膵島質量、サイズ分布とアーキテクチャのコンピュータ支援大規模可視化と定量化

この手順の全体的な目標は、限られたサンプル内で偏りのない代表的なデータを収集し、組織の複雑な3次元構造を正確に分析することです。これは、最初に免疫組織、化学的に染色された膵臓切片の仮想スライスをキャプチャすることによって達成されます。次に,仮想スライスはImage JソフトウェアのIHC仮想スライスマクロで定量化され,データはMathematica用に書かれたスクリプトで解析されます.

次に、仮想スライスの3D再構成は、画像Jを使用して実行されます手順の最後のステップは、スライドブックソフトウェアを使用して個々の島の画像のスタックをキャプチャし、ステレオ調査を使用して画像スタックを手動で3次元にマッピングすることです。各アイレットセルの3D座標を持つ最終的に正確なアイレットアーキテクチャは、3Dイメージングと手動マッピングを組み合わせた方法によって取得できます。この方法は、生理学的および生理学的条件の経路が膵臓、ベータ細胞質量アイレット分布、およびアーキテクチャにどのように影響するかなど、肥満および糖尿病研究の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の意味は、ベータ細胞量の変化をよりよく理解することで治療介入の開発と評価が容易になるため、肥満および糖尿病メリティシスの診断または治療にまで及びます。本研究で説明した方法は、特に膵臓の動的免疫組織化学的分析に関する洞察を提供しますが、他のさまざまな生物や組織にも適用できます。この手法は、コンピュータ支援による解析ステップの習得が難しいため、視覚的なデモンストレーションが重要です。

このような大規模なデータセットを 2 次元と 3 次元で分析するのは複雑だからです。この手順は、免疫組織、化学的に染色された膵臓の全セクションを保持するきれいなスライドを蛍光顕微鏡のホルダーに置くことから始めます。ステレオインベスティゲーターソフトウェアを開き、アクイジションをクリックしてサンプルを視覚化します。

そして、ライブ画像。蛍光の強度を表示するビデオヒストグラムウィンドウを使用して、各チャンネルの露光レベルを決定します。この例では、チャネル 2 が DAP に使用され、チャネル 3 は GFP チャネル 3、RFP はチャネル 4、チャネル 5 は sci 5、チャネル 6 は sci seven に使用されます。

カメラ設定ウィンドウを使用して、蛍光強度が減少するように露出レベルを調整します。ビデオヒストグラムの右端では、顕微鏡のフォーカスホイールで画像にピントを合わせることができます。仮想スライスを作成する前に、サンプルから離れた点で画面をクリックしてサンプルの輪郭を描きます。これにより、参照点がマークされます。

次に、輪郭が完成したら、サンプルの輪郭の周りをクリックします。右クリックして[close contour]を選択し、輪郭が閉じたら始点と終点を接続し、[acquisition]を選択してサンプルの仮想スライスをキャプチャし、次に仮想スライスを取得します。仮想スライス ウィンドウ オプションが開いたら、高速取得を選択し、手動を無効にします。

マニュアルの横のボックスのチェックを外してピントを合わせます。ファイルを保存します。プリセットを調整するには、右クリックして[フォーカスサイトリストに追加]を選択します。

仮想スライスプレビューでいくつかのランダムなセクションに手動でフォーカスする 複数のサイトにフォーカスが当てられたら、右クリックして選択して仮想スライスを開始します。最初のサンプルの仮想スライスが完了した後、prefoで仮想スライスを開始し、次のチャネルに切り替えて、それに応じて露出を調整します。この手順をチャネルごとに繰り返してアイレットの定量化を行い、最初に解析用にロードされた画像を準備し、次に細胞組成などのアイレットの特徴を定量化するI-H-C-V-Sという名前の画像Jマクロを使用して画像を処理します。

I-H-C-V-S マクロは、スタックをそれぞれのカラー チャネルに分割します。画像では、J は各画像を 8 ビットの白黒マスクに変換します。自動輝度の後、しきい値処理を行い、別々のチャネル画像を算術的に合成マスクに追加します。

画像Jの合成画像に組み込まれた粒子解析は、1つのベータセルより小さい粒子を除外しながら、関心領域またはROIを特定します。ROI の定量化。画像 J を使用すると、セル パラメーターのスプレッドシートが生成されます。

集計結果を Excel スプレッドシートに保存します。各アイレットの面積周囲真円度、fer 直径、アイレットの中心などのデータと、画像にラベル付けされた対応する番号を格納します。これらのパラメータの計算解析は、アイレット分布および周波数解析を含む情報を明らかにするために、ディレクトリ内のJP2画像の全てをTIFファイルに変換するスクリプトを実行することにより、仮想スライスの3D再構成を行うことができる。

