Name: 内タンパク質の定方向進化のための変異導入と機能選択プロトコル E.大腸菌 /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 学ぶランダム変異ライブラリー作成と機能選択を用いたタンパク質の定方向進化プロトコル。大腸菌のミューテーター株を利用し、新規酵素活性の獲得変異を効率的に同定する方法です。

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<ol><li>Camps, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+ColE1-like+plasmid+replication+for+recombinant+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat+DNA+Gene+Seq%22%5BJournal%5D)">Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression.</a> Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).</li>
<li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+replication+of+plasmid+ColE1+DNA+by+RNA+polymerase%2C+ribonuclease+H%2C+and+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).</li>
<li>Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ColE1+replication+control+circuitry%3A+sense+from+antisense%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ColE1 replication control circuitry: sense from antisense.</a> Cell. 55, 929-932 (1988).</li>
<li>Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+evolution+in+Escherichia+coli+using+a+highly+error-prone+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).</li>
<li>Shinkai, A., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+mutagenesis+by+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I.+Ile%28709%29+in+motif+A+functions+in+base+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I. Ile(709) in motif A functions in base selection.</a> J Biol Chem. 276, 46759-46764 (2001).</li>
<li>Uyemura, D., Lehman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+mutant+forms+of+DNA+polymerase+I+from+Escherichia+coli.+I.+The+polA12+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of mutant forms of DNA polymerase I from Escherichia coli. I. The polA12 mutation.</a> J Biol Chem. 251, 4078-4084 (1976).</li>
<li>Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+removal+of+alkylation+damage+from+DNA+by+AlkB+and+related+DNA+dioxygenases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases.</a> Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).</li>
<li>Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27evolvability%27+of+promiscuous+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The 'evolvability' of promiscuous protein functions.</a> Nat Genet. 37, 73-76 (2005).</li>
<li>Elena, S. F., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+experiments+with+microorganisms%3A+the+dynamics+and+genetic+bases+of+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation.</a> Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).</li>
<li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoFormation+of+an+RNA+primer+for+initiation+of+replication+of+ColE1+DNA+by+ribonuclease+H%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).</li>
<li>Bryan, S. K., Moses, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sufficiency+of+the+Klenow+fragment+for+survival+of+polC%28Ts%29+pcbA1+Escherichia+coli+at+43+degrees%5BTitle%5D)+AND+%22C.+J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees.</a> C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

この記事では、クローニングまたはPCRを必要とせずに大規模なランダム変異体ライブラリーの生成を可能にする突然変異誘発プロトコールを示します。このメソッドは、コードするプラスミド目的の配列のエラーが発生しやすいのレプリケーションに基づいています。理論的には、突然変異の大部分はRNA / DNAスイッチのすぐ下流に位置する100から300 bpに制限しなければならない、リーダー鎖の中間の大きさは、ポル私2,10によって生産。我々は、プラスミドのoriが増加する（図3）からの距離と周波数の減少が、このプロトコルで提示条件の下で、ポル私の変異は、すべてのプラスミド上で発生することがわかった。この知見は、転移やColE1プラスミド複製中にはPol IIIにはPol Iから&quot;スイッチが&quot;少なくとも我々の実験条件2の下に、はるかに緩やかな以前の報告よりであることを意味し、そしてポル私とポルとの間の機能的な冗長性を示唆する以前の研究と一致III 11。 当社独自のプロトコルでは、液体培養（4）に変異を説明。このプロトコルは、RNA / DNAスイッチ（表1）に隣接する1000塩基の中で、すなわち、D &lt;1000 0.41突然変異/ kbを得られます。どんな新鮮な培地を添加せずに3日間振盪機で液体培養を残すことHypersaturationは0.70突然変異/ kbに、非常に貧しいプラスミド収量の結果（1％未満1日目と比較すると、データは示していない）への変異頻度を発生させます（表1）。ここでは、直接37 ° C（図1）における固体寒天上で目的プラスミドの形質転換をめっきに基づいて簡易プロトコルを提示する。この手順では、変異誘発の突然変異/サイクル（0.92突然変異/ D &lt;1000 KB）の最大周波数を生成し、非常に反復を容易にします。固体培地に培養条件を変更すると、突然変異のスペクトル（表2）に影響します。ダイレクトメッキの突然変異誘発は、マークは（C→T対G→AとA→GとT→Cを比較）液体培地で見られる相補的塩基対の置換の間に非対称性が減少。一方、直接めっきはより多くのindelsの（0.5％未満から4％へ）生産され、3倍で→G変異の数を減少し、G / Cの変異（74％）のoverrepresentationにつながる。全体的に、我々はここで紹介するダイレクトプレーティングプロトコルのより簡潔さと効率性の向上が液体変異導入により生成少しよりバランスのとれた突然変異スペクトルのメリットを上回ると信じています。 プラスミドターゲット内に、私たちのメソッドによって生成される変異が所望の標的配列に限定されるものではない。それは定性的ではなく定量的な変化を表しているしかし、小説生化学的活動の進化は、標的遺伝子内の変異に依存する必要があります。従って、勾配プレート上の変異体のスクリーニングとのプラスミド変異を組み合わせることで新たな生化学的性質の進化のための私たちのシステム（大規模なライブラリや選択の可用性）の強みを利用しています。このような既存の酵素活性の最適化や遺伝子の特定の領域をランダム化するようなランダム変異誘発の他のアプリケーションでは、ランダム変異誘発は、次のクローニングを必要としません。この場合、PCRの増幅産物とは対照的に、プラスミドでライブラリを持つことは、増幅し、制限を容易にすることにより、クローニングの効率を向上させます。 要するに、我々は、そのシンプルさのために、生成されたライブラリの多様性のため目立つ所定の標的遺伝子のランダム変異体ライブラリーを作成する単純なプロトコルを示しています。我々は、このメソッドは新しい生化学的活動の効率的な発展のための機能的な選択と結合することができる方法を示します。さらに、私たちは、 生体内で生成されたライブラリ内の既存の活動の部位特異的変異誘発または最適化を可能に、容易にクローニングすることができる。

