Name: Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-24T17:50:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: 学ぶ マウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養法。Nucleofectionによる遺伝子導入と蛍光タンパク質発現を用いて、軸索伸長やシナプス形成などの神経発達を詳細に観察できます。

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すべての手順は、アニマルケアのウィスコンシン委員会の大学によって承認され、NIHのガイドラインに従ってであった。私たちは、彼女のNucleofector装置の寛大な使用のために博士はキャサリンカリルに感謝。我々は、プロトコル上のコメントのデントラボのメンバーにも感謝。この作品は、EWDへの助成金NIH R01 - NS064014、ダナ財団とホワイトホール財団によってサポートされていましたクリストファーViesselmann、ジェイソンBallwegとデレクLumbardはこの論文にも同様に貢献した。

1。カバーグラスとチェンバースの準備<ol><li>きれいなカバースリップとチャンバーの準備は健全な文化のために不可欠です。ショートカットは、これらの手順のいずれかで取られるべきでない。 </li><li>専用のガラスの瓶やビーカーに濃硝酸で一晩（HNO3） - カバースリップ（キャロライナアシスタントブランド12ミリメートルまたは22ミリメートルラウンド、ドイツのガラスを）洗う。 </li><li>硝酸からカバースリップを削除し、脱イオン水で（5 - 7X）広範囲に洗浄。 </li><li>層流フードまたは生物学的安全キャビネットのカバースリップと乾燥を区切ります。乾燥時、30分間UV光でそれらを滅菌する。ストレージのための滅菌ペトリ皿に滅菌カバーグラスを置きます。 12ミリメートルカバースリップ上にめっきニューロンは直接滅菌35mmディッシュにカバースリップを配置し、セクション2に進んでいる場合。 </li><li>イメージングチャンバーは35mmペトリ皿の底に15ミリメートルの穴をあける（すべてのバリを除去）し、パラフィンやワセリンの3:1混合物で洗浄カバーグラスを取り付けることによって構成されている。 </li><li>沸騰水浴内のコニカルチューブにパラフィン/石油ゼリーの混合物を溶かす。小さいペイントブラシとコート15ミリメートル穴の周り皿の下側を使用してください。それが分離されるようにパラフィン/石油ゼリーの混合物を攪拌しながら維持することを確認してください。料理をインキュベーター内に配置されているときにカバーの剥離、その結果、粘性となる石油ゼリーの濃度が高い、と一緒に接着されたチャンバ内のこれは通常、結果。残りのパラフィン/石油ゼリーは室温で保存することができます。 </li><li>平らなトレイ上に逆さまに皿を置き、穴にカバースリップを配置。 80内の熱° Cオーブンパラフィンの混合物が溶融するまで（〜10分）。平らな面に皿を取り外し、パラフィンの混合物のセットをしましょう​​。 </li><li>皿を裏返しして紫外光でカバーし、チャンバーの底の内側の両方を滅菌する。 </li><li> 1時間コートのカバースリップまたはホウ酸緩衝液（0.1Mホウ酸ナトリウム、pH8.5）に1.0mg/mLポリ- D -リジン（30kDa）とチャンバーのガラス領域。組織培養グレード脱イオン多量の水で3-5回すすいでください。ホウ酸緩衝液の痕跡をすべて削除してください。乾燥させて、後で使用するために直ちにまたは店舗室/カバースリップを使用します。我々は通常、準備の一ヶ月以内にきれいにカバースリップを使用してください。 </li></ol> 2。神経解剖と培養液の調製<ol><li>組織培養グレードの水に10倍HBSSと100X HEPESの適切な量を追加することで解剖の培地（DM）を準備する。 4℃で保存します。解剖時には氷上に置きます。 </li><li>解剖前日には、メッキの培地（PM）および無血清培地（SFM）を準備する。 PMはNeurobasalミディアム、B27サプリメント、2mMグルタミン、0.3％グルコース、37.5 mM NaClおよび5％ウシ胎児血清（FBS）で構成されています。 SFMはNeurobasalミディアム、B27サプリメント、2mMグルタミン、0.3％グルコース、37.5 mM NaClで構成されています。 </li><li>培地の平衡化の温度とCO 2含有よう少し半開きにキャップで一晩組織培養インキュベーターで解剖し、店舗のためにのみ十分な確認。我々は、余分なブドウ糖を追加し、NaClで約310mOsmに浸透圧を増加させる。我々は、文化はより生理的浸透圧（Neurobasal浸透圧は、一般的に205 - 245mOsmである）でもっと良いもの見つける。 </li></ol> 3。長期培養のための皮質グリアフィーダーレイヤーの準備<ol><li>長期培養を準備する必要のある場合は、2〜3週間皮質または海馬の解剖を続ける前に、プロトコルのこの部分を実行します。 </li><li> MEMとグリア培地（GM）、0.3％グルコース、ペニシリン/ストレプトマイシン、10％ウマ血清を準備します。 </li><li>氷上で5分間冷却することにより、P1 - P3仔マウスを安楽死させる。 70％エタノールと氷とスプレーから各子犬を削除します。すぐにはさみで首を切る。コー​​ルドDMを（ステップ2.1）を含む皿に脳全体を削除します。 </li><li> two大脳半球および髄膜を取り外します。新皮質税とは、メディアを含まない新しい皿に移す。合計4脳から皮質を準備します。 </li><li>できるだけ細かいようにきれいに、滅菌カミソリの刃で皮質を飾らないと冷たいDMの12 mLを含む50mLのコニカルチューブにプラスチック製のピペットを刻んだ組織を取り除く。それぞれ0.25％（1.5mL）を、0.1％（1.5 mL）を、最終濃度にトリプシンとDNaseを追加。断続的な渦巻くと10分間37℃の水浴でインキュベートする。 </li><li>皮質組織を含むチューブを外し、組織培養フードに持ち込む前に70％エタノールで十分に洗浄。 10 mLのピペットとピペット皮質組織の上下は約10〜15倍、またはまで、ほとんどのチャンクが消えます。 </li><li> ° C断続的な旋回を持つ別の10分間水浴中で37にチューブを返します。 </li><li>徹底的に70％エタノールでチューブをきれいにし、組織培養フードに戻す。 5メートルで、上下のピペット皮質組織をLピペット約10〜15倍、またはチャンクがなくなるまで。 </li><li>暖かいGM 15mLを加え、10分間200xg（1000rpm）で遠心。 </li><li>上清を破棄し、新鮮なGMの20mLにペレット化した細胞を再懸濁し、血球計数器でカウント。 75センチメートル2フラスコあたりのGMの15 mLの内板5 - 7.5x10 6個の細胞。 </li><li>ある日、文化の各2月3日その後の日後、あなたの手に対してフラスコをノックでバラセルを押しのける。どんな外れた細胞と共に培養液を除去し、新鮮なGMの15 mLで置き換えます。 </li><li>彼らは70〜100％程度コンフルエントのときにグリア細胞が、フラスコの成長の1〜2週間後に収穫することができます。グリア細胞で被覆された個々のカバーグラスを準備するには、場所6硝酸は、小さな絵筆と三角パターンで各カバースリップの上にパラフィン/石油ゼリーの3:1混合物の3つの点をきれいにして10cmの皿に25ミリメートルラウンドカバーグラスを滅菌し、場所。 30分間紫外線を開いて料理を扱います。コー​​ト1時間ホウ酸緩衝液では0.1 mg / mLのポリ- D -リジン（30kDa）とカバーガラスは、その後無菌組織培養グレード、脱イオン水で（3〜5倍）広範囲に洗浄し、乾燥させる。 </li><li>インキュベーターからグリア含有フラスコを削除、培地を廃棄し、予め温めておいたトリプシン/ EDTA溶液5 mLですすいでください。フラスコからトリプシン/ EDTA溶液を除去し、フラスコに新鮮予め温めておいたトリプシン/ EDTA 3 mLをピペット。 ° C、トリプシン処理を停止するには、GMの5 mLを追加する前に、37℃で1分間フラスコをインキュベートする。 </li><li> 10月15日回ピペッティングを繰り返すことによりフラスコからグリアを削除してから、15 mLコニカルチューブにメディアを転送する。 8分間200xg（1000rpm）で遠心。上清を除去し、カバースリップを含む10 cmディッシュあたりのGMの12.5 mLの10 GM mLの、カウント細胞、およびプレート5 × 10 5細胞を加える。 </li><li>新鮮予め温めておいたGMごとに2〜3日で培地を交換する。ニューロンの解剖前日には、GMを削除し、SFM（セクション2.2）と交換してください。皮質または海馬培養をフラッディングするときにステップ4.12でこのグリアエアコンSFMを使用してください。 </li></ol> 4。皮質および/または海馬解剖とエレクトロ<ol><li> nucleofectionソリューション（ロンザ）の適切な量を削除、解剖を開始する前に結合し、室温に暖かい。組み合わせるとNucleofectionのソリューションは、限られた寿命を持っているので、我々はそれぞれの準備（トランスフェクションあたり100μL）に必要な量を組み合わせる。 </li><li> CO 2（プラグの日はE0.5です）とE15.5で妊娠したマウスを安楽死させると10cmのペトリ皿に子宮を削除します。コー​​ルドDM（セクション2.1）に胎児と首を切るを削除します。 </li><li>冷たいDMの別々の皿に脳全体を取りはずして、曲がったタングステン針で、両方neocortexの複数形を削除する。冷たいDMの新しい料理にmicroforcepsと場所の皮質と髄膜を取り外します。小さな虹彩またはヴェッカーハサミで、冷たいDM 1.0mLのでいっぱいの1.5 mLエッペンドルフチュー​​ブに皮質または海馬と場所を削除します。氷の上にこのチューブを保管してください。 </li><li>すべての皮質または海馬を解剖した後、20分間37℃のインキュベーターで組織し、場所チューブを含むエッペンドルフチュー​​ブに2.5％トリプシン110μLを加える。 </li><li>静かに転倒エッペンドルフチュー​​ブで1.0mLのPM（セクション2.2）で上清と洗浄皮質または海馬を削除します。チューブでPMを1 mLを残して、二回洗浄を繰り返します。 </li><li> P1000ピペットで塊を15回ひいて粉にする、とPMの4 mLを含む新しい15 mLコニカルチューブに上清/セルを削除し、エッペンドルフチュー​​ブに残っているチャンクを残す。 </li><li>ブレーキオフで7分間20xg（350rpm）で15 mLのチューブを回転させる。上清を捨て、各トランスフェクションのための予混合、室温のnucleofectionソリューション（ロンザ）100μLを加える。 P1000ピペットの緩やかな上下の動きで5回ひいて粉にする。 </li><li>それぞれの新しいエッペンドルフチュー​​ブにnucleofectionソリューション/細胞混合液を100μLを削除し、DNAの適切な量を追加します。長期的な文化のために我々は一般的にトランスフェクションあたりのDNAの1 -2μgを使用してください。しかし、このラベルだけの文化で神経細胞の小&lt;10％の割合。短期培養のためにより高いトランスフェクション効率が必要な場合我々は一般的にトランスフェクションあたりのDNAの5 -10μgのを使用してください。 2種類の異なったプラスミドでトランスフェクション時に我々はDNAの40μgの総まで使用している。プラスミドはμL/1μgのでTEバッファーに格納されています。 </li><li>キュベット（ロンザ）に細胞懸濁液/ DNAを追加し、プログラムO - 005（マウス中枢神経系ニューロン）を使用して、Nucleofector（ロンザ）で細胞をエレクトロポ。 </li><li>素早く作業を、キュベットに予め温めておいたと平衡PMの500μLを追加し、新しい1.5 mLのエッペンドルフチュー​​ブにソリューション/セルを削除します。を1.0 mLにそれぞれトランスフェクションのボリュームをもたらすのに十分なPMを追加。長期培養のための若者文化、または5 - 10x10の3個 / cm 2と 3 - 5 × 10 3細胞/ cm 2で血球計算板とプレートで細胞を数える。&lt;は/ LI&gt; </li><li>短期的な文化のため、洪水温めたの2.0 mLを、メッキの1時間後にCO 2平衡SFMを搭載した35 mm培養皿。カバースリップを使用している場合、我々は、PMの半分を削除し、さらに2回繰り返して、SFMと交換してください。どちらイメージングチャンバーを洪水や非常に低い血清含有量（&lt;0.5％）でカバースリップの結果を洗う。短期的な文化は、グリアフィーダー層で培養する必要がないと再供給する必要はありません。 </li><li>長期培養では、パラフィン/石油ゼリーの3つのドットが含まれているグリアカバーカバーを取り外し、35mmディッシュに15ミリメートル穴、初期めっき後、1時間かけてそれを反転させる。グリア皿からエアコンSFMの二ミリリットルその後イメージングチャンバーに追加されます。長期培養を養うために、我々は、SFMごとに2〜3日の3分の1を削除して、新鮮、予め温めておいたとCO 2平衡SFMと交換してください。 </li></ol> 5。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2373/2373fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。海馬ニューロンを生きた代表の発達の連続した段階で海馬の神経細胞を生きた。ペア画像は微分干渉コントラスト画像と対応する蛍光顕微鏡写真の両方として表示されます。これらの各セルは、pCAXベクトルにおけるEGFP -チューブリンとDsRed2のをトランスフェクトされています。ステージ1（1DIV）、ステージ2（1DIV）、ステージ3（2DIV）、ステージ4（11DIV）とステージ5（32DIV）：神経細胞は、in vitroで 、次の日（DIV）で撮像した。スケールバーは20μmのです。

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<li>Zeitelhofer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

培養胚の海馬と皮質のマウスニューロンのためのこのプロトコルは、ラットの神経細胞の1,2を使用してバンカーのプロトコル、の修正として開発されました。我々はよく3,4,5,6,7として培養マウスとハムスターのニューロンのためにこのプロトコルを使用している。このプロトコルは、海馬と新皮質の両方に神経細胞にも同様に機能し、Mebergとミラー8によって発行されたプロトコルに似ています。彼らはよく特徴付けと、より確立されたモデル系されているため、一般的に、我々は、長期培養のために海馬ニューロンを使用してください。さらに、彼らは新皮質よりもニューロンのより均質な集団を含む可能性があります。しかし、このプロトコルを使用して培養大脳皮質ニューロンも生き残ると（未発表データ）も同様に区別する。我々は日常的に短期の文化のために海馬と新皮質の神経細胞を使用してください。新皮質の解剖はまた、西洋例えば、ブロッティングのための材料のよりよい選択肢と海馬解離（海馬のペアごとに2.5x10 5ニューロン）、より実質的により多くのニューロン（皮質のペアごとに1.5 × 10 6ニューロン）をもたらす。 任意の初代培養と同様に、それが動物の死から細胞をプレーティングするのにかかる時間を最小限に抑えることが不可欠です。それは一般的に解剖し、メッキで一貫して高速になるために10月20日解剖がかかります。それらはnucleofectionバッファに残っている場合、ニューロンの生存率が急激に減少するとしても、ロンザNucleofectorで作業する場合、それは、エレクトロポレーションの手順の間に素早く作業することが重要です。 私たちの撮影の多くは、全内部反射蛍光顕微鏡（TIRFM）で行われている。顕微鏡のこのタイプは、カバースリップを超えたイメージング数百ナノメートルのみが可能です。したがって、我々は頻繁に画像そのニューロンの領域は、軸索成長円錐と樹状突起棘は、カバースリップに直接付着する必要があります。従って、我々は、長期培養のためにグリア栄養を必要とする低密度培養を使用してください。我々は、長期培養のために、グリアフィーダー層なしで、高密度培養（&gt; 2 × 10 4細胞/ cm 2）を使用し、それらが少し餌と非常によく生き残ることを発見した。それらは容易に広視野顕微鏡または共焦点顕微鏡で検出することができるが、しかし、これらのニューロンの樹状突起は、しばしば、あまりにも遠く離れて基板からTIRFMの画像になります。 我々の研究のほとんどでは、メッキの前に神経細胞をトランスフェクトし、文化の3ヶ月までのための蛍光標識タンパク質を画像化している。蛍光標識タンパク質のこの長期的な発現は、DNA（1 -2μg）の低濃度を使用することによって我々は神経細胞で過剰発現のアーティファクトを生成していないことを私たちに自信を与えます。しかし、この手順は、DNAの大量（10 -20μg）を使用する場合、タンパク質の過剰発現を研究するために使用することができます。我々はまた、単独でDsRed2のまたはEGFPを持つ神経細胞質にラベルを付けるものの、我々は通常、神経細胞をトランスフェクトするために使用するプラスミドは、EGFPまたはmCherry融合タンパク質が含まれています。このエレクトロポレーション法は、ベクトルの数とうまく動作します。