ここでは、I MJ two two tiffというスクリプトを使用します。スクリプトを JP 2 イメージが格納されているディレクトリにコピーします。コンソールにドットスラッシュI am JP two two TIFFと入力し、Enterキーを押して、Linuxシェルでスクリプトを実行します。

キャプチャされたすべての画像がJP 2からTIFFファイルに変換されたら、画像Jでの分析に使用する準備が整います.画像Jを使用して、最初のサンプル(この場合は人間の胎児の膵臓からのもの)のすべての画像を開き、画像、色、色を選択してそれらを1つにマージします。 次に、チャネルをマージします。すべてのサンプルが 1 つの画像として結合されたら、各サンプルに対してこのプロセスを繰り返します。ポリゴン選択ツールで不要な領域を選択して、画像をクリーンアップします。

[編集] を選択して入力し、次に [塗りつぶし] を選択します。各画像をRGBカラー画像に変換します。最後に、画像からスタックを作成し、その後、stack reg プラグインを使用してさらに整列させることができます。

最終的に、チャネルをマージして画像を組み合わせると、膵臓全体のすべてのアイレットの3Dモンタージュが作成されます。画像スタックを収集するには、顕微鏡の下にマウント全体の膵臓アイレットを配置します。水浸対物レンズを使用する場合は、水を適用します。

スライドブックソフトウェアを開き、フォーカスコントロールウィンドウでcontrolキーとShiftキーとEキーを押して、キャプチャとフォーカスコントロールにアクセスします。アイレットのサイズに応じて、目標を20倍または40倍に設定します。顕微鏡の接眼レンズを使用してアイレットを見つけるには、ビンを2回に設定し、フィルターセットをユーザー1に設定します。

フォーカスコントロールウィンドウでは、発光選択を100%に設定する必要がありますニュートラル密度の目をワンクリックGFP eyに設定し、次に床を開いてスライドブックでサンプルを視覚化し、フォーカスコントロールウィンドウに戻り、フィルターを固定に切り替えます。次に、[G-F-P-D-S] をクリックします。ジョイスティックを使用して、アイレットをカメラの1つのウィンドウの中央にできるだけ配置します。

アイレットの中心付近で、細胞が識別しやすい深さまでピントを合わせます。フォーカスコントロールウィンドウで、ザブを選択します。スコープコントロールを使用して、特徴がはっきりと識別できるアイレットの一番上の深さまでスクロールし、[上部に設定]をクリックします。

アイレットの一番下までスクロールし、[設定] をクリックします。下部の[移動]をクリックします。キャプチャウィンドウの基準点に戻るには、[advanced]をクリックし、[alternate to channel]モードをクリックします。

ウィンドウの右側にある[ビン係数]を[2倍]に、[キャプチャタイプ]を[3D]に設定し、[上部と下部の位置を使用]をクリックし、キャプチャ後にボリュームを中央に戻します。ステップ サイズを 3 に設定します。フィルターセットをフィルターセットボックスの下に置くように設定します。

DAP、E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-u、および SCI five DSU を選択します。それぞれについて、[露出の調整]で[最適を検索]をクリックします。次に、[テスト]をクリックして、選択した露出が適切であることを確認します。

[開始] をクリックしてキャプチャを開始します。キャプチャが完了したら、必要に応じてレベルを調整し、RFPの表示色を白に変更します。スライドを保存し、TIFFシリーズのエクスポートを表示します。

スライドの名前を末尾にダッシュを付けて入力し、保存します。数十の個別のTIFファイルが作成されるため、各アイレット画像スタックを別々のフォルダに保持すると便利な場合があります。イメージスタックをマッピングするには、ステレオインベスティゲータソフトウェアを開きます。

画像の拡大縮小メニューで画像スタックを開いて、画像を視覚化します。画像間の距離を3ミクロンに設定して、2回の曲がりを補正します。スライドブックで、[X と Y のスケーリングを上書き] を選択し、x と Y のスケーリングのソースに指定を使用します。

XとYの両方の中心に0.65を入力し、ズームボタンをクリックして画像を拡大し、マクロウィンドウ市場で関心のある図の中央に少なくとも1つのセルを配置します。適切なマーカーを使用すると、ベータセルは緑色で表示されます。アルファセルは赤く表示され、デルタセルは白く表示されます。

