Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

海馬ニューロンと皮質ニューロンは、中枢神経系のニューロン分極、軸索樹状突起伸長、シナプスの形成と機能を研究するために広く使用されており、これらのニューロンを培養する利点は、それらが容易に分極し、非常に低い密度で二次元基質上に特徴的な軸索と樹状突起を形成することです。このビデオでは、核の愛情を介して培養、およびトランスフェクション、胚性、マウス海馬、および皮質ニューロンを解剖する技術を示しています。これにより、蛍光タグ付きタンパク質の発現が培養で2か月以上ニューロンの寿命を通じて維持されてから約4〜8時間後に、発生初期に蛍光タグ付き融合タンパク質の発現が可能になります。これにより、軸索伸長などの初期発生イベントや、シナプス形成やシナプス可塑性などの後期イベントにおけるタンパク質の機能の研究が可能になります。

まず、グリア細胞は出生後の皮質半球から単離されます。1日目から3日目にマウスが飛び出し、フラスコにメッキされます。70〜100%coの流暢さに達した後、グリア細胞はガラスカバースリップに再メッキされます。

次に、海馬ニューロンまたは皮質ニューロンをE 15.5マウスから単離し、核の愛情を介して、赤色蛍光タンパク質などの蛍光融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクションします。次に、トランスフェクションされたニューロンをイメージングチャンバーに播種し、短期間の研究を行います。長期培養では、ガラスカバースリップ上のグリア細胞を海馬または皮質培養上で反転させます栄養サポートを提供するために、個々のニューロンを画像化して、ニューロンの軸索または樹状突起全体の融合タンパク質の動的局在を示すことができます。

こんにちは、ウィスコンシン大学マディソン校の解剖学助教授であるエリック・デントです。今日は、私の学部生の3人、Chris Wezelman、Jason Bwe、Derek Lombardが、皮質および海馬ニューロンの培養物を分離し、短期および長期の培養のために維持する手順を実演します。これらの培養物は、初期の神経突起伸長から軸索および樹状突起の発達、シナプス形成までのニューロンの発達全体にわたる蛍光融合タンパク質のダイナミクスを研究するために使用できます。

イメージング、胚、マウス海馬および皮質ニューロンのイメージングのためのチャンバーを準備するため。底に15ミリメートルの穴を開け、すべてのバーを取り除いた35ミリメートルのシャーレから始めます。3対1のパラフィンワセリン混合物を円錐形のチューブに入れて溶かします。

次に、小さな絵筆を使用して、穴の周りの皿の下側をコーティングします。パラフィンワセリン混合物は分離するため、チャンバー間で必ず攪拌してください。カバースリップを穴の上に置きます。

すべての料理が準備できたら、パラフィン混合物が溶けるまで摂氏80度のオーブンに入れます。これには約 10 分かかります。次に、皿を平らな面に移し、パラフィン混合物を少なくとも1分間セットします。

皿を裏返してフードの下に置きます。UVライトを30分間オンにして、カバーの内側とチャンバーの底の両方を滅菌します。次のコート。

チャンバーカバーはポリDリシンで1時間滑ります。次に、コーティングされたカバースリップを滅菌フィルター脱イオン水で3〜5回徹底的にすすぎ、ボアバッファーの痕跡をすべて取り除きます 最終すすぎ後、真空を使用してチャンバーを乾燥させます。これらはすぐに使用することも、後で組織培養室に保管することもできます。使う。

コーティングされたチャンバーは、長期培養を準備する場合は、調製後1週間以内に使用する必要があります。皮質グリアフィーダー層は、皮質または海馬の解剖を続ける2〜3週間前に開始する必要があります。4つのP、1〜P、3つのマウスポップの脳を冷たい解剖培地が入った皿に入れ、解剖スコープの下に置きます。

嗅球、2つの大脳半球、髄膜を取り除きます。半球をメディアを含まない新しいディッシュに移します。清潔な滅菌カミソリの刃を使用して、皮質をできるだけ細かく刻みます。

次に、プラスチック製のピペットを使用して、刻んだ組織を12ミリリットルの冷解剖を含む50ミリリットルの円錐管に移します。中程度。トリプシンとDNAをそれぞれ0.25%と0.1%の最終濃度まで添加します。摂氏37度の水浴中で10分間、断続的に渦巻きながらインキュベートします。

インキュベーション後、チューブをウォーターバスから取り外し、70%エタノールで完全に洗浄してから組織に取り込む。カルチャーフード。皮質組織を上下にピペットで動かします。

10ミリリットルのピペットで約10〜15回、またはほとんどのチャンクが消えるまで、チューブをウォーターバスにさらに10分間戻し、断続的に渦を巻きます。再度、70%エタノールでチューブを完全に洗浄し、ティッシュに戻します。カルチャーフード。

