Name: 膵島質量、サイズ分布とアーキテクチャのコンピュータ支援大規模可視化と定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 59 s
Description: 学ぶコンピュータ支援による膵島の3D構造解析法。免疫組織化学染色と自動画像解析を組み合わせ、膵島のサイズ分布と細胞構成を正確に定量化し、糖尿病や肥満研究における膵島適応メカニズムの解明に貢献します。

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研究は、シカゴの糖尿病研究研修センター（動物モデルコア）、およびKovlerファミリー財団からの贈り物の大学に米国公衆衛生サービスグラントDK - 081527、DK - 072473とDK - 20595によってサポートされています。

1。免疫組織化学的染色像の仮想スライスを作成する<ol><li> StereoInvestigatorを開きます。顕微鏡のホルダーにサンプルを保持するクリーンなスライドを配置し、"取得"し、"ライブ映像"（取得→ライブ画像）をクリックして、ステレオインベでそれを視覚化する。各チャネルの曝露レベルを決定する;私たちの具体的な例では、チャンネル2はCy7 for DAPI、GFPのチャネル3、RFPのチャンネル4、Cy5とのチャネル5とチャネル6に使用されます。露出のレベルを決定するために、蛍光の強度を表示する"ビデオのヒストグラム"ウィンドウを使用します。適切な蛍光強度に到達しているときにビデオのヒストグラムの右端にある強度の尾オフ。曝露レベルは、"カメラ設定"ウィンドウで変更することができます。ビデオのヒストグラムは、顕微鏡のフォーカスホイールで集中することができます。 </li><li>仮想スライスを作成する前に、基準点を迎える離れてサンプルから点、で画面をクリックして、サンプルの輪郭の周囲にクリックして、サンプルを輪郭。輪郭が完了したら、右クリックし、開始点と終了点を接続するために"閉じる等高線"を選択します。 </li><li>輪郭がクローズされると、サンプル用の仮想スライス（取得→仮想スライスを取得）をキャプチャします。オープン時の仮想スライスウィンドウのオプション、"取得のハイスピー​​ド"だけでなく、隣にあるボックスをオフに焦点を自動選択する"マニュアル。"ファイルを保存します。 </li><li>仮想スライス定焦点にする、すなわち、サイトが仮想スライスのプレビューで、選択することにより、キャリブレーション（右クリック→サイトのリストをフォーカスするために追加）し、手動でいくつかのランダムなセクションを集中させる必要があります。いくつかのサイトがフォーカスされているときは、仮想スライス開始（右クリック→定焦点にすると仮想スライスを開始します）。最初のサンプルの仮想スライスが完了したら、次のチャンネルに切り替え、それに応じて露出を調整します。各チャネルごとにステップ4と5を繰り返します。 </li></ol> 2。コンピュータ支援2次元解析膵島の定量化<ol><li>画像は、最初の分析のためにロードされたイメージを準備してから、そのような細胞組成（すなわちβ-、α-、およびデルタ - 細胞集団、および島の各エリアとして膵島の機能を定量化する"IHCVS、"名前のImageJのマクロを使用して処理されます合計値の領域）。スタックは、個々のチャネルが免疫組織化学的染色に基づいて別々の画像を表示ImageJの、で、その別々のチャンネルに分割されます。各画像は、自動的に閾値画像の8ビットの白黒画像、またはマスクが、生成された後、閾値処理される。別々のチャンネルの画像は、複合マスクに算術的に加算され、そしてImageJのビルトインパーティクル分析は、合成画像上で実行されます。 </li><li>単一のβ細胞より小さい粒子排除しながらROIは次に識別されます（&lt;170μmの2;原ら、2003;エリアは〜15μmの直径を用いて計算）。結果としてROIを分析し、ImageJを用いて定量され、定量化は、境界（領域を取り巻く距離）、真円度（数値1.0は完全な円を描いている丸みの度合い）、フェレーの直径（エリア内で最も長い距離）とセンターを含めることができます。分析された各領域の座標は、そのように膵島の分布を数学的にこれらのパラメータをさまざまに組み合わせて分析し、3次元グラフにプロットすることができる、データはそのうちの数学的モデリングに使用されます。単一の仮想スライス画像は30秒で分析されます。複数の画像は、ImageJのマクロ言語でサポートされているループの構文に画像処理と解析のスクリプトを埋め込むことにより、分析することができます。ループは、指定されたディレクトリ内のすべてのファイルを開き、画像を分析し、Excelファイルなどの新しい場所に結果を出力します。 </li><li>集計結果は、画像にラベルが付いた対応する番号と共に、そのような面積、周囲、真円度、フェレーの直径、及び各島のための膵島の中心としてデータを格納し、Excelスプレッドシートに保存されます。 </li></ol>計算解析およびヒストグラムのセットアップ<ol><li>一度起動すると自動的に実行されるMathematicaのスクリプトは、エントリの数十万人にのぼる、収集されたスプレッドシートのデータを処理するために使用されます。実行される重要なプロセスの一つは、サイズ分布を調べるために、また、データに外れ値を決定するために使用されるヒストグラムを構築する周波数解析、です。スクリプトの下、総膵島面積を測定し、他のパラメータと比較して、特に時間のポイントや膵臓の年齢に、それに応じてグラフで表示されます。 </li></ol> 3。