異種細胞での化学感覚受容体の表面発現をアッセイ

この手順の全体的な目標は、HEK 2 93 T細胞の生細胞染色を使用してケモス感覚受容体の表面発現を検出する方法を実証することであり、これは最初に培養皿のポリDリシンコーティングカバースリップに細胞を着座させることによって達成されます。手順の2番目のステップは、HEK 2 93 T細胞にDNAをトランスフェクションすることです。手順の3番目のステップは、一次抗体とフルオロ4標識二次抗体を使用して生細胞染色を行うことです。

手順の最後のステップは、染色された細胞を固定し、カバースリップを取り付けることです。最終的には、免疫蛍光顕微鏡法により、細胞表面上の受容体の局在を示す結果を得ることができます。この方法は、HK 2 93 T.Aのような異種細胞の細胞表面にエクスポートされた化学感覚受容体を検出することを可能にしますこの方法の視覚的なデモンストレーションは、細胞の自己維持のために細胞を生かし続けるために密接に従う必要がある主要なステップを示しています。

この方法に不慣れな人は、カバースリップの転送、取り扱い、取り付けなどの手順が難しいと感じるかもしれません。しかし、いくつかの練習で、技術は簡単になります cgenカラムを使用する修正プロトコルを使用して、受容体と受容体の血漿DNAを精製します。100万個の発現ベクターPCIでクローニングされたタンパク質RT TPを輸送すると、免疫染色のために、コーティングされた受容体に20アミノ酸の長列エピトープが末端にタグ付けされ、細胞の接着が容易になります。

コードガラスカバーは、1ミリリットルあたり1ミリグラムでスリップします。ポワ・デ・リジンは、無菌層流チャンバープレートHT K 2 9 3 T細胞を1ミリリットルのM10培地で約30%の密度で空気乾燥させるためにコーティングされた35ミリメートル細胞培養皿にカバースリップを充填し、カバースリップと37°Cおよび5%二酸化炭素で18〜24時間インキュベートした細胞培養皿との間に気泡が閉じ込められないことを確認します。各トランスフェクションについて、1000ナノグラムの受容体コンストラクト、250ナノグラムのRTP one sコンストラクト、および50ナノグラムのGFPコンストラクトのDNAミックスを調製します。

製造元の指示に従って、脂肪切除術2000で細胞をトランスフェクションします。アジ化ナトリウムとヒッピーをM 10に添加して染色培地を調製します。これは、摂氏4度で数ヶ月間保管することができます。

次に、15ミリモルのアジ化ナトリウムと10ミリモルのハイスの洗浄バッファーを調製します。低温HBSSでは、洗浄バッファーを摂氏4度で数ヶ月間保存することがあります。コールドラインで染色を行うには、香水を入れたトレイを氷の上に5分間置きます。

細胞側を上にして、トランスフェクションされた細胞を含むガラスカバースリップをカバースリップの角からパラフォームに移し、染色培地で希釈した100マイクロリットルの冷たい一次抗体を慎重に加えます。室温で60分間インキュベートします。次に、元の35mm培養皿で、冷水洗浄液を交互に加え、吸引して細胞を洗浄します。

2回繰り返します。同様に、SI 3標識二次抗体を30分間インキュベートします。35ミリ皿で3回洗います。

最後に、冷やした1%パラホルムアルデヒド溶液で細胞を固定します。すべての気泡を除外するように注意してください。顕微鏡スライドにセル側を下にしてカバーを取り付け、ほくろを使用してカバースリップの表面を蒸留水ですすぎ、塩分沈着物を取り除きます。

典型的には、OL FFR 62およびRTPsと同様に、受容体の1つの細胞表面染色は、標識抗体からの蛍光シグナルの点状出現によって特徴付けられる 一度習得すると、この技術は、わずか2時間半から3時間で32 40のカバースリップを染色するために使用され、複数のカバースリップでこの手順を試みる間、 細胞の乾燥を防ぐために、一度に1枚のカバースリップに移して抗体インキュベーションを開始することが重要です。