牛にエフェクターおよびメモリーT細胞応答を評価するための長期培養インターフェロンγ酵素結合免疫アッセイの応用

この手順の全体的な目標は、エフェクターとメモリーの両方のT細胞応答を、それぞれ短期および長期の培養インターフェロンγLスポットアッセイを使用して評価することです。中枢記憶応答の評価は、抗原刺激下でウシ末梢血単核細胞を13日間培養することによって達成されます。長期培養により、エフェクターT細胞の応答が起こり、減少します。

インターロイキン2を培養液に添加し、メモリーT細胞の維持に充てる。13日目に、長期細胞をIFNガンマキャプチャ抗体でコーティングしたLスポットプレートに移します。個々のマイコバクテリア抗原に対する長期細胞の応答は、自家抗原提示細胞の存在下または非存在下で評価されます。

APC APCは、13日目に付着することにより、新鮮なp BMCから単離されます。さらに、ex vivo条件下で新たに単離されたpbmcの応答は、エフェクター応答の相関として評価されます。いくつかの研究では、ワクチン接種後のマイコバクテリア抗原に対するウシの長期培養スボット応答は、ワクチンの有効性と正の相関があることが示されています。

また、長期T細胞培養は、ヒトとウシの両方で主に中枢記憶T細胞を含んでいます。長期培養Lスポットアッセイを実施するために、mボビスに感染した動物またはワクチン接種された動物から60mlの血液を頸静脈によって採取し、静脈穿刺およびP BMCを密度によって単離します。グラジエント遠心分離。

細胞濃度は、1mlあたり400万細胞に調整する必要があります。完全なRPMI培地では、500マイクロリットルの微生物抗原(この場合はTB 10.4と抗原85 A)、およびPPDBと呼ばれるem bovis培養の精製タンパク質誘導体をプレーティングすることから始めます。次に、各動物から単離した500マイクロリットルのpbmcを、動物ごとに4回の複製で追加します。

すべての井戸は刺激する必要があることに注意してください。刺激やマイトジェンを使わないなどのコントロールは必要ありません このステップでは、プレートを牛の常温である摂氏39度で13日間インキュベートします。3日目と7日目に、各ウェルから500マイクロリットルを廃棄し、ウェルの底の細胞層を乱さないように慎重にピペッティングします。

IL 2 を含む完全な PMI でボリュームを補充します。10日目に、IL2なしで完全なRPMIを補充する各ウェルから750マイクロリットルの上清を廃棄し、IL2なしで完全なRPMIを補充した各ウェルから1mlの上清をピペットで捨てますIL2なしで。また、IFMガンマ捕捉抗体でコーティングするLスポットプレートを準備し、最初にマルチチャンネルピペッターを使用して各ウェルに35%アルコールの15マイクロリットルをピペットします。

300マイクロリットルのPBSで6回よく洗います。PBS中に100マイクロリットルの捕捉抗体を1mlあたり8マイクログラムで添加します。ピペッティングは、ピペットチップがウェル底部のメンブレンに触れたり損傷したりしないように、すべての手順で慎重に行う必要があります。プレートをビニール袋に入れ、摂氏4度で一晩インキュベートします。

13日目に、初日にサンプリングしたのと同じ動物から頸静脈穿刺により60mlの血液を採取します。pbmcを単離し、濃度を1mlあたり200万細胞に調整します。Lスポットプレートに適切なラベルを付けます サンプルのセットごとに。

長期細胞とAPC、APCを含まない長期細胞、およびex vivo細胞。Ellis スポットプレート洗浄ウェルから捕捉抗体を 300 マイクロリットルの PBS 含有 tween で廃棄します。6回繰り返し、廃棄し、液体とピペットを洗浄します。

50マイクロリットルの新たに単離されたp BMCを、長期細胞に割り当てられたウェルに注入します。さらにAPCs。Lスポットプレートの他のウェルを完全なRPMIのウェルあたり200マイクロリットルでブロックします Lスポットアッセイプレートと並行してフローサイトメトリーによって細胞の表現型を評価します。

適切に標識された丸底96ウェルプレートに50マイクロリットルの新たに単離された細胞。これは、応答細胞の表現型を決定するためにイエロースポットアッセイと組み合わせて実施される補助アッセイです。プレートを5%CO2インキュベーターで摂氏39度で90分間インキュベートし、抗原提示細胞を接着させます。

また、この90分間のインキュベーションステップで200 mlの完全RPMIをインキュベートして温めます。24ウェルプレートから長期培養細胞を回収します。各動物のクワッド複製を単一の15ミル円錐管に組み合わせます。

チューブを400Gで5分間遠心分離し、上清をチューブ反転で廃棄し、細胞ペレットを取り除き、必要に応じて5mlのPBSを静かに再懸濁します。細胞を2回洗浄し、細胞濃度を1mlあたり200、000細胞に調整します。90分間のインキュベーション後、インキュベーターからLPOプレートと完全なRPMIを取り出します。

LPOプレートをプレートシェーカーに30秒間置きます。次に、温かい完全なRPMIのウェルあたり150マイクロリットルのプレート反転ピペットで非接着性細胞を除去します。プレートを振って、洗浄液を捨てます。