二次元免疫組織化学的染色仮想スライス画像の三次元再構成仮想スライスの三次元再構成<ol><li>そのディレクトリ（すなわち、フォルダ）にスクリプトを（"im_jp2_2_tiff"）にコピーしますJP2画像が含まれています。コンソールに"./im_jp2_2_tiff"と入力してEnterキーを押すことによって、Linuxのシェルでスクリプトを実行します。このスクリプトを実行すると、自動的に仮想スライスから三次元スタックの構築と定量化に使用されるフ​​ォーマットであるTIFFファイル、にディレクトリでJP2画像のすべてを変換します。 （注：それが正常に実行できるように、スクリプトにテキストフ​​ァイルを変換するスクリプトが実行されない場合に"chmod + x im_jp2_2_tiff"のタイプ、） </li><li>撮影した画像のすべてのJP2からTIFFファイルに変換されているときに、彼らはImageJの解析に使用する準備が整いました。 </li><li> ImageJのと、最初のサンプル（この場合は5枚の画像：DAPI、GFP、RFP、Cy5で、Cy7）のためにすべての画像を開いて、1つのイメージ（画像→色→マージチャンネル）として、それらをマージ。試料の各々に対して、このプロセスを繰り返します。サンプルのすべてが単一の画像として結合されているときは、"多角形選択"ツールで不要な領域を選択して（編集→塗りつぶし）でそれらを埋めることで画像をきれいに。 （必要に応じて、小さいサイズに画像サイズを変更します）。その後、RGBカラー画像（イメージ→タイプ→RGBカラー）にそれぞれの画像を変換する。最後に、必要に応じて、それらはさらに、"スタックレッグ"プラグインを使用して整列することができる後に、画像の外スタック（スタックのイメージ→スタック→画像）を作成します。最終的に、チャンネルをマージして、画像を組み合わせることで全体の膵臓のランゲルハンス島のすべての3Dモンタージュを作成します。画像を表示するには、"プラグイン"し、をクリックし、"3Dビューア。" </li></ol> 4。膵島のマッピング画像のスタックの収集<ol><li>顕微鏡下で全体のマウント膵島を位置づける。 </li><li> Slidebookソフトウェアを開きます。 "Ctrl + Shiftキー+ E"を押して"コントロールをキャプチャし、フォーカスを"アクセス"フォーカスのコントロール"ウィンドウでは、膵島の大きさに応じて、20倍または40倍、に目標を設定します。水浸対物レンズを使用している場合は水を適用します。 </li><li>島を見つけるために顕微鏡の接眼レンズを使用するためには、"ビン""フォーカスのコントロール"ウィンドウで、2xおよびUser1にフィルタセットを設定することを設定します。 "排出量の選択は、"100％の目とニュートラルデンシティに1に設定する必要があります。 "GFP EY"をクリックし、"開くフルーア。" </li><li> Slidebookのサンプルを視覚化するために、フォーカスに戻すウィンドウを制御し、"ライブ"とクリックして"フィルタセット"切り替える"GFP DSを。"中央にカメラ1ウィンドウ内の膵島を可能な限りジョイスティックを使用してください。どこかのセルを簡単に識別できる膵島の中心部に近い深さに焦点を当てる。 </li><li>で"フォーカスコントロール]ウィンドウ、""Zのタブ"を選択します。基準点としての現在の深さを設定するには、ウィンドウの左上隅に設定]をクリックします。機能が明確に識別できるれた膵島の一番上の深さにスクロールし、クリックして、スコープのコントロールを使用して、"トップを設定してください。"膵島の一番下までスクロールし、クリックして"設定ボトムを。"基準点に戻るには"Go"をクリックしてください。 </li><li> [キャプチャ]ウィンドウで、設定された"ビンのファクターは""2倍"とする"フィルタセット"を設定する"ライブを。" "3D"（とのみ3D）に、"キャプチャの種類"を設定します。ウィンドウの右側に、"トップとボトムの位置を使用"をクリックします。 "キャプチャした後、ポイントを参照に戻る"をクリックします。に、"ステップサイズ"を設定して"3。" </li><li>下にある"フィルタセットボックス、"DAPI DSU、GFP DSU、RFP DSU、およびCy5 DSUを選択。それぞれについて、"露出を調整し、"選択した露出が適していることを確認するために"Test"をクリック下の"ベスト検索"をクリックします。キャプチャを開始する"スタート"をクリックします。 </li><li>キャプチャが完了すると、必要に応じてレベルを調整し、白にRFPのための表示色を変更。スライドを保存し→エクスポート→TIFFシリーズの表示に進みます。最後にダッシュでスライドの名前を入力して保存します。個々のTIFFファイルの数十が作成されているので、別のフォルダに各膵島の画像のスタックを維持すると便利かもしれません。 </li></ol>マッピング画像のスタック<ol><li>ステレオ調査官を開きます。画像スタックを（ファイル→画像のスタック→画像のスタックを開く）開いて、イメージを視覚化する。 3.00μmまでの"イメージスケーリングのメニュー、"セット"の画像間の距離"。 Slidebookで2Xビニングを補正するために、"上書きXとYのスケーリング"とスケーリング"XとYのソースに指定されたユーザーを"選択し、XとYの両方のために0.65を入力してください</li><li>センターへの関心の膵島の途中でクリックして画像"マクロウィンドウ。"適切なマーカーを使用して少なくとも1つのセルをマーク。 β-細胞が緑色に表示される、α細胞が赤色表示され、デルタ細胞は白色表示されます。