Name: 酵素結合Immunospotアッセイ（ELISPOT）：微生物の抗原に対してのTh - 1細胞性免疫応答の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: 学ぶELISPOTアッセイによるT細胞応答の検出法。捕獲抗体でプレートをコートし、細胞と抗原を添加してインキュベート後、検出抗体と基質試薬でスポットを可視化し、サイトカイン産生を定量化する。適応免疫の微生物標的同定に有用。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

研究資源、国立衛生研究所のナショナルセンターからバンダービルトCTSA助成金1 UL1 RR024975によって部分的にサポート。この作品は、NIHのR01 HL 83839によって賄われていた。R01 AI 65744。

次のプロトコルの場合、我々は目的の細胞として末梢血単核細胞（PBMC）を使用します。しかし、このプロトコルは、他の細胞型で使用できます。無菌操作を用いて組織培養フードのアッセイを実行します。 1日目：プレートと細胞の作製<ol><li> ELISPOTプレートを取り出し、フードで開きます。 </li><li>可能な場合、そうでない場合は、単一のよくピペッティングが許容される、マルチチャンネルピペッターを使用して1 × PBS 150μLでプレートを3回洗浄。 </li><li>貯水池のパッケージを取り出し、フードで開きます。 </li><li>濃度2μg/ mLの捕捉抗体の、抗ヒトインターフェロン-γ、11〜1 × PBSのMLS。を追加よく渦。貯水池への抗体のミックスを転送する。 </li><li>マルチチャンネルを使用して各ウェルにコーティング溶液の代わりに100μL。 </li><li>パラフィルムでプレートを包みます。 </li><li>一晩冷蔵庫にプレートを置きます。プレートは、週に適しています。経験則では、井戸の液体左がまだ存在する場合、プレートを使用できることです。 </li></ol>細胞の準備末梢血単核細胞が新鮮な場合はその後37℃で細胞をカウントし、一晩インキュベート° Cを5％CO 2で。液体窒素に保存されたPBMCの場合、細胞の凍結融解することが必要です。次のようにプロトコルは、次のとおりです。 <ol><li>ほぼ完全に融解するまで37でのセルのクライオバイアル℃の水浴を解凍。 </li><li>すぐにR10メディア5mLに懸濁します。 </li><li> 225 × gで5分間スピン</li><li> R10メディア5mLに再び懸濁し、トリパンブルーを用いて生細胞を数える。 </li><li> R10メディアに2 × 10 6細胞/ mLに濃縮をもたらす。 </li><li> ° C、5％CO 2で一晩37休憩。 </li></ol> 2日目：設定アッププレート<ol><li>検体の識別番号、うまく条件、および日付とラベルのプレートのふた。 </li><li>ダンプとブロット法を用いて滅菌1X PBSを150μLでプレートを6回洗浄する。ダンプしながらプレートを飛散しないように注意してください。これはプレートのウェルが紫にする可能性があります。 </li><li>各ウェルにR20 100μLを加える。 </li><li> 37プレート℃で1時間インキュベートします。 </li><li>プレートがインキュベートされている間、一晩休息された細胞を数える。 </li><li> 5分間1500rpmで細胞懸濁液をスピン。上清をデカントし、R10メディアに1mLの当たり1X10 6細胞の最終濃度を持つようにペレットを再懸濁します。 </li><li> 1時間のインキュベーションの後、R20ダンプとブロット法を用いて取り除く。ダンプしながらプレートを飛散しないように注意してください。 </li><li>各ウェルに細胞溶液100μL（10 5細胞）を追加します。重複しての対応するウェルに適切なペプチドおよび/または抗原を追加。新しいピペットチップ、あなたがペプチドワーキング溶液中に行くたびに使用してください。