我々は、CMVエンハンサーとβ-グロビンポリ- expressionの比較的高いレベルのために尾（pCAGGsまたはpCAXプラスミド）9、、と彼らはよく神経細胞によって許容されるという事実とβ-アクチンプロモーターを含むプラスミドを好む短期と長期培養の両方インチ一般に、タンパク質はメッキの約4時間以内に発現し、10 24 10内イメージングのための十分なレベルに到達し始める。私たちは正常に短期培養におけるCMV -プロモーター駆動型プラスミドを用いているが、彼らは長期培養で神経細胞を殺すことに過剰発現の高いレベルを引き起こすことを見出した。それにもかかわらず、我々は、低密度培養のグリアコンディショニングがより高い密度（非グリアFED）の文化と比較して、CMV -プロモーター駆動プラスミドをトランスフェクトした神経細胞の生存に役立つことを発見した。

我々は-80保存することを*ほとんどの試薬は° Cも同様に-20℃で保存することができます。 -80それらを格納° Cは、その貯蔵寿命とわずかに一貫性のある文化では結果が長くなります。

nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

海馬と皮質ニューロンは、中枢神経系（CNS）神経偏光、軸索/樹状突起伸長、およびシナプス形成と機能を研究するために広く使用されている。培養の利点は、これらのニューロンは非常に低密度で二次元の基板上に、独特の軸索と樹状突起を形成し、それらが容易に分極することです。このプロパティは、神経発達の多くの側面を決定するため、それらは非常に便利なてきた。さらに、これらのニューロンのためのグリアコンディショニングを提供することによって、彼らは機能的なシナプス結合を形成し、文化の中で数ヶ月間生存し、発展していきます。このプロトコルでは、文化とトランスフェマウス胎児海馬と皮質の神経細胞を分析する手法の概要を示します。トランスフェクションは、nucleofectionを経由してめっきする前に、神経細胞にDNAをelectroporatingことによって達成される。このプロトコルは、偏光、軸索伸長と分岐の間に蛋白質のダイナミクスと機能を研究するために開発（〜4 8時間メッキ後）の初期の蛍光タグ融合タンパク質を発現できるという利点があります。我々はまた、メッキの前に、この単一のトランスフェクションは、ニューロン（文化の中で&gt; 2ヶ月）の生涯を通してイメージングのための適切なレベルで蛍光タグ融合タンパク質の発現を維持することを発見した。したがって、この方法論は、神経機能のほとんど、またはまったく中断して中枢神経系の開発を通して蛋白質の局在と機能を研究するために有用です。

このプロトコルは、エレクトロポレーションと文化のマウス海馬および皮質のニューロンを経由してトランスフェクション、解剖するために必要な手順を説明します。長期培養がシナプスと樹状突起棘の解析の研究に使用することができますが、短期的な文化は、軸索伸長やガイダンスの研究に使用されることがあります。

Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

海馬および皮質のニューロンは、中枢神経系（CNS）のニューロンの極性化、軸索および樹状突起の伸展、ならびに...を研究するために広く用いられてきました。

海馬および皮質のニューロンは、中枢神経系のニューロンの極性化、軸索と樹状突起の伸展、およびシナプスの形成と機能の研究に広く利用されてきました。これらのニューロンを培養する利点は、非常に低い密度で二次元基質上に播種すると、容易に極性化し、特徴的な軸索と樹状突起を形成することです。このビデオでは、胚性マウスの海馬および皮質ニューロンを解剖・培養し、ニュークロアフェクション（nucleofection）によってトランスフェクションする手法を実演します。この手法により、播種後約4〜8時間という発生の早期段階から蛍光タグ付き融合タンパク質を発現させることが可能となり、その発現は培養中2か月以上にわたり、ニューロンの寿命全般にわたって維持されます。これにより、軸索の伸展といった初期の発生イベントや、シナプス形成およびシナプス可塑性といった後期のイベントにおけるタンパク質の機能を研究することが可能になります。まず、生後1日から3日のマウスの皮質半球からグリア細胞を単離し、フラスコに播種します。70～100%のコンフルエンスに達した後、グリア細胞をガラスカバースリップに再播種します。次に、胎生15.5日のマウスから海馬または皮質ニューロンを単離し、赤色蛍光タンパク質などの蛍光融合タンパク質をコードするプラスミドをニュークレオフェクション法を用いて導入します。導入したニューロンをイメージングチャンバーに播種し、短期研究に用います。