使用マーカー2（中空円）α細胞をマークするβ細胞、マーカー5（中空の三角形）をマークすると、マーカー6（デルタ細胞に中空の三角形）。細胞は、サンプルをDAPIで染色されている場合は青色に表示される彼らの核の中心部にマークされている必要があります。 </li><li>少なくとも一つのセルがマークされたら、上部メニューのアイコンを使用して、"直交View"を表示。 "Z -フィルター"と確認して"対称を。"範囲のhould 15.00に設定する。 0.0 Zのレベルから、マウスのホイールを使用して膵島をスクロールし、適切なマーカーで各セルをマーク。各セルは、その深さの中央に一度だけマークする必要があります。 Z -の各レベルをマーキング仕上げ時には、"Z -フィルター"チェックボックスをオフにすることができます。これはZ -レベルのすべてのマーカーのすべてが表示されます。 </li><li>すべてのセルにマークが設定されているときは、"DAT"ファイルとしてファイルを保存し、→エクスポートトレースをファイルに進みます。 "TXT"ファイルとトレースを保存します。新しい島をマップしようとする前にワークスペースを消去するには、"新規データファイルを"クリック。 </li></ol> 5。代表的な結果： 免疫組織化学染色した膵臓のサンプルの仮想スライスの準備よりは両方一緒に膵島（図1A）として、個別に別々のチャネルで、全体の膵臓の内分泌細胞（α、β、およびδ-細胞）のすべてを検査するものを可能にします（図1B）。コンピュータのプログラムやスクリプトの助けを借りて、大規模データの質量分析は、これらの仮想スライスを行うことができます。特に、複合マスク（図1C）の粒子解析では、膵島面積、周囲（地域を取り巻く距離）、循環（1.0は完全な円を表す真円度、）などのパラメータが含まれている統計表として出力し、 （図1D）検出されたそれぞれの島のためのフェレーの直径（エリア内で最も長い距離）。合計膵島数とサイズ分布のヒストグラムと同様にα-、β-、およびデルタ - セル領域の詳細な比較の生産におけるこれらのイメージの結果の大規模解析。さらに、各仮想スライスは約5μmの深さで撮影され、そして個々の2D仮想スライスのすべては、さらに全体の膵臓サンプルの3D再構成を作成するために積まれている。膵島マッピングは、3Dでの島を捉えるだけでなく、別のインスタンスを示していますが、さらに詳細なコンピューター支援解析。膵島のマッピングは、異なる島のキャプチャ（図2A）およびα-、β-、および3D（図2C、D）の膵島を可視化するために様々なZ -平面（図2B）におけるδ-細胞のマーキングの後続で構成されています。マップされた膵島の自動化された数学的解析は、細胞間の距離（図2E）と細胞間の距離の分布（図2F）の累積確率を含めて、それらの細胞構成とアーキテクチャを表示します。 <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1仮想スライスを使用して膵島の分布の大規模なキャプチャと分析。ヒト膵臓部のA.バーチャルスライスビュー。 A.インスリンの免疫組織化学的染色（緑）、グルカゴン（赤）、ソマトスタチン（白）とDAPI（青）。 B.自動二値化後の8ビットマスクを変換する。箱入りの面積は、各チャネルのBB回数で拡大されます。 A.デルタ細胞、Bのβ-細胞、C. α-細胞、およびD.合成画像をマージ。 C.パーティクル分析は、複合マスク時に実行。小細胞クラスターを含む各膵島の構造が（青色のハイライト）番号が付けられていることに注意してください。 C.に示すようにタグに対応するIDを持つ個々の構造物について測定された様々なパラメータのD.統計表、 <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig2.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図2。免疫組織化学的仮想スライスの分析。エリア、真円度とフェレーの直径などのパラメータによって、各島の大きさと形状分布を示す図1のAの3次元の散布図。携帯膵島構成とサイズを示す図1のBの3次元散布図。図1から全体の人間のセクション分析のC.膵島のサイズ分布は、対数正規確率密度分布に装着。携帯組成比のD.数理解析（β-細胞における緑、青に赤とデルタ細胞におけるα-細胞）図1の各膵島有効径ビン用。 E. A.ランダムサンプリング免疫組織化学的分析の膵島のサイズ分布（左）。仮想スライスの分析の膵島のサイズ分布（右）。 B.ランダムサンプリング免疫組織化学的分析（赤）と仮想スライス（青）の対数正規プロットの比較。 <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。膵島のマッピングと細胞構成と建築の数学的分析。 ：ステレオ-調査官にアップロードされたヒト膵島の画像の3次元再構成されたスタック（赤の緑、α-細胞におけるβ-細胞、白のデルタ細胞、および青色の核）から単一の焦点面を示すスクリーンキャプチャ。 B：蛍光画像（左）と10μmの間隔で示すように、3つの異なった焦点面内の対応するマップされたデータ（右）。 C：3D再構築された膵島のマッピングデータの代表ビュー。 D：小島マッピングによって得られた座標に基づいて四半期スライス膵島の三次元再構成。 E：細胞構成とアーキテクチャの数理解析。 LEFT。単一の細胞集団の2つのセルの間に細胞間の距離の相対度数。右側。二つの異なる細胞集団の間で細胞間の距離の相対度数。 F：コルモゴロフスミルノフ（KS）テスト。残しました。 α-へ-α、β-に-β、およびデルタからデルタ細胞に対する細胞間距離分布の累積確率。右側。対応する三つの累積確率のためのKSの距離。