<table><tbody><tr><td>カルベニシリン</td><td>Cellgro</td><td>46100R6</td><td>最終濃度 0.1mg/ml</td></tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP7640</td><td>最終濃度 0.05mg/ml</td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>Genlantis</td><td>M120100</td><td>最終濃度 0.03mg/ml</td></tr><tr><td>LB Agar Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth Miller</td><td>Difco Laboratories</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>ソフトアガー</td><td>Difco Laboratories</td><td>214580</td><td>院内調製</td></tr><tr><td>アクリジンオレンジ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A38401-1</td><td></td></tr><tr><td>消泡剤Bエマルジョン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Acros Organics</td><td>332030025</td><td></td></tr><tr><td>100x100x15mm 角型シャーレ</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875711A</td><td></td></tr><tr><td>100mm 丸型シャーレ</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712A</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡用スライドガラス 25x75x1mm</td><td>Gold Seal</td><td>3048</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーター 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーター 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2mm ギャップチューブ</td><td>Molecular BioProducts</td><td>5520</td><td></td></tr><tr><td>Zippy ミニプレップキット</td><td>Zymo Research Corp.</td><td>D4020</td><td></td></tr></tbody></table>

内タンパク質の定方向進化のための変異導入と機能選択プロトコル e.大腸菌</em

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

遺伝的多様性の効率的な世代は、ユニークな分子の署名を作成するために、または実験室での蛋白質を進化させ、DNA合成のラベル付けに使用することができる貴重な分子ツールを表します。ここでは、特定の標的配列のための大規模な（&gt; 10 11）変異体ライブラリーの生成を可能にするプロトコルを示す。このメソッドは、DNAポリメラーゼI（LF -ポルI）の低忠実度の変異によってColE1プラスミドエンコーディングの複製所望の配列に基づいています。目的プラスミドは、E.のミューテーター株に変換されます大腸菌と固形培地上にプレーティングは、標的遺伝子の位置に応じて、0.2と1の変異/ KBの間得た。より高い突然変異の頻度は、突然変異誘発のこのプロセスを繰り返すことにより達成されています。変異導入の代替方法と比較して、我々のプロトコルは、クローニングまたはPCRが含まれないとして、そのシンプルさで際立っている。このように、私たちの方法は、変異プラスミドまたは他のポル私のテンプレートのラベルまたは元のターゲットには存在しない活動の発展のためにシーケンス空間の大部分を探索するために理想的です。 PCRやランダムオリゴヌクレオチドベースの手法の提案も、ライブラリの特定のセクションのその後のクローニングによって達成できることをタイトな空間的な制御。ここでは、ランダム変異体ライブラリーを作成する方法とE.の薬剤ベースの選択を確立する方法を示すプロトコルを提供する新しい生化学的な活動を示す変異体を同定するために大腸菌 。

