットルのコーティング溶液をそれぞれに分注します。プレートをパーフィルでしっかりと密封し、冷蔵庫に一晩置きます。これらの抗体コーティングプレートは数週間有効です。
経験則では、ウェルにまだ液体が残っている場合はプレートを使用できるとされています。このアッセイのための細胞を準備するには、新たに分離された末梢血単核細胞をトリエンブルーで染色して生存率を確保し、それらをカウントします:pbmcを1ミリリットルあたり200万個の細胞で当社の10培地にプレートし、5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩インキュベートします。実験を追跡するために、Aliスポットプレートの蓋に試料識別番号、ウェル条件、日付をラベル付けします。
プレートを滅菌PBSで6回洗浄し、ダンプ&ブロット法で洗浄します。ダンプ中にプレートをはねかけないように注意してください、プレートのウェルが紫色に変わる可能性があります。各ウェルに20個の培地を加え、プレートを摂氏37度で1時間インキュベートします。
プレートのインキュベート中に、一晩休ませた細胞を数えます。遠心分離機でpbmcを収穫します。上清をデカントし、10培地にペレットを1ミリリットルあたり100万細胞の濃度で再懸濁します。
アリースポットプレートを1時間インキュベートした後、ダンプアンドブロット法を使用してR 20培地を取り出します。捨てるときにプレートをはねないように注意してください。それぞれに100マイクロリットルの細胞懸濁液を加えます。
ペプチドと抗原を対応するテストウェルに添加する実験デザインによく従います。ペプチドを含まない細胞のネガティブコントロールと、フィトヘマグルチニンを添加したポジティブコントロールウェルを常に含めます。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートし、5%の二酸化炭素とインキュベートします。
150マイクロリットルの1つのXPBSでプレートを6回洗浄します。プレートの各ウェルに100マイクロリットルのPBSを加え、プレートを冷蔵庫または室温で15分間置きます。その間、PBSでビオチン抗体溶液を調製します。
ALIスポットプレートを冷蔵庫から取り出し、PBSをフリックしてゴミ箱に捨てます。ビオチン抗体溶液を各ウェルに詰め込みながらプレートを飛沫させないように注意し、プレートを組織培養フード内で室温で1時間インキュベートします。最後の洗浄で、ダンプアンドブロット法を使用してPBSでプレートを6回洗浄します。
PBSをプレートに残しておきます。PBSでストレプトアビジン抗体溶液を調製し、溶液をボルテックスして混合するようにしてください。ウェルから最後のPBS洗浄液をよく捨て、ALIスポットプレートをプロットします。
各ウェルにストレプトアビジン抗体溶液を添加し、プレートを組織培養フード内で室温で1時間インキュベートします。余分なトレバン抗体を除去するためには、最後の洗浄でPBSでプレートを6回洗浄し、PBSをプレートにリードします。B-C-I-P-M-B-Tアルカリホスファターゼ基質溶液の光感度を考慮します。
アルカリホスファターゼ基質キットの説明書に記載されているように、ストーク溶液を調製するときは暗闇で作業し、ウェルから残りのPBSを廃棄し、lyスポットプレートを吸い取ります。各ウェルに基質溶液を添加し、ライトをオンにします。発色が5〜10分後、スポットが紫色に変わり始めてかなり暗くなるまで、試薬をプレート上に残します。
これには最大 20 分かかります。Aliスポットプレートを水道水で3回洗い、風乾させます。各プレートには、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、および最小限で二重に実施された目的のペプチドが含まれています。
ポジティブコントロールウェルは、細胞のコンフルエント層を反映した濃い紫色で、白い背景はほとんどありません。ネガティブコントロールウェルには、予想通り紫色の背景や斑点はありません。試験サンプルウェルは、ここで微生物ペプチドに対する細胞応答を示しています。
紫色の斑点は、LAスポット技術を実施する際に目的のサイトカインを発現する単一の応答性細胞を表しています。ピペットチップでメンブレンに穴を開けたり、プレートを乾燥させたりしないように注意してください。
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概要
この記事では、酵素結合免疫スポットアッセイを用いて特発性疾患における適応免疫の微生物標的の同定について説明します。この手順は特定の抗原に対するT細胞反応を検出することを目的としています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 免疫学
- 微生物学
- 適応免疫
背景
- 適応免疫は微生物感染への対応に重要な役割を果たします。
- T細胞反応を理解することで疾患メカニズムの特定に役立ちます。
- 酵素結合免疫スポットアッセイは免疫反応の分析に効果的です。
- 特発性疾患はしばしば明確な微生物関連がなく、この研究を重要なものにしています。
研究目的
- 特定の抗原に対するT細胞反応を検出すること。
- 特発性疾患に関連する微生物標的を同定すること。
- 適応免疫メカニズムの理解を深めること。
使用された方法
- カプチャー抗体でプレートをコーティングします。
- 対象となる細胞と抗原を加え、一晩インキュベーションします。
- 検出抗体を導入します。
- 基質試薬でプレートを開発し、スポット形成単位を分析します。
主要な結果
- 標的抗原に対するT細胞反応の成功的な検出。
- スポット形成単位の分析を通じた特定のサイトカインの同定。
- 適応免疫の微生物標的に関する洞察。
結論
- 酵素結合免疫スポットアッセイはT細胞反応を研究するための貴重なツールです。
- この研究結果は特発性疾患における免疫反応の理解に貢献します。
- さらなる研究により、これらの疾患における特定の微生物の役割が明らかになる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
ELISPOT enables quantitative assessment of antigen-specific T-cell responses, supporting target validation in infectious disease and autoimmune research. Its ability to distinguish Th1/Th2 profiles and detect responses in diverse sample types enhances mechanistic de-risking in early discovery. The assay provides predictive confidence for prioritizing microbial antigens in vaccine and therapeutic development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Quantifies cytokine-secreting T cells to validate microbial antigens as therapeutic targets.
