Name: 異種細胞での化学感覚受容体の表面発現をアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: 学ぼう、HEK293T細胞を用いた化学感覚受容体の表面発現検出法。生細胞染色と免疫蛍光顕微鏡で受容体局在を可視化し、GPCR研究に応用可能な手法を解説します。

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我々は、この原稿の重要な読書のために松浪研究室のメンバーに感謝。

1。手順： 転送細胞、トランスフェクションおよび免疫細胞化学、日ごとに行わつのステップ：プロシージャでは、3日間の合計時間をかけて完成した三つの部分から構成されています。最初の二日間での転送と細胞のトランスフェクションは、層流室内の無菌状態で実施する必要があります。 1日目：表面発現アッセイのためのHEK293T細胞の譲渡。 <ol><li>伝送媒体（M10）：ミックス10％（体積）無菌状態のウシ胎児血清を添加した最小必須培地。 </li><li>セットアップに必要なプレートの数に応じて100mmの培養プレート内の目的のコンフルエントに細胞を成長させる。それは草に覆わまたは疎セルを避けるために転送されるセルの割合を決定することが重要である：例えば、100％コンフルエントな100 mmディッシュから、一つでコンフルエントに約30％を取得するために35mm皿に約3％を譲渡することができます。後者。 </li><li>前に無菌層流室、コート22に、セルを転送する滅菌ポリDリジン（1mgの/ mL）と各35 mmの細胞培養皿で片足、メッキの細胞のためのコーティング面を上X 22 mmのガラスカバースリップ（図1 ）。 10分 - 5のために乾燥してソリューションを許可する。必要に応じてこの間隔の間に、層流室内のUV光源は、カバースリップを滅菌するためにオンにすることができます。ポリDリジンは、異種細胞がカバーガラスに付着することができます。 </li><li> 100mmディッシュ内の既存のメディアアウト吸引、細胞を転送するには、慎重に8 mLの滅菌PBSを添加し洗浄、吸引PBS、3 mLの0.05％トリプシン- EDTAを用いて細胞をトリプシン処理、細胞が培養皿からデタッチするときに、によって、さらに酵素反応をブロックする5 mLのM10を追加。細胞をひいて粉にすると無菌コニカルチューブに必要なボリュームを移転すること、細胞をペレットに5分間200グラムで遠心。無傷の細胞のペレットを残し、トリプシン- EDTAを含有する上清を吸引除去する。 35mmの皿に細胞を転送するには、それぞれの料理のために1 mLのM10を追加し、細胞を解離する粉薬。各ディッシュに再懸濁した細胞を1 mLを追加。 37℃で一晩培養する° C、5％CO 2。 <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1コート22ポリDリジンでX 22 mmのガラス製カバースリップと各35 mmのシャーレに1コーティング面を上に置きます。 </li></ol> 2日目：HEK293T細胞のトランスフェクション。 <ol><li> 18-24時間転送した後、細胞は、アッセイする受容体のトランスフェクションのための準備が整いました。 4の前に説明したキアゲンミニプレップキット以下のプロトコルを使用して細菌培養液から調製した哺乳動物発現ベクターpCI、でクローニングされた受容体とRTP1Sを使用してください。 N末端に免疫染色を容易にするために20アミノ酸の長ロドプシンエピトープでタグ付けされた受容体を使用してください。 </li><li>受容体構造、RTP1S構造と緑色蛍光タンパク質それぞれのトランスフェクションの50 ngの250 ngの1000ngを使用してください。メーカーのマニュアルに従ってリポフェクタミン2000を、使用してトランスフェクションを実行します。 </li></ol> 3日目：細胞表面の染色された受容体を可視化する免疫細胞。 <ol><li>開始する前に、染色やソリューションを洗濯を準備し、4℃に冷却する。培地染色：最小必須培地、45mlの、ウシ胎児血清、5 mLを、HEPES（1M）、500μL（最終濃度10mMの）、アジ化ナトリウム（1.5M）、500μL（最終濃度15MM）。 