ここでは、特定の標的配列のランダム変異体ライブラリーを作成する単純なプロトコルを示しています。我々は、大腸菌の中で、生体内で行われるこの方法は、、新たな酵素活性を進化させ、機能の選択と結合することができる方法を示します。

内タンパク質の定方向進化のための変異導入と機能選択プロトコル E.大腸菌</em

遺伝的多様性の効率的な生成は、DNA合成の標識や、固有の分子的な...を作成するために利用可能な、極めて有用な分子ツールとなります。

この手順の全体的な目的は、特定の標的DNA配列に対するランダム変異体ライブラリを作成し、半定量的な機能選択を用いて変異体を迅速に同定および特性評価することです。まず、標的配列を含む単一の複製起点を持つpcoliプラスミドをムテータ株に形質転換します。細胞をプレートに播種し、一晩培養した後に回収し、標的プラスミドを単離して変異体ライブラリを得ます。その後、プロトコルの第2パートにおいて、変異の特性を評価するために、この変異体ライブラリをリードアウト株に形質転換します。勾配増殖プレートを作成し、リードアウト株の細菌培養液をソフトアガーを含む別のペトリ皿に導入します。手順の最終ステップは、これらの細菌培養物をグラジエントにスタンプ転写することです。最終的に、薬剤グラジエント上での増殖の差を通じて、特定のターゲット配列の表現型プロファイルの変化を示す結果を得ることができます。このビデオでは、E. coliにおけるタンパク質の方向性進化の手法を紹介します。このプロセスは、ランダムな栄養素ライブラリーの生成と、それに続く多様性を制限する選択という、自然な進化を模倣したものです。これにより、工業的または生物医学的な目的のための新しい生化学的活性を生成する能力が向上します。この手順は、ランダム変異ライブラリーの構築と、機能獲得変異を得るための機能選択の2つの構成要素からなります。この手順の実演は、私の研究室の技術者であるJennifer Allenが行います。本プロトコルの開始前に、DNAポリメラーゼIの低忠実度変異体（low fidelity pol I）を発現する電気穿孔法用コンピテントJS 200細胞を準備します。これらの細胞は、書面によるプロトコルに記載されている通りに事前に調製されており、温度感受性pole 1アレルを含有しているため、37 °Cにおいて低忠実度pol I活性が支配的になります。標的配列が複製起点に隣接してクローニングされたcoli 1複製起点を含む標的プラスミドを構築します。低忠実度pol Iがcoli 1プラスミドの複製を開始することで、変異が導入され、変異誘発が開始されます。2 mmギャップのキュベットに、40 µLの電気穿孔能（エレクトロコンピテント）細胞と30〜250 ngの標的プラズミドDNAを混合します。電撃装置を用いて、混合液に1800 Vでパルスを印加し、エレクトロポレーションを行います。各サンプルの条件下で均一な電気穿孔が行われていることを確認するため、時定数（TC）を確認してください。理想的なTCは5〜6ミリ秒です。細胞とDNAの混合液を1mLのLB培地中で、37°C、250 RPMの振盪条件下で40分間回復させます。37°Cに予熱し、両方のプラスミドを選択するための適切な抗生物質を含む100mmのLV agroペトリ皿を用意します。回復させた細胞を、この例に示すような、個々のコロニーは識別できるが計数不可能な「ニアローン（near lawn）」濃度になる適切な希釈倍率でプレートに塗布します。一晩の培養後、LBブロスを用いてペトリ皿の細菌コロニーを回収します。回収した細胞からプラスミドDNAを単離します。得られたプラスミドDNAがランダム変異ライブラリとなります。ターゲットプラスミドとポールプラスミドの両方を線状化する制限酵素を用いて、プラスミドライブラリーの制限酵素消化を行います。単離したプラスミドDNAについて分析用アガロースゲル電気泳動を行い、品質と量を年確認します。プラスミドが確認されたら、ポールプラスミドは線状化し、ターゲットプラスミドは切断しない制限酵素を用いて、ライブラリー1 µgを消化します。制限酵素消化の完了後、DNA精製キットを用いてライブラリーをクリーンアップします。最後に、精製したライブラリーをリードアウト株に形質転換し、変異を解析します。グラジエント調製を開始するには、正方形ペトリ皿の底面の一方の端に、等間隔に10本のレーンをマークします。シャーレを下側のマークされた端が7 mm高くなるように傾斜させて配置します。適切な濃度の選択剤を十分に混合した温かいLBアガー25 mLを、傾斜させたシャーレに注ぎます。これがグラジエントの下層となります。