長期培養の場合には、ガラスカバースリップ上のグリア細胞を海馬または皮質培養液の上に反転させて配置し、栄養的サポートを提供します。その後、個々のニューロンをイメージングすることで、ニューロンの軸索または樹状突起における融合タンパク質の動的な局在を示すことができます。こんにちは。ウィスコンシン大学マディソン校で解剖学の助教授を務めているエリック・デントです。本日は、私の指導する学部生3名、クリス・ウェゼルマン、ジェイソン・ブウェ、デレク・ロンバードが、皮質および海馬ニューロンの分離、播種、および短期的・長期的培養のための維持手順を実演します。これらの培養系は、初期の神経突起伸展から軸索および樹状突起の発達、そしてシナプス形成に至るニューロンの発達過程における、蛍光融合タンパク質のダイナミクスを研究するために利用できます。イメージングに向けて、マウス胚性海馬および皮質ニューロンのチャンバーを準備します。底面に15 mmの穴を開け、すべてのバリを取り除いた35 mmのペトリ皿を用意します。円錐チューブに入れたパラフィンとペトロラタム（ワセリン）の3:1混合物を、沸騰水浴に入れて溶解させます。次に、小さな絵筆を使用して、穴の周囲のディッシュ裏面にコーティングを施します。パラフィンとペトロリアムジェリーの混合物は分離しやすいため、チャンバー間で必ず撹拌してください。穴の上にカバーガラスを被せます。すべてのディッシュの準備が完了したら、パラフィン混合物が溶けるまで80 °Cのオーブンに入れます。これには約10分かかります。次に、ディッシュを平らな場所に取り出し、パラフィン混合物を少なくとも1分間凝固させます。ディッシュを裏返し、フードの下に置きます。UVライトを30分間点灯させ、カバーの内側とチャンバーの底面の両方を滅菌します。次にコーティングを行います。チャンバーカバーガラスをポリD-リシンで1時間処理します。その後、コーティングしたカバーガラスを滅菌ろ過脱イオン水で3〜5回十分にすすぎ、Boreバッファーを完全に除去します。最後のすすぎの後、真空吸引を用いてチャンバーを乾燥させます。これらはすぐに使用することも、組織培養室に保管して後で使用することも可能です。長期培養を行う場合は、コーティングしたチャンバーを調製から1週間以内に使用してください。皮質または海馬の解剖に進む2〜3週間前に、皮質グリアフィーダー層の準備を開始する必要があります。P1からP3のマウス4匹の脳を、冷解剖培地を含むディッシュに入れ、解剖顕微鏡の下に配置します。嗅球、2つの大脳半球、および髄膜を除去します。半球を、培地を含まない新しいディッシュに移します。清潔で滅菌済みのカミソリ刃を用い、皮質を可能な限り細かく刻みます。次に、プラスチック製ピペットを用いて、細断した組織を12 mLの冷 dissection.Medium を含む50 mLコニカルチューブに移します。最終濃度がそれぞれ0.25%および0.1%となるようにtrypsinとDNAsを加えます。37 °Cのウォーターバスで、時々軽く揺らしながら10分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブをウォーターバスから取り出し、組織培養フードに入れる前に70%ethanolで十分に洗浄します。ピペットを用いて皮質組織をピペッティングします。10 mLピペットを用いて、塊がほとんど消失するまで約10～15回ピペッティングし、その後チューブをウォーターバスに戻して、時々軽く回転させながらさらに10分間温めます。再びチューブを70% ethanolで十分に滅菌し、組織培養フードに戻します。皮質組織をピペッティングします。前回と同様に、今回は5 mLピペットを用いて、15 mLの加温したグリア培地を加え、1000 RPMで10分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットとなった細胞を20 mLの新鮮なグリア培地で再懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントします。次に、75 cm²フラスコ1本あたり、15 mLのグリア培地に500万〜750万個の細胞を播種します。細胞を37 °Cのインキュベーターに入れ、その後は培養の1日後および2〜3日ごとに、フラスコをフードの表面に軽く叩きつけて剥離した細胞を分散させます。培地を、剥離した細胞とともに除去し、15 millilitersの新鮮なグリア培地と交換します。グリア細胞は、フラスコ内での培養後1〜2週間で、ほぼ100%コンフルエントに達した時に回収できます。