、HEPES（1M）、5mLの（最終濃度10mMの）、アジ化ナトリウム（1.5M）、5mLの（最終濃度15mm）をHBSS、500mLの：ソリューションを洗ってください。どちらのソリューションは、再利用のために4℃で保存することができます。染色媒体100倍で、必要な抗体を希釈することにより抗体の溶液を調製。 </li><li> 24時間後にトランスフェクションについての嗅覚受容体のための表面染色のための免疫化学を開始します。生細胞の染色を実行するには、実験的なセットアップが4に冷却しなければならない° C：氷とパットのようにもできる限りそれを作るために氷の表面に含まれる大を埋める、氷の上にトレイを置き、70％でそれを吹きかけエタノール。滑らかな表面を得るために、パラフィルムの部分（トレイの長さよりも小さい）とエタノールスプレートレイ上に貼ってカット。ピンセットを使用して、パラフィルム上にトランスフェクトされた細胞、一度、セル側を含むガラスカバースリップを転送します。層ごとにカバーはスリップ（図2）のコーナーから慎重に押し出し、100μLコールド主染色液でスリップ。階層化抗体溶液を持つすべてのカバースリップの後、空気中のソリューションの枯渇を防ぐためにトレイをカバーしています。 45〜60分間一次インキュベーションを行う。 </li><li>主なインキュベーションの後、すぐにメディアを含む、オリジナルの35mm培養皿にカバースリップを転送する。培地を吸引除去し、カバースリップから細胞を失うことを防ぐために皿の縁から静かに2 mLの冷却した洗浄溶液を加える。洗浄液を吸引除去し、3回の洗浄を完了するために二度繰り返す。第三洗浄の終了時に、洗浄液を吸引しないでください。 </li><li>二次抗体solutiを準備染色のメディアで上と同じトレイに新しく貼らパラフィルム層に洗浄溶液からカバースリップを転送する。再び静かに一次インキュベーションなどのコーナーから、層ごとにカバースリップをに抗体溶液100μLを押し出します。 30の二次インキュベーションを行う - 45分とオリジナルの35mmの皿の洗浄溶液に戻って転送する。もう一度、カバーが説明されているように三回伝票は洗浄。 </li><li>最後の洗浄からソリューションを洗浄し、2 mLの1パーセントチルドパラホルムアルデヒドを追加吸引する。 15分間氷上で、チルド1％パラホルムアルデヒド溶液で細胞を固定する。 </li><li>きれいな顕微鏡のガラスのカバースリップがダウンしてセルの側で、マウント試薬のMowiolを使用してスライドし、慎重にすべての気泡を（図3）除外マウントします。かつてMowiol空気が乾燥する、表面に蒸留水を加えるとすぐに吸引し、静かにカバースリップを洗う。 <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。レイヤ100μLの冷主要な染色液でそれぞれカバー。 <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。Mowiolマウンティング試薬を使用してスライドするきれいなガラスの顕微鏡で下のセル側にカバースリップをマウントします。 </li></ol> 2。代表的な結果： 生細胞の染色は1つがシャペロン（プロテインRTP1Sを輸送受容体とこのケースの嗅覚受容体Olfr62、の）（図4）と受容体のトランスフェクションで、細胞の表面上のタンパク質を可視化することができます。受容体の細胞表面の染色は、染色の点状のパターン（図4B、挿入図）によって特徴付けられる。不適切に行わ染色することが困難オブザーバーは、ノイズから実際の表面染色を区別するためになり、より高いノイズにつながる可能性があります。 <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。シャペロンと受容体のトランスフェクションは、生細胞の染色を用いて細胞の表面上のタンパク質の可視化が可能になります。嗅覚だけでは受容体Olfr62（）とRTP1Sシャペロン（B）とOlfr62のトランスフェクションのトランスフェクション。 GFPの発現レベルは、トランスフェクションのコントロール（A'とB'）として機能します。