<ol><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+plasticity+-+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22ISLETS%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet plasticity - Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> ISLETS. 2, 135-145 (2010).</li>
<li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Wojcik, P. l, Kilimnik, G., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+architecture+-+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22ISLETS%22%5BJournal%5D)">Islet architecture - a comparative study.</a> ISLETS. 1, 129-136 (2009).</li>
<li>Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+pancreatic+islet+distribution+in+situ+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).</li>
<li>Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li>
<li>Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

コンピュータ支援大規模可視化と定量化は、膵島の研究で4つのキーポイントを買う余裕がここに提示さ：（1）膵標本の大規模解析は、全体的な膵島のサイズ分布と膵島のアーキテクチャの包括的なビューを提供します。 （2）3次元再構成と細胞構成と建築の数学的解析は、さらに膵島内の内分泌細胞の空間配置の検討を促進する。 （3）異なる種の間で、様々な病態生理学的条件下で、同じ種で顕著な膵島の可塑性は、むしろ種の違いよりも、代謝の変化に応じて進化的に獲得した適応を提案するかもしれない。 （4）内分泌細胞組成および膵島のアーキテクチャの転位は、特定の遺伝子発現の変化に伴って、さらにintraislet内分泌細胞のネットワークの役割の重要性を示唆し、その機能的特性の膵島の適応を、反映しているのかもしれない。

<table><tbody><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>顕微鏡</td><td>オリンパス株式会社</td><td>IX-81</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Investigator</td><td>プログラム</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIP-GFPマウス</td><td>マウス</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mathematica</td><td>プログラム</td><td>Wolfram</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>プログラム</td><td>アメリカ国立衛生研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook</td><td></td><td>プログラム</td><td>オリンパス</td><td></td></tr></tbody></table>