皮質組織を上下にピペットで動かします。前回と同様に、5ミリリットルのピペットを使用して、15ミリリットルの温かいグリア、培地、遠心分離機を1000RPMで10分間追加します。上清を捨て、ペレット化した細胞を20ミリリットルの新鮮なグリア培地に再懸濁します。

ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントします。次に、75cm四方のフラスコあたり15ミリリットルのグリア培地に5〜750万個の細胞を播種します。細胞を摂氏37度のインキュベーターに1日後、その後2〜3日ごとに培養し、フラスコをフードの表面にぶつけて緩んだ細胞を取り除きます。

移動した細胞とともに培地を取り除き、15ミリリットルの新鮮なグリアと交換します。中程度のグリアは、フラスコでの成長から1〜2週間後、約100%のコンフルエントになったときに収穫できます。グリアでコーティングされた個々のカバースリップを準備するには、洗浄および滅菌した6つの硝酸を置くことから始めます。

25ミリメートルの丸いカバーは10センチの皿にスリップし、小さな絵筆を使用して、パラフィンワセリンの3対1の混合物の3つのドットを置きます。各カバーに三角形のパターンで滑ります。カバースリップの端に2つのドットを配置して、皿に固定します。

開いた皿をUVライトで30分間処理します。カバースリップにポリDリジンを1時間塗ります。次に、滅菌フィルター脱イオン水で3〜5回広範囲に洗浄し、インキュベーターからグリア細胞を乾燥させて取り出します。

メディアを廃棄し、5ミリリットルの予熱トリプシンで洗浄します。フラスコに3ミリリットルのトリプシンを加え、摂氏37度で1分間インキュベートします。細胞が剥離したら、トリッピンを止めるために5ミリリットルのグリア培地を追加します。

GLをフラスコから取り外すには、ピペッティングを10〜15回行います。次に、培地を1000RPMの15ミリリットルの円錐管遠心分離機に8分間移します。遠心分離後、細胞を10ミリリットルのグリア培地に懸濁します。

次いで細胞プレートを5回カウントした後、10センチメートル皿あたり12.5ミリリットルのグリア培地で5回分の細胞を5回、カバースリップを含んだ。ニューロン解剖の前日に、2〜3日ごとに培地を新鮮な温熱グリア培地と交換します。グリア培地を取り出し、無血清培地と交換します。

このグリア状態の無血清培地は後で使用してください。.氾濫、皮質または海馬の培養では、Cが5マイクロモルの最終濃度に追加されます。トランスフェクションごとの核酸抗体試薬のグリア増殖を防ぐために、製造元の指示に示されているように、溶液を室温まで温めてください。

E 15.5マウスの脳が入った皿を冷たい解剖培地に入れます。解剖顕微鏡で、曲げたタングステン針を使用して両方の新皮質を切除します。次に、マイクロ鉗子を使用して髄膜を取り除き、皮質を冷たい解剖培地の新しい皿に入れます。

海馬と皮質は、小さな虹彩はさみで大脳半球の内側に沿って見えます。海馬を慎重に取り外します。次に、残りの皮質を取り除きます。

ごみ全体から脳の解剖を繰り返します。カバのキャンプコルチスを、1ミリリットルの冷解剖液で満たされた別々の1.5ミリリットルのマイクロチューブに入れます。中程度。カバカンピのすべての皮質を解剖した後、チューブを氷の上に置きます。

組織を含むマイクロフュージチューブに110マイクロリットルの2.5%トリプシンを加え、チューブを摂氏37度のインキュベーターに20分間置きます。.P 1000ピペットを使用して、チューブからできるだけ多くの液体を取り除きます。次に、各チューブに1ミリリットルのメッキメディウムを加え、マイクロフュージチューブを静かに反転させて組織を洗浄します。

洗浄を2回繰り返す 最終洗浄後、1ミリリットルのめっき用メディウムを加えます。P 1000ピペットを使用して、チャンクを15回トライレートします。次に、上清と細胞を4ミリリットルのめっき培地を含む新しい15ミリリットルの円錐管に移し、マイクロフュージチューブに残っているチャンクを残します。

遠心分離後に休憩を取りながら、15ミリリットルのチューブを350RPMで7分間回転させ、上清を捨てて、予め混合した室温の100マイクロリットルを追加します。各トランスフェクションピペットの核愛情溶液を5回上下させて、次の移送を混合します。100マイクロリットルの核愛情溶液および細胞混合物を、適切な量のDNAを含む各新しいマイクロフージチューブに、長期培養用のトランスフェクションごとに1〜2マイクログラムのDNAを注入すると、培養中のニューロンの10%未満が標識されます。