<ol><li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65, 175-187 (1991).</li>
<li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+receptor+codes+for+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96, 713-723 (1999).</li>
<li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119, 679-691 (2004).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

各ステップは、著名な、独特の表面の汚れを確実にするために慎重に実施しなければならない。全体の染色工程は、（氷上で）寒さで実施しなければならない、とカバースリップが配置されているトレイは、細胞が生き続けることを確認するために使用する前に冷却する必要があります。また固定は表面染色のプロセスの最後に実行されます。これは固定では一次および二次抗体に細胞膜を透過性に染色の前に内部の染色とは対照的です。空気にカバースリップの暴露時間は、最大乾燥から細胞を防止するために最小化されている必要がありますので抗体溶液とカバースリップの階層化、ソリューションを洗浄するためにカバースリップを転送する、洗浄の間に洗浄溶液の交換は一度に素早く一に行う必要があります複数のカバースリップを処理するとき。 エピトープタグと抗体目のものに応じて、一つはインキュベーション時間、洗浄回数、および抗体の希釈の倍を調整する必要があります。バックグラウンドノイズは、より多くの抗体を希釈または洗浄の回数を増やす、またはインキュベーション時間を短縮することで回避できます。

<table><tbody><tr><td>カバーグラス 22 X 22 mm (#1)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>72200-11</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>最小必須培地</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4655</td><td>L-グルタミン酸、Earle&amp;rsquo;s塩および重炭酸塩含有</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>EMS</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液 (HBSS) 1X </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14025</td><td>塩化カルシウムおよび塩化マグネシウム含有</td></tr><tr><td>HEPES緩衝液</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>カルシウムおよびマグネシウム不含</td></tr><tr><td>ポリ-D-リシン臭化水素酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SX0299-1</td><td></td></tr><tr><td>組織培養皿 35 X 10 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td>0.05%</td></tr></tbody></table>

異種細胞での化学感覚受容体の表面発現をアッセイ

Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells

悪臭の鮮やかな世界は、嗅覚の感覚によって認識されています。マウスでの嗅覚は、Gタンパク質Gαolfと結合することによって揮発性の匂い分子を結合し、細胞内の信号に細胞外シグナルに変換するために仮定されている約1200のGタンパク質共役受容体（GPCR）1のレパートリーによって媒介される。受容体への臭気物質の結合を組み合わせルールに従うと考えられている、つまり、1つの嗅覚は、いくつかの受容体に結合する可能性があり、つの受容体は、程度の差は2に、複数の匂い物質を結合することができる。生化学、シグナリングおよびリガンド結合研究は、便利な異種細胞を使用するほとんどのGPCRのために行われている。トランスフェクションに彼らは表面にエクスポートに失敗したので、しかし、嗅覚受容体の研究のために異種細胞の使用は長い間排除されました。齋藤らは、家族のシャペロンを共が一緒に3をトランスフェクトされた異種細胞の表面へのトラフィックの嗅覚受容体へのシャペロンとしての嗅覚ニューロンと行為で強化された発現を示すタンパク質を輸送する単一の細胞膜の通過の受容体（RTP）を示している。受容体は細胞株における堅牢な表面発現を示す場合に異種細胞を使用し受容するための生化学的アッセイを行うには、最初に決定する必要があります。これは、生細胞の染色に続いてシャペロンのRTP1Sと受容体は、蛍光細胞外ドメインまたは排他的に細胞外ドメイン内のタグにラベルを付けるために過剰発現によってアッセイすることができます。ここでは、便利なHEK293T細胞の表面上の嗅覚受容体を検出するために使用することができる生細胞の染色を実施するためのプロトコルを示しています。さらに、それはまた他の化学感覚受容体やGPCRの表面発現のためのアッセイに使用することができます。

ここでは、便利なHEK293T細胞の表面上の嗅覚受容体を検出するために使用することができる生細胞の染色を実施するためのプロトコルを示しています。さらに、それはまた他の化学感覚受容体やGPCRの表面発現のためのアッセイに使用することができます。

多彩な臭いの世界は、嗅覚によって認識されます。マウスの嗅覚は、約1200種類のGタンパク質共役受容体からなるレパートリーによって媒介されており、...