通常のペプチドの濃度は10〜40μg/ mLとなります。ペプチドが異なるため、各研究者が最適な結果を得るためにペプチドを滴定してください。 </li><li>ネガティブコントロールウェルでは、セルだけを（無ペプチド）を追加</li><li>ポジティブコントロールウェルでは、フィトヘマグルチニンを（、10μg/ mLの、シグマPHA）を追加。 </li><li> 37℃で一晩インキュベート° C、5％CO 2（〜18時間）。 </li></ol> 3日目：プレートの開発<ol><li>ダンプとブロット法を用いて150μL1xPBSでプレートを6回洗浄する。 </li><li>マルチチャンネルピペッターを使用してプレートの各ウェルに100μLのPBSを追加。 </li><li> 15分間冷蔵庫にプレートを置く。 </li><li>冷蔵庫の外板を取り出し、組織培養フードに入れてください。 </li><li>ビオチン抗体溶液を準備する<ul><li> 11mL PBSにビオチンの抗体0.5μg/ mLの（MAB 7 - B6 - 1）を追加します。 </li><li>渦うまくミックスするソリューション。 </li><li>マルチチャンネルを使用してソリューションを追加することを計画している場合、貯水池にそれを注ぐ。 </li></ul></li><li>くずかごにそれをフリックでPBSを捨ててください。ダンプしながらプレートを飛散しないように注意してください。 </li><li>各ウェルに溶液100μLを置きます。 </li><li> 1時間室温で組織培養フードにプレートをインキュベートする。 </li><li>ダンプとブロット法を用いて150μL1xPBSでプレートを6回洗浄する。あなたがストレプトアビジン抗体を準備するまで6 回の洗浄では、プレートにPBSを残す。 </li><li>ストレプトアビジン抗体を準備します。 <ul><li> 11mL PBS（1:2000希釈）、5.5μlのストレプトアビジン抗体（ストレプトアビジン- ALP）を追加します。 </li><li>渦うまくミックスするソリューション。 </li><li>マルチチャンネルを使用してソリューションを追加することを計画している場合、貯水池にそれを注ぐ。 </li></ul></li><li>プレートに残ったPBSを捨て、プレートを覆い隠す。 </li><li>各ウェルにストレプトアビジン溶液100μLを加える。 </li><li> 1時間室温で組織培養フードにプレートをインキュベートする。 </li><li> PBSは、ダンプとブロット法を用いてプレートを6回洗浄する。あなたが色のソリューションを確保するまでの6 番目の洗浄では、プレートにPBSを残す。 </li><li>暗闇の中で働く。アルカリホスファターゼの基質溶液（アルカリフォスファターゼ基質キットIV BCIP / NBT）を準備します。 <ul><li>基質試薬1〜11 mLのトリス緩衝液、よく渦の4滴を追加します。トリス緩衝液、よくボルテックスする基質試薬2の4滴を追加します。トリス緩衝液、よくボルテックスする基質試薬3の4滴を追加します。 </li></ul></li><li>残りのPBSを捨て、プレートを覆い隠す。 </li><li>マルチチャンネルを使用してプレートの各ウェルに色溶液100μLを加える。 </li><li>発色の5〜10分後にライトをオンにします。 </li><li>スポットがパープルに変わり始めるとかなり暗くなるまで、色試薬はプレートにしておくことができます。これは、5〜20分くらいかかりますがあります。そうする高いバックグラウンドを引き起こす可能性があるため長すぎるの基質溶液を残さないように注意してください。 </li><li>水道水でELISPOTプレートを3回洗浄。 </li><li>約時間または一晩乾燥さおきます。 </li><li>手動またはELISPOTプレートリーダーでプレートをお読みください。 </li><li>露光から離れボックスでプレートを保管してください。 </li></ol>代表的な結果： ELISPOTは、微生物抗原に対する免疫応答を定量化するために設計されています。各スポットには、興味のあるサイトカインを表現する、単一の応答性細胞を示している。スポットは、手動またはELISPOTプレートリーダーを使用してカウントすることができます。 ELISPOTが正しく行われていることを評価に関心のサイトカインの背景に生産のための陰性対照の調査から始める必要があります。少し背景（紫色）が存在する可能性はありますがネガティブコントロールウェルでは、1つは、ないのスポットを表示しないことを期待する。一般的に、よくあたり5箇所の平均よりも小さいがあるはずです。ポジティブコントロールのウェルは、反応が正しく行われていること、および細胞が抗原刺激に応答することを確認してください。ポジティブコントロールウェルでは、スポット（Fig1）の合流により、深い紫色の背景を見ることが期待される。ない白い背景はほとんどないはずです。ポジティブコントロールとネガティブコントロールサンプルが適切である場合、一つは、目的の抗原を含むウェルをカウントできます。 "次善の"結果は、高バックグラウンド（井戸は紫）、無斑または非常に少数の斑点、ブランクセンター、不十分な定義スポットまたはコンフルエントスポットが反映されます。トラブルシューティングのヒントのリストは、（表1）提供されています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/2221/2221fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。ELISPOTプレートの代表。各プレートは2つのウェル内で最低で行われたポジティブコントロール、ネガティブコントロールと目的のペプチドが含まれている必要があります。深い紫色、コンフルエント細胞とほとんどない白色の背景があるかあなたが見ることができるようにC9、C10、D9とD10は、陽性コントロールウェルです。ネガティブコントロールのウェルは、G11、G12、H11とH12です。これらの井戸は紫色の背景と、期待どおりのないスポットがありません。スポットG7、G8、H7やH8は、微生物ペプチドに対する細胞応答を示し、紫色の斑点は、関心のサイトカインを発現している単一の応答性細胞を表しています。 表1 <table border="1"><tbody><tr><td>観測</td><td>可能な問題</td><td>考えられる解決方法</td></tr><tr><td>高いバックグラウンド</td><td> 1。膜の両側には、適切に洗浄しない 2。あまりにも多くの細胞が分泌するサイトカイン 3。プレートは、適切に乾燥しない 4。開発したプレート上に</td><td> 1。発色の前と後の蒸留水で膜の両面を洗います。試薬は、プレートの底に膜を介して漏洩する可能性があります、と洗い流されていない場合は、これらは、高いバックグラウンドを引き起こす可能性があります。 2。ウェルあたりの細胞数を減らす、これは最適化が必要になります 3。読む前にプレート長く乾燥させる 4。開発時間を短縮</td></tr><tr><td>いいえスポットなし/非常に少数のスポット</td><td> 1。興味のない十分な細胞が分泌するサイトカイン/タンパク質 2。細胞が正しく刺激されていることを確認 3。 lを格納するためにインキュベートしていない細胞十分なオングや刺激への応答に時間がかかることがあります 4。不十分な発色 5。十分な一次または二次抗体</td><td> 1。セルの数を増やします。これは、最適化が必要になります 2。また、正の刺激のコントロールを使用してください - あなたが知っている興奮剤は、目的のサイトカイン/タンパク質の発現を誘導する 3。細胞のインキュベーション時間を増やすか、または間接的な方法を（覚せい剤による前御馳走細胞）を使用してください 4。オーバーヘッド顕微鏡で発色を監視し、開発する試薬が正しく保存されていると活性を失っていないことを確認してください 5。プライマリおよび/または二次抗体の濃度が増加する必要があります。