膵島質量、サイズ分布とアーキテクチャのコンピュータ支援大規模可視化と定量化

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

膵島は、β-細胞（インスリン）、α細胞（グルカゴン）、および外分泌組織の中に埋め込まれ、1を構成しているデルタ-細胞（ソマトスタチン）のようないくつかのホルモンを分泌する内分泌細胞から構成されるユニークな微小器官である - 全体膵臓の2％。体と膵臓の重量との間には密接な関係があります。全β-細胞塊はまた、体内でインスリンの需要を補うために比例して増加する。何がこの比例拡大は島のサイズ分布であるエスケープします。人間のような大型動物は、この微小器官を機能させるために一定のサイズ制限があることを示唆し、マウスと同様の膵島のサイズ分布を共有します。比例的に大きな島を生成するために大規模な動物の膵臓の無力は、膵島の数の増加と、自分たちの全体的な膵島のサイズ分布に大きな島の割合の増加によって補償される。また、膵島は、異なる種間の​​細胞構成とアーキテクチャにと、様々な病態生理学的条件の下で同じ種の中で印象的な可塑性を示す。本研究では、我々はそのような動的な生物学的プロセスや複雑な構造の研究では大規模で異種データ収集の分析を可能にする分析プロセスの自動化を容易にするために生物学的画像データの分析のための新しいアプローチを説明します。このような研究は、原因について、公正なサンプリングの技術的な問題に妨げと大規模データを生成する正確小島生物学の生物学的プロセスの複雑さを捉えるために設定されています。ここではサンプルの入手が限られて（またはサンプルのコレクションを最小限にする）と標準的な実験的な設定の中で公平な&quot;代表的な&quot;データを収集するため、および膵島の複雑な三次元構造を正確に分析する方法を示しています。コンピュータ支援自動化は、大規模データセットの収集と分析を可能にし、またデータの公平な解釈を保証します。さらに、膵島のサイズ分布と空間座標（すなわちX、Y、Z -位置）の正確な定量ができないだけ膵島の構造や組成の正確な可視化につながるだけでなく、私たちは変更の条件に、開発と適応の間にパターンを識別することができます数学的モデリングを介して。本研究で開発した手法は、同様に他の多くのシステムと生物の研究に適用可能である。

免疫組織化学染色した膵臓標本の大規模な調達と分析の新たなコンピュータ支援の方法が説明されています：セクション全体の（1）仮想スライスのキャプチャを、大規模データの（2）質量分析、2D仮想スライスの（3）復興（4）3Dの膵島のマッピング、および（5）数理解析。

膵島は、ベータ細胞（インスリン）、アルファ細胞（グルカゴン）などの複数のホルモン分泌内分泌細胞で構成される独自の微小器官であり、...

