酵素結合Immunospotアッセイ（ELISPOT）：微生物の抗原に対してのTh - 1細胞​​性免疫応答の定量化

本手順の全体的な目的は、標的抗原に対するT細胞応答を検出することです。これは、まず捕捉抗体でコーティングすることで達成されます。手順の第2ステップでは、細胞と標的抗原を添加し、一晩インキュベートします。

本手順の第3ステップは、検出抗体を添加することです。最終ステップでは、基質試薬を用いてプレートを発色させ、スポットを解析します。最終的に、スポット形成単位（SFU）の解析を通じて、目的のサイトカインを選択し、結果を得ることができます。

こんにちは。私はDr.Ki Richterです。ヴァンダービルト大学感染症部門のDr.Wonder Drake研究室でリサーチインストラクターを務めています。本日は、ELISPOT法、別名酵素結合免疫スポットアッセイについて実演します。本日の実演は、Dr.Isfahan chambersとTiffany Coneが担当します。

細胞培養基準を維持するため、クリーンベンチ内の無菌条件下で操作を行い、アライスポットプレートを開封してPBSで3回洗浄します。PBSを用いてキャプチャー抗体のコーティング溶液を調製します。簡便にするため、ボルテックスミキサーで十分に混合してください。

抗体溶液をマルチチャンネルピペット用のリザーバーに移し、各ウェルにコーティング溶液を100 µLずつ分注します。プレートをパラフィルムで密封し、冷蔵庫で一晩静置します。これらの抗体コーティング済みプレートは数週間保存可能です。

経験則として、ウェル内に液体が残っていればプレートを使用できることになっています。本アッセイに向けて細胞を準備するため、採取直後の末梢血単核細胞をトリパンブルーで染色して生存率を確認し、細胞数を計測します。PBMCを10 mLの培地を用いて2 million cells/mLの密度でプレートに播種し、37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。実験管理のため、プレートの蓋に検体識別番号、ウェルの条件、および日付を記載してください。

滅菌済みPBSを用いて、プレートをダンプ＆ブロット法で6回洗浄します。ダンプする際にプレート内で液が跳ねないように注意してください。液が跳ねると、プレートのウェルが紫色に染まる可能性があります。各ウェルに20 µLの培地を加え、37 °Cで1時間インキュベートします。

プレートをインキュベートしている間に、一晩静置した細胞をカウントします。遠心分離によってPBMCを回収します。上清を捨て、ペレットを10 mLの培地で1 million cells/mLの濃度に再懸濁します。

アガローススポットプレートを1時間インキュベートした後、ダンプ＆ブロット法を用いてR 20培地を除去します。ダンプする際にプレート内で液が飛び散らないよう注意してください。その後、それぞれに細胞懸濁液を100 µL加えます。

ペプチドと抗原を対応するテストウェルに添加し、実験デザインに従って進めます。常にペプチドを添加しない細胞の陰性対照と、フィトヘマグルチニンを添加した陽性対照ウェルを含めてください。プレートを37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。

1x PBS 150 µLを用いて、プレートをダンプ・アンド・ブロット法で6回洗浄します。各ウェルにPBS 100 µLを加え、プレートを冷蔵庫または室温で15分間静置します。その間に、PBSでビオチン抗体溶液を調製します。

ALIスポットプレートを冷蔵庫から取り出し、PBSをゴミ箱に弾き飛ばして廃棄します。プレートを飛び散らせないように注意しながら、各ウェルにビオチン標識抗体溶液を分注し、組織培養フード内で室温で1時間インキュベートします。PBSを用いてプレートを6回洗浄し、最後の洗浄ではダンプ＆ブロット法で行います。

PBSをプレートに残したままにします。PBSを用いてSTREPTAVIDIN抗体溶液を調製し、ボルテックスで十分に混合してください。ウェルから最後のPBS洗浄液を廃棄し、ALIスポットプレートを配置します。

各ウェルにストレプトアビジン抗体溶液を加え、組織培養フード内で室温で1時間インキュベートします。過剰なストレプトアビジン抗体を除去するため、PBSでプレートを6回洗浄します。最後の洗浄では、ダンプ＆ブロット法を用いてPBSをプレートから除去します。B-C-I-P-M-B-Tアルカリホスファターゼ基質溶液は光に敏感であることに留意してください。

アルカリホスファターゼ基質キットの製造元の指示に従い、遮光下でストック溶液を調製します。ウェル内の残りのPBSを捨て、Dot blotプレートをブロットします。各ウェルに基質溶液を加え、照明をつけます。5〜10分間発色させた後、スポットが紫色に変わり、十分に濃くなるまで試薬をプレート上に保持します。

これには最大20分かかります。Aliスポットプレートを水道水で3回洗浄し、自然乾燥させます。各プレートには、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、および目的のペプチドが含まれており、それぞれ最低2連（duplicate）で実施します。

陽性対照ウェルは濃い紫色を呈しており、細胞がコンフルエントな層を形成し、白い背景がほとんどないことを示しています。陰性対照ウェルは、期待通りに紫色の背景やスポットが見られません。試験サンプルウェルは、ここでの微生物ペプチドに対する細胞応答を示しています。

紫色のスポットは、LAスポット法を実施した際に、目的のサイトカインを発現している単一の応答細胞を表しています。ピペットチップでメンブレンに穴をあけたり、プレートを乾燥させたりしないよう注意してください。これらはバックグラウンドの上昇につながります。