これは、最適化が必要になります。 </td></tr><tr><td>ブランクエリア</td><td> 1。膜前処理ではない 2。膜は、いくつかの段階で乾いている 3。細胞が偏在</td><td> 1。膜は、70％エタノール（すべての膜はこのようにあなたのサプライヤーに確認は必要ありません）と十分に前処理であることを確認してください。その後PBS 3Xでよく洗う 2。膜が乾燥しないように 3。あなたが井戸に出てピペッティングの前に良い相同な細胞懸濁物を持つように穏やかに細胞を混ぜていることを確認</td></tr><tr><td>ブランクセンター</td><td> 1。洗濯による被害</td><td> 1。自動洗濯機（またはピペッティング）で流量が高すぎる可能性があります。もっと穏やかに洗浄の手順を必要とする</td></tr><tr><td>偽陽性</td><td> 1。二次抗体の凝集体 2。まだ膜上で細胞 3。細胞培養の汚染</td><td> 1。二次抗体をフィルタリング 2。すべての細胞は二次抗体のインキュベーションの前にPBS Tween 20を有する膜から洗浄されていることを確認します。メンブレン上に残って細胞は不規則な形の斑点を与える 3。可能な限り無菌でクリーンな試薬を保管してください。あなたの細胞培養技術は無菌であることを確認してください。メディアのネガティブコントロールを実行することにより、偽陽性を確認してください。プレート運動のために、 <a href="http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&amp;rid=11457#7">不完全に定義されたスポットを参照してください。</a> </td></tr><tr><td>コンフルエントスポット</td><td> 1。貧しいコーティング、あまりにも多くの抗体 2。長期細胞培養 3。細胞が過剰刺激</td><td> 1。一次抗体の濃度を減少させる 2。長い細胞がインキュベートされ、より多くのサイトカイン/タンパク質、それらが分泌されます。これは、マージと区別がつかないになるために開始される大規模なスポットになります。 3。細胞培養工程のインキュベーション時間を減らす。過剰刺激は、細胞によって分泌されるサイトカイン/タンパク質の多くになります。これは、マージと区別がつかないになるために開始されるスポットを生成します。短い時間のための培地または培養で刺激の量を減らす</td></tr><tr><td>不完全定義されたスポット</td><td> 1。膜ではない前処理は、（あなたの膜がこれを必要とする場合、供給者に確認してください） 2。細胞のインキュベーション中に、プレートの動き</td><td> 1。膜をエタノールで前処理する必要がありますかこれはファジー、不十分な定義のスポットになる可能性があります。読者はこれらを区別することは難しいだろう 2。プレートは複数のスポットを作成するに移動している細胞と細胞のインキュベーション中に移動させないようにしてください。可能であれば、インキュベーション中には開かれません、専用のインキュベーターを使用してください。セルを追加した後にプレートをタップしないでください。 </td></tr><tr><td>ポジティブコントロールのウェルは低いです。 </td><td> 1。低開発は - ストレプトアビジン- ALPおよび/または室温に移されていないBCIP / NBTソリューションを使用しての結果である可能性があります</td><td> 1。ウェルに追加する前に室温に試薬をもたらす</td></tr><tr><td>スポットの密度は、それが困難なそれらを定量化することができます</td><td> 1。あまりにも多くの細胞がウェルに添加した</td><td> 1。明確なスポットの形成につながる細胞の最適な数を決定するために、細胞の希釈（すなわち、1 × 10 6、5 × 10 5、1 × 10 5、5 × 10 4、1ウェルあたり× 10 4細胞）を作る</td></tr></tbody></table>