本手順の全体的な目的は、限られたサンプル内から偏りのない代表的なデータを収集し、組織の複雑な三次元構造を精密に解析することです。これは、まず免疫組織化学的に染色された膵臓切片の仮想スライスをキャプチャすることで達成されます。次に、Image JソフトウェアのIHC仮想スライスマクロを用いて仮想スライスを定量化し、Mathematica用に作成されたスクリプトでデータを解析します。次に、Image Jを用いて仮想スライスの3D再構築を行います。手順の最終ステップとして、Slidebookソフトウェアを使用して個々の膵島画像のスタックをキャプチャし、Stereo Investigatorを用いて画像スタックを3次元的に手動でマッピングします。最終的に、3Dイメージングと手動マッピングを組み合わせた手法により、各膵島細胞の3D座標を伴う精密な膵島構造を得ることができます。この手法は、生理学的および病態生理学的条件が膵β細胞量、膵島の分布、および構造にどのように影響するかなど、肥満および糖尿病研究分野における重要な疑問への回答に寄与します。β細胞量の変化をより深く理解することは、治療的介入の開発と評価を促進するため、本手法の意義は肥満や糖尿病の診断または治療にまで及びます。本研究で述べた手法は具体的に膵臓の動的な免疫組織化学的解析への洞察を提供するものですが、他のさまざまな生物や組織にも適用可能です。コンピュータ支援解析の手順は習得が困難であるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。2次元および3次元でこのような大規模なデータセットを解析することは複雑であるため、本手順では、まず化学染色を施した膵臓の免疫組織切片全体を載せた清潔なスライドを蛍光顕微鏡のホルダーに設置します。Stereo Investigatorソフトウェアを起動し、「acquisition」をクリックしてサンプルを可視化してください。次にライブイメージングを行います。蛍光強度を表示するビデオヒストグラムウィンドウを使用して、各チャンネルの露光レベルを決定します。この例では、チャンネル2をDAPIに、チャンネル3をGFPに、チャンネル4をRFPに、チャンネル5をsci5に、そしてチャンネル6をSCI7に使用しています。カメラ設定ウィンドウを使用して、蛍光強度が減衰するように露光レベルを調整します。ビデオヒストグラムの右端を確認しながら、顕微鏡のフォーカスホイールでピントを合わせます。バーチャルスライスを作成する前に、サンプルの外側の画面上の点をクリックしてサンプルの輪郭を囲み、参照点を設定します。次に、輪郭が完了したらサンプルの輪郭に沿ってクリックします。輪郭が閉じたら、右クリックして「close contour」を選択し、始点と終点を接続します。「acquisition」を選択してサンプルの仮想スライスをキャプチャし、「acquire virtual slice」を実行します。仮想スライスのウィンドウオプションが開いたら、「high speed acquire」を選択し、「manual」を無効にします。「manual」の横にあるチェックボックスを外してフォーカスを合わせます。ファイルを保存します。右クリックして「add to focus site list」を選択し、prefoをキャリブレーションします。仮想スライスのプレビュー画面で、ランダムに数箇所の手動フォーカスを行います。複数の部位のフォーカスが完了したら、右クリックして「Start virtual slice with prefo」を選択し、仮想スライスを開始します。最初のサンプルの仮想スライスが完了した後、次のチャンネルに切り替え、適切に露光時間を調整します。この手順を各チャンネルで繰り返し、アイレットの定量化を行います。その後、「I-H-C-V-S」という名称のImageJマクロを用いて画像を処理します。このマクロは、まず読み込んだ画像を解析用に準備し、次いで細胞組成などのアイレットの特徴を定量化します。I-H-C-V-Sマクロは、スタックをそれぞれのカラーチャネルに分割します。ImageJで各画像を8ビットの白黒マスクに変換します。その後、自動的な強度閾値設定を行い、分割されたチャネル画像を算術的に加算して複合マスクを作成します。その後、コンポジット画像に対してImage Jの組み込み粒子解析を行うことで、1つのβ細胞よりも小さい粒子を除外しながら、関心領域（ROI）を特定します。Image Jを用いてROIの定量化を行うことで、細胞パラメータのスプレッドシートが作成されます。集計した結果をExcelスプレッドシートに保存します。各アイレットの面積、周囲長、円形度、Fer径、およびアイレット中心などのデータを、画像に付与された対応する番号とともに保存してください。これらのパラメータの計算分析は、書面によるプロトコルに記載されている通りに実施できます。アイレットの分布や頻度分析などの情報を明らかにするには、ディレクトリ内のすべてのJPG画像をTIFファイルに変換するスクリプトを実行し、仮想スライスによる3D再構成を行います。TIF形式は、仮想スライスから3次元スタックを構築し定量化するために使用される形式です。ここでは、I MJ two two tiffというスクリプトを使用します。このスクリプトをJP2画像が含まれているディレクトリにコピーしてください。コンソールにdot slash I am JP two two TIFFと入力し、Enterキーを押してLinuxシェルでスクリプトを実行します。キャプチャしたすべての画像がJPEG 2からTIFFファイルに変換されたら、ImageJでの解析に使用できるようになります。ImageJを使用して、最初のサンプル（本例ではヒト胎児膵臓）のすべての画像を開き、[Image]、[Color]、そして[Merge Channels]を選択して、それらを1つの画像に統合します。この工程を各サンプルに対して繰り返し、すべてのサンプルを単一の画像として統合します。ポリゴン選択ツールを使用して不要な領域を選択し、画像をクリーニングします。「Edit」を選択し、「Fill」を行うことで塗りつぶします。次に、各画像をRGBカラー画像に変換します。最後に、画像からスタックを作成し、stack regプラグインを用いてさらにアライメントを行います。最終的に、チャンネルをマージして画像を統合することで、膵臓全体のすべてのアイレットの3Dモンタージュが作成されます。画像スタックを収集するには、膵臓アイレットのホールマウント標本を顕微鏡下に設置します。水浸用対物レンズを使用する場合は、水を滴下してください。スライドブックソフトウェアを開き、フォーカスコントロールウィンドウでCtrl + Shift + Eを押して、キャプチャおよびフォーカスコントロールにアクセスします。アイレットの大きさに応じて、対物レンズを20倍または40倍に設定してください。顕微鏡の接眼レンズを使用してアイレットを特定するには、binを2倍に設定し、フィルターセットをuser 1に設定します。フォーカス制御ウィンドウで、エミッション選択を100%Eyesに設定し、ニュートラル密度をGFP eyの1クリック分に設定します。次に、スライドブックでサンプルを可視化するためにフロアを開き、フォーカス制御ウィンドウに戻ってフィルターセットをfixに切り替えます。その後、G-F-P-D-Sをクリックします。ジョイスティックを使用して、カメラ1ウィンドウ内でアイレットを可能な限り中心に合わせます。細胞が容易に識別できるアイレットの中心付近の深さに焦点を合わせます。