トランスフェクションごとに5〜10マイクログラムのDNAを使用すると、培養のトランスフェクション効率が高くなりますが、細胞懸濁液とDNAミックスをエレクトロポレーションベテに追加します。次に、veteをエレクトロに入れます。マウスCNSニューロンの場合、核エフェクタープログラムをoh 0 0 5に迅速に設定し、戦前および平衡化しためっき培地を500マイクロリットルをqveに追加し、細胞溶液を新しい1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに移します。

各トランスフェクションの量が1ミリリットルになるように、十分なめっき培地を追加します。細胞板を3〜5×10〜3の細胞を1cm二乗の若培養物の場合は3〜5倍、3分の10×10を3細胞に、長期培養のm2倍の割合を計数した後、一般的には5×10〜5倍または1×10〜6分の1とする。トランスフェクションごとに細胞を使用して、短期培養を調製します。

めっきの1時間後、35ミリメートルの培養皿に2ミリリットルの温かい二酸化炭素を平衡化し、無血清培地を浸水させます。イメージングチャンバーは、血清含有量が0.5%未満の非常に低い結果をもたらします短期培養は、グリアフィーダー層で培養する必要はなく、リードする必要もありません。長期培養を調製するには、1ミリリットルのグリア状態を無血清培地に加えます。

パラフィンワセリンの3つのドットを含むGLで覆われたカバースリップを取り外し、35皿の15ミリメートルの穴にひっくり返します。次に、長期培養物を供給するために、さらに1ミリリットルの培地を追加します。2〜3日ごとに無血清培地の3分の1を交換してください。.

培養で5〜7日後、グリアの増殖を防ぐために、シトシンArab IDEまたはaeeを最終濃度5マイクロモルに添加します。代表的な生きている海馬ニューロンの次のペア画像は、微分干渉コントラスト画像と対応する蛍光顕微鏡写真の両方を示しています。これらの各細胞は、PAベクターでEGFP、チューブリン、およびDS red 2をトランスフェクションしています。

ステージ1では、ニューロンが最初に付着し、1日ほどかけて、細胞体の周辺にシート状のラメロポディアと指のようなフィリップポディアが突き出ます。ステージ2では、最初の突起は細胞体から発せられるいくつかの神経突起に分化し、通常は長さが約30〜50ミクロンのままになります。確率的には、第3段階では、神経突起の1つが急速に伸び始め、軸索になります。

他の神経突起は短いままで、マイナープロセスと呼ばれます。ほとんどの海馬ニューロンと皮質ニューロンは、次の週または2つの小さなプロセスで発生するステージ4の間に、培養で2〜3日ごとにステージ3に進行し、肥厚し、長くなり、枝分かれしてここで樹状突起になります、これらは緑色で示されています。その間、軸索は成長を続け、2〜3週間で分岐するにつれて薄くなります。

培養では、樹状突起は樹状突起棘、樹状突起に沿った小さな隆起を形成することによって分化します。ステージ5のニューロンは、その形状とサイズが異なりますが、ほとんどのニューロンはこの一連の発達段階を経る必要があります。トランスフェクションされたニューロンは、タンパク質の過剰発現がニューロンの発達を混乱させると、これらの段階を進行しない可能性があります。

また、ニューロンは発達のすべての段階を通じて進行するわけではありません。カバースリップが適切に洗浄されていないか、ポリリジンが適切に付着していないと、特にCを使用しない場合、グリアも広範囲に増殖する可能性があります。これは、グリアが長期培養で培養物を生い茂らせた2週間前の培養物の位相コントラスト画像です。

メディアを頻繁に交換したり、交換頻度が少なかったりすると、ニューロンの生存能力も損なわれる可能性があります。これは、ほとんどのニューロンが死滅し、残りのニューロンが細胞体を縮小し、プロセスがビーズ状になった培養の位相コントラスト画像です 比較のために、これは培養2週間での健康な海馬ニューロンの位相コントラスト画像です。細胞体が大きく、プロセスで鼓動が不足していることに注意してください。

また、この段階では、樹状突起が肥厚し、軸索突起の広範な細線線があります。一度習得すると、胎児、皮質、解剖、トランスフェクション、および胎児の同腹児全体のプレーティングは、適切に行われれば2時間で行うことができます。この手順を試みる際には、海馬ニューロンと皮質ニューロンが機械的な混乱に非常に敏感であることを覚えておくことが重要です。

また、ニューロンの分離中は、代謝活動を低く保つために、溶液をできるだけ冷たく保つことが重要です。この手順に続いて、目的の蛍光融合タンパク質がニューロンの異なる領域にどのように分離するかなどの追加の質問に答えるために、ライブセルイメージングや活動の生理学的記録などの他の方法を実行できます。タンパク質の局在がシナプス活性の変化と関連しているかどうか、またはこれらのタンパク質の機能がさまざまな薬理学的治療によってどのように影響を受けるか。