これを3回繰り返し、できるだけ多くの液体を廃棄し、各抗原のウェルあたり100マイクロリットルを、付着性APCを含む適切なウェルに加えます。次に、長期培養細胞懸濁液のウェルあたり100マイクロリットルをピペットで移します。MLあたり200, 000細胞を、長期細胞とAPCとしてラベル付けされたウェルに入れます。

このステップで追加する長期細胞が、ウェルにすでに存在するAPCと同じ動物に由来するものであることを確認してください。APCと異なる動物の長期培養細胞を混合しないでください。また、長期応答を評価するためのAPCsなしでウェルに200, 000細胞/mlの濃度で長期培養細胞懸濁液のウェルあたり100マイクロリットルをピペットで移します。

抗原提示がない場合は、短期細胞のウェルあたり100マイクロリットルを追加し、さらに新たに単離してex vivo応答評価のためにMLあたり200万細胞に調整します。フローサイトメトリー解析を行う場合は、丸底96、ウェルプレートを洗浄し、同じ手順に従って、長期間単離したばかりの細胞および抗原をウェルに加える。IFN Gamma LPOプレートに採用 5%CO2インキュベーターで摂氏39度でプレートを一晩インキュベートします。

プレートが平らに置かれていることを確認し、14日目にプレートを積み重ねないでください。ウェルから液体を廃棄し、1ウェルあたり300マイクロリットルのPBS含有PBS含有プレートでプレートを6回洗浄し、洗浄前と洗浄の間に10秒間、毎回プレートシェーカーに置きます。次に、同量の蒸留水で1回洗浄し、さらにPBS含有トゥイーンで6回洗浄します。

最後に、PBSのウェルあたり300マイクロリットルで細胞を2回洗浄します。プレートをペーパータオルまたは吸収パッドで軽くたたいて、洗浄液を取り除きます。1%ウシ血清アルブミンでPBSで希釈した1mlあたり5マイクログラムの検出抗体を1ウェルあたり100マイクロリットル加えます。

プレートを摂氏39度で120分間インキュベートします。このインキュベーションステップでは、使用の30分前またはウェルへの検出抗体の添加の90分後に、製造元の指示に従って、VTA染色A BC APキット標準からアルカリホスファターゼ溶液を調製します。120分間のインキュベーション後、試薬をTweenを含むPBSで希釈し、Tweenを含むPBSのウェルあたり300μLでプレート反転洗浄プレートを6回プレート反転して検出抗体を廃棄します。

プレートをペーパータオルで軽くたたいて、洗浄液を取り除きます。次に、アルカリホスファターゼ溶液のウェルあたり100マイクロリットルを追加します。プレートを室温で45分間インキュベートします。

液体を捨て、PBS含有トゥイーンで各プレートを6回洗浄します。製造元の指示に従って、ベクターブルーAP基質3キットから基質溶液を調製します。試薬をpH 8.2の0.1モルトリスHCLバッファーで希釈します。

ピペット50マイクロリットルの基質D.Eachウェルは、青色が約30分発生し始めるまで室温でインキュベートします。液体を捨て、プレートを大量の蒸留水で洗います。底板を取り外してウェルのメンブレンウォッシュバックを露出させ、プレートを風乾させます。

免疫スポット画像分析装置を使用して応答を測定するか、応答が測定されるまでプレートを室温で暗所に置いておきます。反応基質の高い安定性のため、品質は数年間維持されます。フローサイトメトリーにより表現型およびサイトカイン応答を評価する場合、丸底96に播種した細胞の標準的な染色手順を行い、APCの存在下または非存在下でTCMをウェルプレート化し、感染動物および非感染動物からの有人ex vivo IFNγLスポット応答が示される。

m bovisに対する特異的な反応は、PBDBまたはESAT six、CFP 10抗原刺激によって評価されます。プレートの底面のスポットは、イエロースポットアッセイの着色製品です。各スポットは通常、個々のサイトカイン産生細胞を表し、感染した動物の細胞でIFNガンマを産生するT細胞の定量的測定を提供します。

スポット形成細胞またはSFCとして提示される長期的なIFNガンマLスポット応答は明確に視覚化されます 抗原刺激に応答したIFNガンマ産生はほとんどまたはまったく見られません 非感染牛の細胞、および感染牛または非感染牛の非刺激細胞では観察されます。堅牢なT細胞応答は、PPDBおよびESAT6に対するTCMおよびex vivo応答が示されているように、ポークウィードマイトジェンに応答して発生するはずです。CCFP 10は、すべての3M bovis感染動物から検出され、対照動物からはTCMおよびex vivo応答が最小限またはまったく検出されませんでした。

感染した動物による最適なTCM応答には、APCの存在が必要であり、これは、長期間培養した細胞による応答の大幅な減少によって実証されました。自家APCがない場合、em、ボビス感染動物および非感染動物からのスポット形成細胞が提示されました。各動物からのSFCの数は、PPDBに応答した重複サンプル中の10〜6番目の細胞におけるSFCの平均数から培地のみに対するそれぞれの応答を差し引いたもので、APCの感染状況、存在または不在、および培養期間、すなわち長期培養とex vivo培養に基づいて異なりました。