Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

海馬および皮質のニューロンは、中枢神経系のニューロンの極性化、軸索と樹状突起の伸展、およびシナプスの形成と機能の研究に広く利用されてきました。これらのニューロンを培養する利点は、非常に低い密度で二次元基質上に播種すると、容易に極性化し、特徴的な軸索と樹状突起を形成することです。このビデオでは、胚性マウスの海馬および皮質ニューロンを解剖・培養し、ニュークロアフェクション（nucleofection）によってトランスフェクションする手法を実演します。この手法により、播種後約4〜8時間という発生の早期段階から蛍光タグ付き融合タンパク質を発現させることが可能となり、その発現は培養中2か月以上にわたり、ニューロンの寿命全般にわたって維持されます。これにより、軸索の伸展といった初期の発生イベントや、シナプス形成およびシナプス可塑性といった後期のイベントにおけるタンパク質の機能を研究することが可能になります。

まず、生後1日から3日のマウスの皮質半球からグリア細胞を単離し、フラスコに播種します。70～100%のコンフルエンスに達した後、グリア細胞をガラスカバースリップに再播種します。

次に、胎生15.5日のマウスから海馬または皮質ニューロンを単離し、赤色蛍光タンパク質などの蛍光融合タンパク質をコードするプラスミドをニュークレオフェクション法を用いて導入します。導入したニューロンをイメージングチャンバーに播種し、短期研究に用います。長期培養の場合には、ガラスカバースリップ上のグリア細胞を海馬または皮質培養液の上に反転させて配置し、栄養的サポートを提供します。その後、個々のニューロンをイメージングすることで、ニューロンの軸索または樹状突起における融合タンパク質の動的な局在を示すことができます。

こんにちは。ウィスコンシン大学マディソン校で解剖学の助教授を務めているエリック・デントです。本日は、私の指導する学部生3名、クリス・ウェゼルマン、ジェイソン・ブウェ、デレク・ロンバードが、皮質および海馬ニューロンの分離、播種、および短期的・長期的培養のための維持手順を実演します。これらの培養系は、初期の神経突起伸展から軸索および樹状突起の発達、そしてシナプス形成に至るニューロンの発達過程における、蛍光融合タンパク質のダイナミクスを研究するために利用できます。

イメージングに向けて、マウス胚性海馬および皮質ニューロンのチャンバーを準備します。底面に15 mmの穴を開け、すべてのバリを取り除いた35 mmのペトリ皿を用意します。円錐チューブに入れたパラフィンとペトロラタム（ワセリン）の3:1混合物を、沸騰水浴に入れて溶解させます。

次に、小さな絵筆を使用して、穴の周囲のディッシュ裏面にコーティングを施します。パラフィンとペトロリアムジェリーの混合物は分離しやすいため、チャンバー間で必ず撹拌してください。穴の上にカバーガラスを被せます。

すべてのディッシュの準備が完了したら、パラフィン混合物が溶けるまで80 °Cのオーブンに入れます。これには約10分かかります。次に、ディッシュを平らな場所に取り出し、パラフィン混合物を少なくとも1分間凝固させます。

ディッシュを裏返し、フードの下に置きます。UVライトを30分間点灯させ、カバーの内側とチャンバーの底面の両方を滅菌します。次にコーティングを行います。

チャンバーカバーガラスをポリD-リシンで1時間処理します。その後、コーティングしたカバーガラスを滅菌ろ過脱イオン水で3〜5回十分にすすぎ、Boreバッファーを完全に除去します。最後のすすぎの後、真空吸引を用いてチャンバーを乾燥させます。これらはすぐに使用することも、組織培養室に保管して後で使用することも可能です。

長期培養を行う場合は、コーティングしたチャンバーを調製から1週間以内に使用してください。皮質または海馬の解剖に進む2〜3週間前に、皮質グリアフィーダー層の準備を開始する必要があります。P1からP3のマウス4匹の脳を、冷解剖培地を含むディッシュに入れ、解剖顕微鏡の下に配置します。

嗅球、2つの大脳半球、および髄膜を除去します。半球を、培地を含まない新しいディッシュに移します。清潔で滅菌済みのカミソリ刃を用い、皮質を可能な限り細かく刻みます。

次に、プラスチック製ピペットを用いて、細断した組織を12 mLの冷 dissection.Medium を含む50 mLコニカルチューブに移します。最終濃度がそれぞれ0.25%および0.1%となるようにtrypsinとDNAsを加えます。37 °Cのウォーターバスで、時々軽く揺らしながら10分間インキュベートします。

インキュベーション後、チューブをウォーターバスから取り出し、組織培養フードに入れる前に70%ethanolで十分に洗浄します。ピペットを用いて皮質組織をピペッティングします。

10 mLピペットを用いて、塊がほとんど消失するまで約10～15回ピペッティングし、その後チューブをウォーターバスに戻して、時々軽く回転させながらさらに10分間温めます。再びチューブを70% ethanolで十分に滅菌し、組織培養フードに戻します。