グリアでコーティングした個別のカバーガラスを準備するには、まず硝酸で洗浄・滅菌した6枚のカバーガラスを用意することから始めてください。10 cmのディッシュに25 mmの円形カバーガラスを置き、小さな絵筆を用いて、パラフィン・ペトロラタム・ジェリーの3:1混合液を、カバーガラス上の各箇所に三角形を描くように3点塗布します。さらに、ディッシュに固定するため、カバーガラスの端に2点塗布します。開封したディッシュをUVライトで30分間処理します。カバーガラスをポリDリジンで1時間コーティングします。その後、滅菌ろ過した脱イオン水で3〜5回十分に洗浄し、乾燥させます。インキュベーターからグリア細胞を取り出します。培地を除去し、あらかじめ加温した 5 mL のトリプシンで洗浄します。フラスコに 3 mL のトリプシンを加え、37 °C で 1 分間インキュベートします。細胞が剥離したら、5 mL のグリア培地を加えてトリプシン反応を停止させます。ピぺッティングを10～15回繰り返し、フラスコからGLを除去します。次に、培地を15 mLのコニカルチューブに移し、1000 RPMで8分間遠心分離します。遠心分離後、上清を除去し、細胞を10 mLのグリア培地に懸濁させます。その後、細胞数をカウントし、カバーガラスを入れた10 cmディッシュあたり、12.5 mLのグリア培地で5 × 10⁵個の細胞を播種します。ニューロン分画の前日まで、2〜3日ごとに培地をあらかじめ温めておいた新鮮なグリア培地と交換してください。その後、グリア培地を除去し、無血清培地と置換します。このグリア条件血清不含培地は後で使用します。皮質または海馬培養液を満たす際、Cを最終濃度5 µMになるように添加します。グリア細胞の増殖を防ぐため、メーカーの指示に従って、核導入試薬をトランスフェクションごとに加え、その後、溶液を室温まで温めてください。E 15.5マウス脳が入ったディッシュを、冷たい解剖用培地の中に置きます。解剖顕微鏡下で、曲げたタングステン針を用いて両側の新皮質を取り除きます。次に、マイクロピンセットを使用して髄膜を取り除き、皮質を冷たい解剖用培地を入れた新しいディッシュに移します。小型の虹彩剪刀を用いて、大脳半球の内側面に沿って海馬と皮質を確認します。海馬を慎重に摘出します。次に、残りの皮質を摘出します。同じリターのすべての個体の脳で解剖を繰り返します。海馬と皮質を、1 mLの冷えた解剖用培地を入れた個別の1.5 mLマイクロチューブに回収します。すべての皮質と海馬の解剖が完了した後、チューブを氷上に置きます。組織の入ったマイクロ遠心チューブに2.5% trypsingを110 µL加え、37 °Cのインキュベーターに20分間置きます。P 1000ピペットを使用して、チューブ内の液を可能な限り除去します。次に、各チューブに播種用培地を1 mL加え、マイクロ遠心チューブをゆっくりと反転させて組織を洗浄します。洗浄を2回繰り返します。最後の洗浄後、プレーティング培地を1 mL加えます。P 1000 ピペットを使用して、塊（チャンク）を15回トリチュレートします。その後、上清と細胞を、プレーティング培地4 mLが入った新しい15 mLコニカルチューブに移します。その際、マイクロ遠心チューブに残っている塊はそのままにしておきます。15 mLチューブを350 RPMで7分間遠心分離し、ブレーキをオフにして終了させます。上清を捨て、各トランスフェクションに対して、室温で調製済みの核導入溶液（nuclear affection solution）を100 µL加えます。ピペッティングを5回行い、混合します。次に、核導入溶液と細胞の混合液100 µLを、適切な量のDNA（1トランスフェクションあたり1～2 µg）を含む新しいマイクロ遠心チューブにそれぞれ移します。長期培養の場合、培養されたニューロンの10%未満がラベルされます。1回のトランスフェクションあたり5～10 µgのDNAを使用すると、培養におけるトランスフェクション効率が向上します。細胞懸濁液とDNAの混合物をエレクトロポレーションキュベットに加えてください。次に、キュベットをエレクトロポレーターにセットします。マウスCNSニューロンの場合、NucleofectorのプログラムをOH 0 0 5に設定し、迅速に、あらかじめ加温し平衡化したプレーティング培地500 µLをキュベットに加え、細胞溶液を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。各トランスフェクションの液量が1 mLになるまで、十分な量の播種用培地を加えてください。