<ol><li>Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+diagnostic+evaluation+of+suspected+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis.</a> Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).</li>
<li>Sung, H. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+abdominal+tuberculosis+by+T-cell+based+assays+on+peripheral+blood+and+peritoneal+fluid+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of abdominal tuberculosis by T-cell based assays on peripheral blood and peritoneal fluid mononuclear cells.</a> Journal of Infection. 59, 409-415 (2009).</li>
<li>Kim, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+Central+Nervous+System+Tuberculosis+by+T-Cell-Based+Assays+on+Peripheral+Blood+and+Cerebrospinal+Fluid+Mononuclear+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of Central Nervous System Tuberculosis by T-Cell-Based Assays on Peripheral Blood and Cerebrospinal Fluid Mononuclear Cells.</a> Clinical and Vaccine Immunology. , 1356-1362 (2008).</li>
<li>Drake, W. P., Dhason, M. S., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Vadivelu, S., Hajizadeh, R., Newman, L. S., Kalams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+recognition+of+Mycobacterium+tuberculosis+ESAT-6+and+KatG+peptides+in+systemic+sarcoidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Cellular recognition of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and KatG peptides in systemic sarcoidosis.</a> Infect Immun. 75, 527-530 (2007).</li>
<li>Allen, S. S., Evans, W., Carlisle, J., Hajizadeh, R., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Pride, D. T., Johnson, J. E., Drake, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+A+antigens+derived+from+molecular+analysis+of+sarcoidosis+granulomas+elicit+systemic+Th-1+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase A antigens derived from molecular analysis of sarcoidosis granulomas elicit systemic Th-1 immune responses.</a> Respir Res. 25, 36-36 (2008).</li>
<li>Mutsvangwa, J., Millington, K. A., Chaka, K., Mavhudzi, T., Cheung, Y. B., Mason, P. R., Butterworth, A. E., Corbett, E. L., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+recent+Mycobacterium+tuberculosis+transmission+in+the+setting+of+high+HIV+and+TB+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Identifying recent Mycobacterium tuberculosis transmission in the setting of high HIV and TB burden.</a> Thorax. 65, 315-320 (2010).</li>
<li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat Protoc. 4, 461-469 (2009).</li>
<li>Chaudhary, N., Staab, J. F., Marr, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+human+T-Cell+Responses+to+Aspergillus+fumigatus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Healthy human T-Cell Responses to Aspergillus fumigatus antigens.</a> PLoS One. 5, e9036-e9036 (2010).</li>
<li>Manigold, T., Mori, A., Graumann, R., Llop, E., Simon, V., Ferr, S. M., Valdivieso, F., Castillo, C., Hjelle, B., Vial, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+differentiated%2C+resting+gn-specific+memory+CD8%2B+T+cells+persist+years+after+infection+by+andes+hantavirus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Highly differentiated, resting gn-specific memory CD8+ T cells persist years after infection by andes hantavirus.</a> PLoS Pathog. 6, e1000779-e1000779 (2010).</li>
<li>Ndongala, M. L., Kamya, P., Boulet, S., Peretz, Y., Rouleau, D., Tremblay, C., Leblanc, R., Côté, P., Baril, J. G., Thomas, R., Vézina, S., Boulassel, M. R., Routy, J. P., Sékaly, R. P., Bernard, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+function+of+HIV-specific+T-cell+responses+with+increasing+time+from+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viral+Immunol%22%5BJournal%5D)">Changes in function of HIV-specific T-cell responses with increasing time from infection.</a> Viral Immunol. 2, 159-168 (2010).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ELISPOTアッセイは、ヒトおよび他の種の様々な免疫応答を監視するために最も重要で広く使用されているアッセイの一つとして浮上している。 ELISPOTアッセイにより、免疫細胞の頻度は、細胞集団の拡大または操作することなく、単一細胞レベルで測定することができます。 ELISPOTアッセイは広く感染症、がん、アレルギー、自己免疫疾患を含む種々の疾患で抗原特異的免疫応答を調査するために適用されています。このアッセイのアプリケーションは、主に抗原特異的細胞の定量が重要かなどの抗生物質療法1の前または後に結核などの様々な疾患の状態、内の特定の抗原に対する免疫応答の比較である研究に応用されている。しかし、最近の報告では、このアッセイはそのような腹水、脳脊髄液または気管支肺胞洗浄液などの絶縁された細胞物質内で抗原特異的T細胞の頻度を検出するために使用されることが示されている。ソンハンキムら。アル。腹部結核が疑われる患者由来のPBMCをELISPOTアッセイを使用して、アクティブな腹部結核2を診断するための89％の感度があることが示されている。また、T細胞ベースのELISPOTアッセイは、末梢血と髄液単核...