- Operational Value: Enables functional interrogation of T-cell specificity and polarization in human samples.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing and biological de-risking of antigen candidates before lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, antigen-specific readouts via spot-forming units for assay standardization.
- Operational Value: Compatible with PBMC, BAL, CSF, and ascites, enabling flexible sample integration.
- Reproducibility: Duplicate well design and controlled incubation conditions support assay reliability across runs.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Tracks antigen-specific responses over time to correlate with disease states or treatment effects.
- Biomarker Alignment: Distinguishes Th1 vs Th2 cytokine profiles to inform immune mechanism of action.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables longitudinal monitoring of immune responses in preclinical and clinical models.
Pipeline & Workflow Integration
ELISPOT fits within the discovery continuum from target validation through preclinical immune monitoring, particularly for antigen-specific T-cell profiling.
- Discovery Biology: Supports interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying antigen-driven T-cell activation.
- Screening: Generates quantitative, reproducible outputs for evaluating antigen libraries or peptide pools.
- Analytics: Spot-forming unit analysis enables direct comparison of immune responses across conditions and timepoints.
- Translational Research: Connects early immune profiling to preclinical validation via longitudinal antigen-specific tracking.
- Enterprise Reuse: Platform-adaptable for multiple antigens, cytokines, and sample types across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into antigen-specific T-cell function and cytokine polarization.
- Operational Value: Standardized workflow with defined controls and incubation parameters ensures reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by de-risking target antigen immunogenicity early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antigens based on validated T-cell response magnitude and quality.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile cell handling, cytokine detection, and plate-based assay execution.
- Dependent on access to ELISA readers or imaging systems for spot quantification and antibody reagents.
- Necessitates standardization across teams for cell preparation, antigen dosing, and environmental controls.
- Adaptable to various sample types including PBMCs and biological fluids with appropriate processing.
- Limited by spot overlap at high cell densities and background from improper washing or plate drying.