本手順の全体的な目的は、HEK 2 93 T細胞における生細胞染色の手法を用いて、化学感覚受容体の細胞表面発現を検出する方法を実証することです。まず、培養皿内のポリDリシンコートカバーグラス上に細胞を播種します。次に、HEK 2 93 T細胞にDNAをトランスフェクトします。最後に、一次抗体およびフルオロフォー共役二次抗体を用いて生細胞染色を行います。手順の最終ステップは、染色した細胞を固定し、カバーガラスを封入することです。最終的に、免疫蛍光顕微鏡を通じて細胞表面における受容体の局在を示す結果を得ることができます。この手法により、HEK 293Tのような異種細胞の細胞表面に輸送された化学感覚受容体を検出することが可能になります。本手法の視覚的なデモンストレーションでは、細胞自己染色のために細胞を生かしておくために厳守すべき重要なステップについて説明します。この手法に不慣れな方は、カバーガラスの移送、操作、およびマウントなどのステップに困難を感じるかもしれません。しかし、数回の練習を積めば、このテクニックは容易になります。cgenカラムを用いた修正プロトコルにより、受容体および受容体の血漿DNAを精製します。100万個の発現ベクターPCIにクローニングされたタンパク質RT TP oneを輸送し、免疫染色において、受容体コーティングが、細胞の付着を容易にするために20アミノ酸長のrowエピトープでC末端タグ付けされていることを確認してください。1 mg/mLのポリリジンでガラスカバーのスリップをコーティングします。カバーのスリップを35 mmの細胞培養ディッシュにコーティング面を上にして配置し、滅菌済みのラミナーフローチャンバー内で風乾させます。HTK2-93T細胞を1 mLのM10培地を用いて、密度が約30%になるように播種し、カバーのスリップと細胞培養ディッシュの間に気泡が入らないように注意してください。37 °C、5% CO₂条件下で18〜24時間インキュベートします。各トランスフェクションにつき、レセプター構築物1000 ng、RTP1s構築物250 ng、およびGFP構築物50 ngのDNAミックスを調製します。メーカーの指示に従い、Lipofectamine 2000を用いて細胞にトランスフェクションを行います。M10にアジ化ナトリウムとヒッポス（hippies）を加えて染色用培地を調製します。これは4 °Cで数ヶ月間保存可能です。次に、15 millimolar azide sodiumと10 millimolar heisを含む洗浄バッファーを調製します。洗浄バッファーは、冷えたHBSS中で4 °Cで数ヶ月間保存することが可能です。冷線での染色の準備として、トレイにparfumを入れ、5分間氷上で冷却します。細胞面を上に向けた状態で、トランスフェクションした細胞を含むガラスカバースリップをパラフィルムに転写します。カバースリップの端から、染色用緩衝液で希釈した冷製の一次抗体 100 µLを慎重に加えます。室温で60分間インキュベートします。次に、元の35 mm培養ディッシュ内の細胞を、冷洗浄液の添加と吸引を交互に繰り返して洗浄します。これを2回繰り返します。同様に、SI 3結合二次抗体を30分間インキュベートします。35 mmディッシュ内で3回洗浄を行います。最後に、冷却した1% Paraform aldehyde溶液で細胞を固定します。この際、気泡が入らないように注意してください。カバースリップの表面を蒸留水で洗浄して塩析を除去した後、細胞側を下に向けた状態で顕微鏡スライドガラスにマウントします。通常、OL FFR 62およびRTPと同様に、受容体の細胞表面染色は、結合抗体による蛍光シグナルの点状の外観によって特徴付けられます。この手法に習熟すれば、32〜40枚のカバーガラスの染色をわずか2時間半から3時間で完了させることができます。複数のカバーガラスを用いてこの手順を行う際は、細胞の乾燥を防ぐため、カバーガラスを1枚ずつ転送し、抗体インキュベーションを開始させることが重要です。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典:de March, C. A. et.al., 気相中の匂気物質による匂い受容体活性化のリアルタイム In Vitro モニタリング。J. Vis. Exp.