フォーカス制御ウィンドウでzabを選択します。スコープ制御を使用して、構造が明確に識別できるアイレットの最上部の深さまでスクロールし、set topをクリックします。アイレットの最下部までスクロールし、「set」をクリックします。最下部をクリックして実行してください。キャプチャウィンドウのリファレンスポイントに戻るには、「advanced」をクリックし、次に「alternate to channel mode」をクリックします。ウィンドウの右側で、ビンファクターを2倍に、キャプチャタイプを3Dに設定し、「use top and bottom positions」および「return to center volume after capture」をクリックして有効にします。ステップサイズを3に設定します。フィルターセットボックスの下にあるフィルターセットを「live」に設定します。DAP、E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U、およびSCIの5つのDSUを選択します。それぞれについて、「adjust exposure」にある「find best」をクリックします。次に、「test」をクリックし、選択した露光量が適切であることを確認します。「Start」をクリックしてキャプチャを開始します。キャプチャが完了したら、必要に応じてレベルを調整し、RFPの表示色を白に変更します。スライドを保存し、「view export TIFF series」に移動します。スライド名を入力し、最後にハイフンを付けて保存します。多数の個別のTIFファイルが作成されるため、各アイレットの画像スタックを別々のフォルダに保存しておくと便利です。画像スタックをマッピングするには、Stereo Investigatorソフトウェアを開いてください。画像スケーリングメニューで画像スタックを開き、画像を可視化します。2倍の屈折を補正するため、画像間の距離を3 µmに設定します。Slidebookで「XおよびYスケーリングを上書き（override X and Y scaling）」を選択し、XおよびYスケーリングのソースとして「指定（specified）」を使用します。X中心およびY中心の両方に0.65と入力し、ズームボタンをクリックして画像を拡大します。次に、マクロウィンドウ内の目的の島の中央で、少なくとも1つの細胞をマークしてください。適切なマーカーを使用すると、ベータ細胞は緑色に、アルファ細胞は赤色に、そしてデルタ細胞は白色に表示されます。核の中心にマークを付けます。サンプルがDPIで染色されている場合、核は青色に表示されます。マーカー2でβ細胞を、マーカー5でα細胞を、マーカー6でδ細胞をそれぞれマークしてください。少なくとも1つの細胞にマークを付けたら、トップメニューのアイコンを使用して直交表示（orthogonal view）を表示し、「Z filter」と「symmetric」にチェックを入れます。レンジを15.00に設定します。Z軸の0.0から開始し、マウスホイールを使用してアイレットをスクロールさせ、各細胞に適切なマーカーで印を付けます。各細胞の深さの中央に一度だけ印を付けてください。各Zレベルのマーキングが完了したら、Zフィルターのチェックボックスのチェックを外すことができます。これにより、すべてのZレベルのすべてのマーカーが表示されます。すべての細胞にマークを付けたら、ファイルをDATファイルとして保存してください。次に、「ファイル」から「エクスポート」の「トレーシング」を選択します。トレースをTXTファイルとして保存します。最後に、新しいアイレットのマッピングを試みる前に、「new data file」をクリックしてワークスペースをクリアしてください。免疫組織化学染色を施した膵臓サンプルから仮想スライスを作成することで、膵臓全体のα細胞、β細胞、およびδ細胞などの内分泌細胞をアイレットとしてまとめて検査することが可能になります。インスリンの免疫組織化学染色は緑色、グルカゴンは赤色、ソマトスタチンは白色、DAPIは青色で表示されます。その後、自動しきい値処理を用いて、画像を8ビットマスクに変換しました。ここに表示されているのはマージ合成画像です。ただし、仮想スライスを用いたアイレット分布の解析により、個別のチャンネルで個別に分析することも可能です。ここでは、デルタ細胞、ベータ細胞、およびアルファ細胞を明らかにするために、各チャネルのビューを示します。各アイレット構造に番号を振り、青色でハイライトした複合マスクを用いて粒子解析を行いました。複合マスクの粒子解析の結果はデータテーブルとして出力され、検出された各アイレットについて、面積、周囲長、円形度、および各種直径などのパラメータが含まれています。これらのIDは、複合マスク上の番号付きタグに対応しています。これらの画像を大規模に解析することで、アイレットの総数とサイズの分布ヒストグラムを作成し、α細胞、β細胞、およびδ細胞の面積を詳細に比較することができます。アイレットのマッピングおよび細胞組成と構造の数学的解析により、Stereo Investigatorにアップロードされたヒトアイレットの3D再構成画像スタックから、単一の焦点平面を抽出することが可能です。ここでは、β細胞を緑色、α細胞を赤色、δ細胞を白色、核を青色で示しています。個別のアイレット（eyelet）をキャプチャした後、ここでさまざまな海面レベル（sea planes）においてアルファ細胞、ベータ細胞、およびデルタ細胞をマーキングします。ここでは、10 microns間隔の3つの異なる焦点面における蛍光画像と対応するマップデータを示しています。さまざまな面でアルファ、ベータ、およびデルタ細胞をマーキングすると、アイレットを3Dで可視化できます。ここに示しているのは、アイレットマッピングによって得られた座標に基づく、4分の1にスライスされたアイレットの3D再構成図です。さらに、マッピングされたアイレットの自動数学的解析により、細胞組成と構造を表示することが可能です。ここでは、単一の細胞集団における2つの細胞間の細胞間距離の相対頻数を示しています。また、2つの異なる細胞集団間における細胞間距離の相対頻数も示しています。また、α細胞からα細胞、β細胞からβ細胞、およびδ細胞からδ細胞への細胞間距離分布の累積確率も示しています。これらの確率に対してコルモゴロフ・スミルノフ（KS）検定を行うことで、対応するKS距離を得ることができます。習得すれば、組織切片全体の広範囲なイメージングと解析を4時間で完了させることが可能です。組織ブロックの3D再構築は30分で完了できます。最終的に、適切に行えば3Dイメージングとマニュアルマッピングは4時間で完了します。本手順を行う際は、切片の高精度な免疫組織化学染色から開始することが重要です。その後の解析の精度は、すべて生データに依存します。また、開発後のこのような大規模な解析を処理するために、コンピュータに少なくとも 8 GB の RAM が搭載されていることを確認してください。この手法は、肥満や糖尿病の分野だけでなく、標準的な病理学的解析を用いる多くの他の分野の研究者にとっても道を開くものとなりました。この手法は、特にサンプル数が限られている場合に有用です。このビデオを視聴することで、標準的な手法を用いて、限られたサンプルサイズ内で偏りのない代表的なデータを収集する方法について十分に理解できるはずです。膵島分布の研究で示したように、特定の領域のみを選択すると、全体の状況を代表しなくなる可能性があります。