皮質組織をピペッティングします。前回と同様に、今回は5 mLピペットを用いて、15 mLの加温したグリア培地を加え、1000 RPMで10分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットとなった細胞を20 mLの新鮮なグリア培地で再懸濁します。

ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントします。次に、75 cm²フラスコ1本あたり、15 mLのグリア培地に500万〜750万個の細胞を播種します。細胞を37 °Cのインキュベーターに入れ、その後は培養の1日後および2〜3日ごとに、フラスコをフードの表面に軽く叩きつけて剥離した細胞を分散させます。

培地を、剥離した細胞とともに除去し、15 millilitersの新鮮なグリア培地と交換します。グリア細胞は、フラスコ内での培養後1〜2週間で、ほぼ100%コンフルエントに達した時に回収できます。グリアでコーティングした個別のカバーガラスを準備するには、まず硝酸で洗浄・滅菌した6枚のカバーガラスを用意することから始めてください。

10 cmのディッシュに25 mmの円形カバーガラスを置き、小さな絵筆を用いて、パラフィン・ペトロラタム・ジェリーの3:1混合液を、カバーガラス上の各箇所に三角形を描くように3点塗布します。さらに、ディッシュに固定するため、カバーガラスの端に2点塗布します。

開封したディッシュをUVライトで30分間処理します。カバーガラスをポリDリジンで1時間コーティングします。その後、滅菌ろ過した脱イオン水で3〜5回十分に洗浄し、乾燥させます。インキュベーターからグリア細胞を取り出します。

培地を除去し、あらかじめ加温した 5 mL のトリプシンで洗浄します。フラスコに 3 mL のトリプシンを加え、37 °C で 1 分間インキュベートします。細胞が剥離したら、5 mL のグリア培地を加えてトリプシン反応を停止させます。

ピぺッティングを10～15回繰り返し、フラスコからGLを除去します。次に、培地を15 mLのコニカルチューブに移し、1000 RPMで8分間遠心分離します。遠心分離後、上清を除去し、細胞を10 mLのグリア培地に懸濁させます。

その後、細胞数をカウントし、カバーガラスを入れた10 cmディッシュあたり、12.5 mLのグリア培地で5 × 10⁵個の細胞を播種します。ニューロン分画の前日まで、2〜3日ごとに培地をあらかじめ温めておいた新鮮なグリア培地と交換してください。その後、グリア培地を除去し、無血清培地と置換します。

このグリア条件血清不含培地は後で使用します。皮質または海馬培養液を満たす際、Cを最終濃度5 µMになるように添加します。グリア細胞の増殖を防ぐため、メーカーの指示に従って、核導入試薬をトランスフェクションごとに加え、その後、溶液を室温まで温めてください。

E 15.5マウス脳が入ったディッシュを、冷たい解剖用培地の中に置きます。解剖顕微鏡下で、曲げたタングステン針を用いて両側の新皮質を取り除きます。次に、マイクロピンセットを使用して髄膜を取り除き、皮質を冷たい解剖用培地を入れた新しいディッシュに移します。

小型の虹彩剪刀を用いて、大脳半球の内側面に沿って海馬と皮質を確認します。海馬を慎重に摘出します。次に、残りの皮質を摘出します。

同じリターのすべての個体の脳で解剖を繰り返します。海馬と皮質を、1 mLの冷えた解剖用培地を入れた個別の1.5 mLマイクロチューブに回収します。すべての皮質と海馬の解剖が完了した後、チューブを氷上に置きます。

組織の入ったマイクロ遠心チューブに2.5% trypsingを110 µL加え、37 °Cのインキュベーターに20分間置きます。P 1000ピペットを使用して、チューブ内の液を可能な限り除去します。次に、各チューブに播種用培地を1 mL加え、マイクロ遠心チューブをゆっくりと反転させて組織を洗浄します。

洗浄を2回繰り返します。最後の洗浄後、プレーティング培地を1 mL加えます。P 1000 ピペットを使用して、塊（チャンク）を15回トリチュレートします。その後、上清と細胞を、プレーティング培地4 mLが入った新しい15 mLコニカルチューブに移します。その際、マイクロ遠心チューブに残っている塊はそのままにしておきます。

15 mLチューブを350 RPMで7分間遠心分離し、ブレーキをオフにして終了させます。上清を捨て、各トランスフェクションに対して、室温で調製済みの核導入溶液（nuclear affection solution）を100 µL加えます。ピペッティングを5回行い、混合します。次に、核導入溶液と細胞の混合液100 µLを、適切な量のDNA（1トランスフェクションあたり1～2 µg）を含む新しいマイクロ遠心チューブにそれぞれ移します。長期培養の場合、培養されたニューロンの10%未満がラベルされます。