細胞数をカウントした後、短期培養の場合は3～5 × 10³ cells/cm²、長期培養の場合は5～10 × 10³ cells/cm²（通常は5 × 10⁵または1 × 10⁶ cells）の割合で、1回のトランスフェクションあたりに播種します。播種から1時間後、35 mmの培養皿に、二酸化炭素で平衡化した温かい無血清培地2 mLを満たします。イメージングチャンバーの結果、血清含有量は0.5%未満と非常に低くなります。短期培養では、グリアフィーダー層での培養や再給餌は必要ありません。長期培養を準備する場合は、無血清培地にグリアコンディショニング培地を1 mL添加してください。パラフィン系 पेट्रोलियम jellyを3箇所に塗布したGLカバーガラスを取り除き、35 mmディッシュの15 mmの穴の上に反転させて置きます。次に、長期培養細胞に供給するため、培地をさらに1 mL添加します。2〜3日ごとに、無血清培地の3分の1を交換してください。培養から5〜7日後、グリア細胞の増殖を抑制するために、cytosine Arab IDEまたはaeeを最終濃度5 µMとなるように添加します。以下に示す代表的な生存海馬ニューロンのペア画像は、微分干渉像と対応する蛍光顕微鏡像を示しています。これらの細胞にはすべて、PAベクターを用いてEGFP、tubulin、およびDS red twoが導入されています。ステージ1では、ニューロンはまず接着し、1日ほどの期間を経て、細胞体の周囲にシート状のラメラポディア（葉状仮足）および指状のフィロポディア（糸状仮足）を突出させます。ステージ2では、初期の突出部が分化し、細胞体から数本のニューライト（神経突起）が伸びますが、通常はその長さは30から50 µm程度に留まります。ステージ3になると、確率的にニューライトの1本が急速に伸長し始め、それが軸索となります。その他のニューライトは短いままであり、副突起と呼ばれます。ほとんどの海馬および皮質ニューロンは、培養後2〜3日までにステージ3へと移行します。続くステージ4はその後1〜2週間かけて進行し、副突起が太くなり、伸長し、分枝して樹状突起となります。ここでは、これらが緑色で示されています。一方で、軸索は成長と分枝を続けながら、2〜3週間かけて細くなります。培養下において、樹状突起は樹状突起棘（樹状突起に沿った小さな突起物）を形成することで分化します。ステージ5のニューロンは形状や大きさに個体差がありますが、ほとんどのニューロンはこの一連の発達段階を経ます。タンパク質の過剰発現がニューロンの発達を妨げた場合、トランスフェクションされたニューロンはこれらの段階を通過しない可能性があります。また、ニューロンがすべての発達段階を完了しない場合があります。カバースリップが適切に洗浄されていないか、ポリリジンが適切に接着していない場合、特にCを使用していないときは、グリア細胞が広範囲に増殖することがあります。これは、長期培養においてグリア細胞が培養物を覆い尽くした、培養2週目の位相差像です。培地の交換頻度が多すぎても少なすぎても、ニューロンの生存能を損なう可能性があります。これは、ほとんどのニューロンが死滅し、残存しているニューロンの細胞体が萎縮し、突起に数珠状の形態（beaded processes）が見られる培養系の位相差顕微鏡像です。比較として、こちらは培養2週目の健康な海馬ニューロンの位相差顕微鏡像です。細胞体がより大きく、突起に数珠状の形態が見られない点に注目してください。また、この段階では樹状突起が太くなり、軸索突起による広範な網目構造が形成されています。習熟すれば、胚の皮質および解剖、形質導入、および胎児の全リターの播種を適切に行うことで、2時間で完了させることができます。この手順を行う際は、海馬および皮質のニューロンが機械的な刺激に非常に敏感であることに留意することが重要です。また、ニューロンの単離中は、代謝活性を低く抑えるために溶液を可能な限り低温に保つことが重要です。この手順に続き、目的の蛍光融合タンパク質がニューロンの異なる領域にどのように分配されるかなど、さらなる疑問を解決するために、生細胞イメージングや生理学的な活性記録などの他の手法を実施することができます。これにより、タンパク質の局在がシナプス活性の変化に関連しているか、あるいはこれらのタンパク質の機能が異なる薬理学的処理によってどのように影響を受けるかを調べることが可能です。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

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