組換え細胞における匂い物質受容体活性化のリアルタイムモニタリング

アデニリルシクラーゼシグナル伝達の増感における抑制性Gタンパク質共役型の受容体の持続的活性化。本質的な分子経路を同定するために、偏りのないアプローチが必要であるが、この戦略は、スケーラブルな細胞ベースのcAMP増感アッセイの開発を必要とする。ここで、我々は、小分子およびsiRNAスクリーニングのために作アッセイを説明します。...

アデニリルシクラーゼの薬物誘発性感作：アッセイは、小分子およびsiRNAスクリーニング用途のために合理化·小型化

嗅覚受容体活性化パターンは、臭気の同一性をコードするが、哺乳類の嗅覚受容体に対する臭気物質リガンドを同定公表されたデータの欠如は臭気符号化の総合的なモデルの開発を妨げる。このプロトコルは、嗅覚受容体リガンドおよび受容体活性化の定量化のハイスループット同定を容易にする方法が記載されている。...

ルシフェラーゼ活性を介し受容体活性化の測定：哺乳類嗅覚受容体のハイスループット分析

嗅覚受容体の機能を特徴づける deorphanization...

生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイム キャンプ

安易な蛍光アッセイであるアミノ アミノアシル tRNA-合成酵素/tRNA ペア哺乳類細胞で発現したタンパク質に非正規のアミノ酸 (ncAAs) を組み込むことの効率を評価する. します。サイトと bioorthogonal GPCR の生きているセルのラベルを連結する光橋マッピングを含む ncAAs の G タンパク質共役受容体 (Gpcr)...

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気相で、嗅覚による嗅覚受容体活性化の In Vitro モニタリング リアルタイム

この記事では、解離された一次海馬培養におけるグルタミン酸受容体(GluR)の人身売買を研究する方法を紹介する。この方法は、内因性または過剰発現受容体を薬理学的アプローチと組み合わせて標識する抗体供給アプローチを用いて、変調によってGluR表面発現を調節する分子機構の同定を可能にする。内部化またはリサイクルプロセス。...

解離された原発性海馬培養におけるグルタミン酸受容体の密売を研究するための抗体摂食アプローチ

ここでは、蛍光顕微鏡を用いた異種細胞系におけるトランスにおけるリガンド-受容体相互作用を迅速かつ半定量的に測定するための最適化されたプロトコルを提示する。...

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本稿では、ハイブリダイゼーション、連鎖反応、RNA、ホールマウント蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(HCR、RNA、WM-FISH)を行い、蚊の触角と上顎触覚における化学感覚受容体遺伝子の空間的および細胞的分解能に関する洞察を明らかにするために必要な方法と試薬について説明します。...

ハイブリダイゼーション連鎖反応RNAホールマウント蛍光 蚊の嗅覚付属器における化学感覚遺伝子の in situ ハイブリダイゼーション

このプロトコルは、哺乳類のNeuro-2a細胞株を用いたニューロンのニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットの発現と定量を記述しています。pH感応蛍光タグと共焦点顕微鏡は、pH中性細胞内区画での受容体局在とpH中性細胞内区画での受容体の位置を正確に評価し、nAChRの輸送および薬理学的調節の研究を促進します。...

哺乳類細胞における細胞膜および細胞内ニコチン性アセチルコリン受容体の局在化

学ぼう、HEK293T細胞を用いた化学感覚受容体の表面発現検出法。生細胞染色と免疫蛍光顕微鏡で受容体局在を可視化し、GPCR研究に応用可能な手法を解説します。

異種細胞での化学感覚受容体の表面発現をアッセイ

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