メディアのA.の準備<img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsA.jpg" alt="材料">トリス緩衝液のB.準備<ol><li> 1リットルのビーカーにのddH 2 O 800mlを追加します。 </li><li>トリスの12グラムを測定し、ビーカーに加える。 </li><li>ビーカーに：塩化マグネシウム六水和物の0.12グラム（6H 2 O のMgCl 2）を追加します。 </li><li>自動攪拌プレート上で磁気撹拌棒で撹拌する。 </li><li>一度9.5に解決策は、pH、溶解した。 </li><li> 1000mLにそれを育て、ビーカーにのddH 2 O 200mLを追加します。 </li><li> 0.22μmのフィルターを備えたソリューションをフィルタリングする。 </li></ol> ELISPOT解析に必要なC.材料： <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsb.jpg" alt="材料B">

酵素結合immunospotアッセイ（elispot）：微生物の抗原に対してのth - 1細胞​​性免疫応答の定量化

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

適応免疫は、細胞内病原体のクリアランスに重要なコンポーネントです。ヒトではこれらの応答を検出し、定量化する能力は重要な診断ツールです。酵素結合immunospotアッセイ（ELISPOT）は、HIV感染、移植患者など免疫抑制集団、およびステロイドの使用を含む、微生物抗原に対して細胞性免疫応答を識別する能力のため人気を集めている。このアッセイは、特定の微生物の抗原に対する免疫応答を定量化する能力を有し、同様にこれらの応答がTh1または文字のTh2のかどうか区別する。 ELISPOTは、炎症部位に限定されるものではない。それは、末梢血、だけでなく、気管支肺胞洗浄液、脳脊髄液、腹水など、積極的な関与のサイト内での免疫応答のために評価する能力に汎用性があります。単一または複数の抗原に対する免疫応答の検出が可能であるだけでなく、微生物のタンパク質内の特定のエピトープ。このアッセイは、時間の経過とともに免疫応答の検出だけでなく、ホストのT細胞が認識する抗原の違いを容易にします。デュアルカラーELISPOTアッセイは、2つのサイトカインの同時発現の検出のために用意されています。このテクニックのための最近のアプリケーションは、肺外結核の診断だけでなく、自己免疫疾患に感染抗原の寄与の検討が含まれています。

特発性疾患における適応免疫の微生物のターゲットの同定、酵素結合immunospotアッセイの使用により達成することができます。

酵素結合Immunospotアッセイ（ELISPOT）：微生物の抗原に対してのTh - 1細胞​​性免疫応答の定量化

獲得免疫は、細胞内病原体の排除において重要な構成要素です。ヒトにおいてこれらの応答を検出し定量する能力は、...