核の中央にある細胞をマークします。サンプルがDPIで染色されている場合は青色で表示され、マーカー2を使用してベータ細胞をマークします。マーカー 5 はアルファ セルをマークし、マーカー 6 はデルタ セルをマークします。少なくとも1つのセルがマークされたら、トップメニューのアイコンを使用して直交ビューを表示し、Zフィルターと対称をオンにします。

範囲は 15.00 に設定する必要があります。0.0 Z.マウスホイールを使用してアイレットをスクロールし、各セルを適切なマーカーでマークし、各セルをその深さの中心に一度だけマークします。各 Z レベルのマーキングが終了したら、[Z フィルター] チェックボックスをオフにできます。

これにより、すべてのZレベルのすべてのマーカーが表示されます。すべてのセルにマークが付けられたら、ファイルを DAT ファイルとして保存します。次に、ファイルエクスポートトレースに進みます。

トレースをTXTファイルとして保存します。最後に、新しいアイレットのマッピングを試みる前に、新しいデータ ファイルをクリックしてワークスペースをクリアします。免疫組織化学染色した膵臓サンプルから仮想スライスを調製すると、膵島全体のアルファ、ベータ、デルタ内分泌細胞を一緒に検査することができ、膵島でのインスリンの免疫組織化学的染色は緑、グルカゴンは赤、ソマトスタチンは白、DAPは青で見ることができます。

その後、画像は自動しきい値処理後に 8 ビット マスクに変換されます。ここに示されているのは、マージされた合成イメージです。ただし、仮想スライスを使用したアイレット分布では、別々のチャネルで個別に分析することもできます。

ここでは、各チャネルのビューが示され、デルタ細胞、ベータ細胞、およびアルファ細胞が明らかになります。粒子解析は、各アイレット構造が青色で番号が付けられ、強調表示された複合マスクで実行されます。複合マスクの粒子解析は、検出されたアイレットごとにIslasエリアの周囲真円度や各種径などのパラメータを含むデータテーブルとして出力されます。これらのパラメータは、複合マスクの番号付きタグに対応するIDを持つことになります。

これらの画像を大規模に解析することで、アイレットの総数とサイズ分布のヒストグラムが作成され、アルファ、ベータ、デルタの細胞領域の詳細な比較が可能になります。アイレットマッピングと細胞組成と構造の数学的解析により、ステレオインベスティゲーターにアップロードされた人間のアイレットの画像の3D再構築スタックから単一の焦点面を明らかにすることができます。ここでは、ベータ細胞は緑色のアルファ細胞、赤色のアルファ細胞、白色のデルタ細胞、青色の核です。

異なるアイレットの捕獲に続いて、アルファ、ベータ、デルタ細胞がさまざまな海上平面でマークされ、蛍光画像と対応するマップデータが10ミクロン間隔で3つの異なる焦点面に表示されます。アルファセル、ベータセル、デルタセルがさまざまな平面でマークされると、アイレットを3Dで視覚化できます。ここに示されているのは、アイレット マッピングによって取得された座標に基づく quarter スライス アイレットの 3D 再構成です。

さらに、マッピングされたアイレットの自動数学的解析により、細胞の組成と構造を表示することができます。ここでは、単一細胞集団内の2つの細胞間の細胞細胞距離の相対度数が示されています。また、2つの異なる細胞集団間の細胞細胞距離の相対度数も示されています。

また、アルファ細胞からアルファ細胞、ベータ細胞からベータ細胞、デルタ細胞からデルタ細胞への細胞間距離分布の累積確率も示されています。これらの確率に対してコールOVスミルノフまたはKS検定を実行して、対応するKS距離を取得できます。一度習得すれば、組織切片全体の大規模なイメージングと解析を4時間で行うことができます。

組織ブロックの3D再構成は30分で行うことができます。最後に、3Dイメージングと手動マッピングは、適切に実行すれば4時間で完了できます。この手順を試みる際には、切片の高品質な免疫組織化学的染色から始めることが重要です。

その後の分析の精度は、すべて生データに依存します。また、開発後にこのような大規模な分析を処理するために、コンピューターに少なくとも8ギガバイトのRAMがあることを確認してください。この技術は、肥満や糖尿病の分野だけでなく、標準的な病理学的分析を使用する他の多くの分野で、研究者への道を開きました。

これは、サンプルの入手可能性が限られている場合に特に有用です。このビデオを見れば、標準的な手法を使用して限られたサンプルサイズ内で偏りのない代表的なデータを収集する方法を十分に理解できるはずです。特定の領域のみを選択することは、膵臓アイレット分布研究を使用して示したように、全体像を表していない可能性があります。