1回のトランスフェクションあたり5～10 µgのDNAを使用すると、培養におけるトランスフェクション効率が向上します。細胞懸濁液とDNAの混合物をエレクトロポレーションキュベットに加えてください。次に、キュベットをエレクトロポレーターにセットします。マウスCNSニューロンの場合、NucleofectorのプログラムをOH 0 0 5に設定し、迅速に、あらかじめ加温し平衡化したプレーティング培地500 µLをキュベットに加え、細胞溶液を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。

各トランスフェクションの液量が1 mLになるまで、十分な量の播種用培地を加えてください。細胞数をカウントした後、短期培養の場合は3～5 × 10³ cells/cm²、長期培養の場合は5～10 × 10³ cells/cm²（通常は5 × 10⁵または1 × 10⁶ cells）の割合で、1回のトランスフェクションあたりに播種します。

播種から1時間後、35 mmの培養皿に、二酸化炭素で平衡化した温かい無血清培地2 mLを満たします。イメージングチャンバーの結果、血清含有量は0.5%未満と非常に低くなります。短期培養では、グリアフィーダー層での培養や再給餌は必要ありません。長期培養を準備する場合は、無血清培地にグリアコンディショニング培地を1 mL添加してください。

パラフィン系 पेट्रोलियम jellyを3箇所に塗布したGLカバーガラスを取り除き、35 mmディッシュの15 mmの穴の上に反転させて置きます。次に、長期培養細胞に供給するため、培地をさらに1 mL添加します。2〜3日ごとに、無血清培地の3分の1を交換してください。

培養から5〜7日後、グリア細胞の増殖を抑制するために、cytosine Arab IDEまたはaeeを最終濃度5 µMとなるように添加します。以下に示す代表的な生存海馬ニューロンのペア画像は、微分干渉像と対応する蛍光顕微鏡像を示しています。これらの細胞にはすべて、PAベクターを用いてEGFP、tubulin、およびDS red twoが導入されています。

ステージ1では、ニューロンはまず接着し、1日ほどの期間を経て、細胞体の周囲にシート状のラメラポディア（葉状仮足）および指状のフィロポディア（糸状仮足）を突出させます。ステージ2では、初期の突出部が分化し、細胞体から数本のニューライト（神経突起）が伸びますが、通常はその長さは30から50 µm程度に留まります。ステージ3になると、確率的にニューライトの1本が急速に伸長し始め、それが軸索となります。

その他のニューライトは短いままであり、副突起と呼ばれます。ほとんどの海馬および皮質ニューロンは、培養後2〜3日までにステージ3へと移行します。続くステージ4はその後1〜2週間かけて進行し、副突起が太くなり、伸長し、分枝して樹状突起となります。ここでは、これらが緑色で示されています。一方で、軸索は成長と分枝を続けながら、2〜3週間かけて細くなります。

培養下において、樹状突起は樹状突起棘（樹状突起に沿った小さな突起物）を形成することで分化します。ステージ5のニューロンは形状や大きさに個体差がありますが、ほとんどのニューロンはこの一連の発達段階を経ます。タンパク質の過剰発現がニューロンの発達を妨げた場合、トランスフェクションされたニューロンはこれらの段階を通過しない可能性があります。

また、ニューロンがすべての発達段階を完了しない場合があります。カバースリップが適切に洗浄されていないか、ポリリジンが適切に接着していない場合、特にCを使用していないときは、グリア細胞が広範囲に増殖することがあります。これは、長期培養においてグリア細胞が培養物を覆い尽くした、培養2週目の位相差像です。

培地の交換頻度が多すぎても少なすぎても、ニューロンの生存能を損なう可能性があります。これは、ほとんどのニューロンが死滅し、残存しているニューロンの細胞体が萎縮し、突起に数珠状の形態（beaded processes）が見られる培養系の位相差顕微鏡像です。比較として、こちらは培養2週目の健康な海馬ニューロンの位相差顕微鏡像です。細胞体がより大きく、突起に数珠状の形態が見られない点に注目してください。

また、この段階では樹状突起が太くなり、軸索突起による広範な網目構造が形成されています。習熟すれば、胚の皮質および解剖、形質導入、および胎児の全リターの播種を適切に行うことで、2時間で完了させることができます。この手順を行う際は、海馬および皮質のニューロンが機械的な刺激に非常に敏感であることに留意することが重要です。

また、ニューロンの単離中は、代謝活性を低く抑えるために溶液を可能な限り低温に保つことが重要です。この手順に続き、目的の蛍光融合タンパク質がニューロンの異なる領域にどのように分配されるかなど、さらなる疑問を解決するために、生細胞イメージングや生理学的な活性記録などの他の手法を実施することができます。これにより、タンパク質の局在がシナプス活性の変化に関連しているか、あるいはこれらのタンパク質の機能が異なる薬理学的処理によってどのように影響を受けるかを調べることが可能です。