本手順の全体的な目的は、標的抗原に対するT細胞応答を検出することです。これは、まず捕捉抗体でコーティングすることで達成されます。手順の第2ステップでは、細胞と標的抗原を添加し、一晩インキュベートします。本手順の第3ステップは、検出抗体を添加することです。最終ステップでは、基質試薬を用いてプレートを発色させ、スポットを解析します。最終的に、スポット形成単位（SFU）の解析を通じて、目的のサイトカインを選択し、結果を得ることができます。こんにちは。私はDr.Ki Richterです。ヴァンダービルト大学感染症部門のDr.Wonder Drake研究室でリサーチインストラクターを務めています。本日は、ELISPOT法、別名酵素結合免疫スポットアッセイについて実演します。本日の実演は、Dr.Isfahan chambersとTiffany Coneが担当します。細胞培養基準を維持するため、クリーンベンチ内の無菌条件下で操作を行い、アライスポットプレートを開封してPBSで3回洗浄します。PBSを用いてキャプチャー抗体のコーティング溶液を調製します。簡便にするため、ボルテックスミキサーで十分に混合してください。抗体溶液をマルチチャンネルピペット用のリザーバーに移し、各ウェルにコーティング溶液を100 µLずつ分注します。プレートをパラフィルムで密封し、冷蔵庫で一晩静置します。これらの抗体コーティング済みプレートは数週間保存可能です。経験則として、ウェル内に液体が残っていればプレートを使用できることになっています。本アッセイに向けて細胞を準備するため、採取直後の末梢血単核細胞をトリパンブルーで染色して生存率を確認し、細胞数を計測します。PBMCを10 mLの培地を用いて2 million cells/mLの密度でプレートに播種し、37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。実験管理のため、プレートの蓋に検体識別番号、ウェルの条件、および日付を記載してください。滅菌済みPBSを用いて、プレートをダンプ＆ブロット法で6回洗浄します。ダンプする際にプレート内で液が跳ねないように注意してください。液が跳ねると、プレートのウェルが紫色に染まる可能性があります。各ウェルに20 µLの培地を加え、37 °Cで1時間インキュベートします。プレートをインキュベートしている間に、一晩静置した細胞をカウントします。遠心分離によってPBMCを回収します。上清を捨て、ペレットを10 mLの培地で1 million cells/mLの濃度に再懸濁します。アガローススポットプレートを1時間インキュベートした後、ダンプ＆ブロット法を用いてR 20培地を除去します。ダンプする際にプレート内で液が飛び散らないよう注意してください。その後、それぞれに細胞懸濁液を100 µL加えます。ペプチドと抗原を対応するテストウェルに添加し、実験デザインに従って進めます。常にペプチドを添加しない細胞の陰性対照と、フィトヘマグルチニンを添加した陽性対照ウェルを含めてください。プレートを37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。1x PBS 150 µLを用いて、プレートをダンプ・アンド・ブロット法で6回洗浄します。各ウェルにPBS 100 µLを加え、プレートを冷蔵庫または室温で15分間静置します。その間に、PBSでビオチン抗体溶液を調製します。ALIスポットプレートを冷蔵庫から取り出し、PBSをゴミ箱に弾き飛ばして廃棄します。プレートを飛び散らせないように注意しながら、各ウェルにビオチン標識抗体溶液を分注し、組織培養フード内で室温で1時間インキュベートします。PBSを用いてプレートを6回洗浄し、最後の洗浄ではダンプ＆ブロット法で行います。PBSをプレートに残したままにします。PBSを用いてSTREPTAVIDIN抗体溶液を調製し、ボルテックスで十分に混合してください。ウェルから最後のPBS洗浄液を廃棄し、ALIスポットプレートを配置します。各ウェルにストレプトアビジン抗体溶液を加え、組織培養フード内で室温で1時間インキュベートします。過剰なストレプトアビジン抗体を除去するため、PBSでプレートを6回洗浄します。最後の洗浄では、ダンプ＆ブロット法を用いてPBSをプレートから除去します。B-C-I-P-M-B-Tアルカリホスファターゼ基質溶液は光に敏感であることに留意してください。アルカリホスファターゼ基質キットの製造元の指示に従い、遮光下でストック溶液を調製します。ウェル内の残りのPBSを捨て、Dot blotプレートをブロットします。各ウェルに基質溶液を加え、照明をつけます。5〜10分間発色させた後、スポットが紫色に変わり、十分に濃くなるまで試薬をプレート上に保持します。これには最大20分かかります。Aliスポットプレートを水道水で3回洗浄し、自然乾燥させます。各プレートには、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、および目的のペプチドが含まれており、それぞれ最低2連（duplicate）で実施します。陽性対照ウェルは濃い紫色を呈しており、細胞がコンフルエントな層を形成し、白い背景がほとんどないことを示しています。陰性対照ウェルは、期待通りに紫色の背景やスポットが見られません。試験サンプルウェルは、ここでの微生物ペプチドに対する細胞応答を示しています。紫色のスポットは、LAスポット法を実施した際に、目的のサイトカインを発現している単一の応答細胞を表しています。ピペットチップでメンブレンに穴をあけたり、プレートを乾燥させたりしないよう注意してください。これらはバックグラウンドの上昇につながります。

enzyme-linked-immunospot-assay-elispot-quantification-th-1-cellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ヒトパピローマウイルスなどの局所感染を引き起こす病原体のT細胞エピトープを特性解析することは、血中に存在するT細胞数が限られているため困難です。本手法では、ごく少数の細胞から希少なT細胞を単離し、その特性を解析する方法について説明します。...

ヒトパピローマウイルスの新規T細胞エピトープを特徴付けるために、インターフェロン-γ酵素結合Immunospotアッセイの使用

このビデオでは、ELISpotアッセイを使用して抗体分泌B細胞(ASC)の機能を評価する方法を示しています。ASCから分泌された抗体は、膜結合ポリクローナル抗体フラグメントと相互作用し、酵素標識IgGまたはIgM抗体によって検出されます。各ウェルに生成された色付きのスポットは、B細胞の分泌活性と相関する特定の抗体のアイソタイプの存在を示しています。...