computer-assisted-large-scale-visualization-quantification-pancreatic

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

以下のプロトコールは、膵臓の仮想スライスイメージングのための解剖、および全体の膵臓内のすべてのGFPタグ付きβ-細胞のその後の定量化のプロセスを概説します。...

マウスにおける膵β細胞の質量のその場定量に

我々は、光学投影断層撮影（OPT）の適応を述べる...

糖尿病研究におけるβ細胞の質量分布のアセスメント用の赤外線光学投影断層近く

クリア方法最適化されたプロトコルを使用して 3 次元 (3 D)...

ひと膵臓の神経島国的なネットワークの高解像度の 3 D イメージング

この島分離プロトコルは、外分泌組織を消化するコラゲナーゼ注射の新しい経路と、マウスから島を精製するための簡略化された勾配手順を説明した。これは、酵素消化、勾配分離/精製、およびアイレット手摘みを含みます。分離に成功すると、マウスあたり250~350の高品質で完全に機能する島が生じます。...

マウスからの膵島分離のための簡単な高効率プロトコル

ここでは、膵島細胞などの異種細胞集団におけるカルシウム動態をイメージングおよび定量するためのプロトコルを提示する。蛍光レポーターは、イヌビレット内の細胞の末梢層に送達され、次いで固定化および画像化され、蛍光強度のダイナミクスの細胞単位分析が行われます。...

マウス膵島細胞の亜集団におけるカルシウムダイナミクスのイメージング

このプロトコルの目的は、ヒト膵島の生着プロセスと寄与する宿主対ドナー細胞のダイナミクスを継続的に監視することです。これは、NODの眼の前房(ACE)にヒトの小島を移植することによって達成される。(Cg)-Gt(ローザ)26Sortm4-Rag2-/-マウスの受信者に続いて2光子イメージングを繰り返す。...

前眼室におけるヒト膵島移植および寄与宿主細胞のイメージングと定量

膵臓内イメージングウィンドウを用いたマウスモデルにおける膵臓の細胞レベル可視化におけるビ ボ における縦方向の安定化

このプロトコルでは、膵島は、専用のマルチプラットフォームアプリケーションに実装された計算アルゴリズムを使用して再構築および分析されます。...

構造・機能解析ツールとしての膵島の計算再構成

このプロトコルは、死亡した臓器提供者からヒトの膵臓スライスを生成して、生理学的に近い条件下で細胞機能を研究する方法を説明しています。この革新的なアプローチにより、正常および構造的に損傷した膵島と、内分泌コンパートメントと外分泌コンパートメント間の複雑な相互作用の調査が可能になります。...

内分泌および外分泌膵臓生理学を研究するためのヒト膵臓組織スライスの生成

メタゲノムライブラリの大規模スクリーン

学ぶコンピュータ支援による膵島の3D構造解析法。免疫組織化学染色と自動画像解析を組み合わせ、膵島のサイズ分布と細胞構成を正確に定量化し、糖尿病や肥満研究における膵島適応メカニズムの解明に貢献します。

膵島質量、サイズ分布とアーキテクチャのコンピュータ支援大規模可視化と定量化

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