ELISpotアッセイを用いた抗体分泌B細胞の機能評価

単一細胞レベルでのサイトカイン産生を検出し、T細胞応答の両方の定量的および定性的特徴づけを提供するようなγインターフェロン（IFN-γ）のELISpotのような機能アッセイの新規世代水痘帯状疱疹に対して向けられた細胞性免疫応答を評価するために使用することができるウイルス（VZV）。...

臍帯血移植後の水痘帯状疱疹ウイルス特異的細胞性免疫を評価するために、IFN-γELISPOTアッセイの開発

長期培養インターフェロンγ酵素結合免疫アッセイは、中央メモリー応答の尺度として用い、保護抗マイコバクテリアワクチン応答と相関されます。このアッセイでは、末梢血単核細胞を、分化、中央メモリーT細胞の拡大を可能にする、14日間マイコバクテリア抗原およびインターロイキン2で刺激します。...

牛にエフェクターおよびメモリーT細胞応答を評価するための長期培養インターフェロンγ酵素結合免疫アッセイの応用

ヒト末梢血は、体液性免疫応答の評価に一般的に使用されます。ここでは、末梢血からヒトB細胞を単離する方法、培養中のヒトB細胞を抗体(Ab)分泌B細胞(ASC)に分化させる方法、およびELISpotアッセイによる総IgM-およびIgG-ASCの列挙方法について説明します。...

単離、分化、および血液からヒト抗体を分泌するB細胞の定量化：体液性免疫の機能読み出しなどのELISpot

Qa-1 (人間の HLA E) は、クラシック以外の主要な組織適合性の複雑な 1 b 分子のグループに属しています。Qa-1 結合エピトープと予防接種はティッシュ特定の免疫制御が強化され、いくつかの自己免疫疾患を改善するのに示されています。本蛋白質の Qa 1 エピトープの同定のため重複のペプチド...

蛋白質の Qa 1 エピトープをマップするペプチド ライブラリを重複

本稿では elisa 法を用いたマウスの T に依存し、T 独立免疫グロブリン (Ig) アイソタイプを特徴付けるためのプロトコルについて述べる.このメソッドは、単独で使用またはフローと組み合わせてフローサイトメトリーは T に依存し、T 独立した抗原免疫したマウスの B 細胞の Ig...

酵素抗体法を用いたマウスにおける胸腺依存性および胸腺非依存性免疫グロブリン アイソタイプ反応の評価

モルモット PBMCs のインターフェロン-γ しなさい測定法の開発では、感染症を研究するためこの関連性の高いモデルで T 細胞の反応特性をことができます。我々 は、関連付けられている DNA ワクチンの皮内送達 T...

ワクチン接種後のモルモット モデル メジャー T 細胞反応に最適化されたインターフェロン-γ しなさいアッセイ

ここでは、元のプロトコルを提案生体内抗原特異的 CD8 の定性的検出+ T 細胞。分析は、単一細胞懸濁液の臓器や血液量が少ないからで可能です。広範な研究には、細胞傷害性 T 細胞の反応 (予防接種・癌免疫療法研究)...

反ベクトルと反遺伝子特定 CD8 の同時定量+ T はマイク ウイルスベクターを用いたワクチン後染色テトラマー MHC を介して細胞

このプロトコルは、ナノエマルジョンオフィオポゴニンDアジュバントが効果的な細胞性免疫応答を促進するかどうかを評価するための詳細な方法を提示する。...

インビトロ ナノエマルジョンワクチンアジュバントオフィオポゴニンDの細胞活性評価

学ぶELISPOTアッセイによるT細胞応答の検出法。捕獲抗体でプレートをコートし、細胞と抗原を添加してインキュベート後、検出抗体と基質試薬でスポットを可視化し、サイトカイン産生を定量化する。適応免疫の微生物標的同定に有用。

酵素結合Immunospotアッセイ（ELISPOT）：微生物の抗原に対してのTh - 1細胞​​性免疫応答の定量化

さらに動画を探す

酵素結合Immunospotアッセイ（ELISPOT）：微生物の抗原に対してのTh - 1細胞性免疫応答の定量化