LBアガーがシャーレ全体を覆い、盛り上がった印のある端の厚さが約1 mm、低い部分の厚さが約8 mmになるようにします。換気のため蓋KUを軽く被せ、アガーを10〜15分間静置して凝固させます。LBアガーの下層が固まったら、シャーレを平らな面に移動させます。次に、選択剤を含まない25 millilitersの温めたlb agarを注ぎ、最初のagri表面を覆い、底層全体が完全にカバーされるようにします。プレートに蓋KUをして通気させ、その後、細菌のスタンプ転写を行うためにagriを10から15分間静置して固めます。まず、リードアウト株の細菌培養液を用意し、600 nanometersにおける光学密度が1.0未満となるよう希釈して、細胞密度を同一にします。次に、42°Cに平衡化した液体ソフトアガロース2 mLを100 mmのラウンドペトリ皿の底に移し、細菌培養液40 µLをソフトアガロースに加え、プレートを揺らして混合します。ガラス製顕微鏡スライドの長い方の端に、このソフトアガロース混合物を塗布します。その後、スライドの塗布した端をグラジエント皿の底にあるマークに合わせて配置します。スライドをアガロースの表面に触れさせます。ソフトアガロースのリボン状の塊をグラジエント表面に転写するには、軽く触れるだけで十分です。その後、スライドは洗浄して再利用するために取り置いておきます。この工程を繰り返します。残りのサンプルおよび実験対照を、各グラジエントディッシュに含めてください。複数のグラジエントを実施する場合は、グラジエントディッシュを逆さまにして37 °Cで一晩インキュベートします。インキュベーションの時間と温度は、使用するリードアウト細菌株によって異なる場合がありますが、通常は37 °Cで一晩インキュベートすれば、目視可能な増殖が得られます。最後に、記述されたプロトコルに従って細胞成長のイメージングおよび解析を行います。ここでは、変異導入されていないP-G-F-U-VまたはPG FPUV変異体ライブラリを形質転換し、4 roundsの変異導入を経て維持されたリードアウト株の画像を示します。コロニーが暗い、あるいは薄い場合は、GFPを不活性化させる変異を含むプラスミドであることを示しています。この図は、ターゲットプラスミドの中立配列全体における変異の頻度を100 base pair間隔で示したものです。変異はプラスミド配列全体にわたって発生していますが、複製起点に最も近い領域で頻度が最も高いことに注意してください。ここでは、変異株の増殖を薬剤勾配に対して示しています。グラジエントの上方向への成長距離は、変異体間における薬剤耐性プロファイルの違いを示しています。この例では、ヒト酸化脱メチル酵素ABH2のプラスミドライブラリを用い、薬剤選択グラジエントを用いてメチルメタンスルホネートに対する耐性が向上した変異体のスクリーニングを行いました。変異導入プロトコルを2回および4回繰り返したライブラリを、親株である野生型および空ベクターと比較して示しています。白線は、個々の変異コロニーを分離した閾値を示しています。さらなる表現型解析のために、低忠実度P1変異導入およびastri-m選択を用いて previously 同定されたβ-ラクタマーゼ変異株 R 1 64 H および E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R を、0.4 µg/mL および 4 µg/mL のセフォタキシム濃度勾配上で示しています。セフォタキシムに対する保護能は、基質特異性拡大β-ラクタマーゼ（ESBL）活性を示しています。野生型のβ-ラクタマーゼ酵素は、空ベクターを発現している細胞と比較して保護能を付与しないことに注意してください。したがって、これらの変異体は適応、あるいは新しい生化学的活性の進化を表しています。ここでは、このような新しい生化学的活性を生成するための、変異導入と機能的選択の強力な組み合わせを提示しました。機能的な選択は、薬剤選択または遺伝的相補性のいずれかを通じて得ることができ、これにより大規模な遺伝的多様性を生成する能力を活用することが可能です。既存のタンパク質活性を最適化する場合や、部位特異的な変異導入を行う場合には、病原性を特定の配列に限定する必要があるかもしれません。これらはクローニングによって容易に実施できます。さらに、シグネチャーアタックや変異フットプリントを得るために、変異導入を機能的な選択から切り離して行うことができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

体系的、大規模合成遺伝子（遺伝子遺伝子またはエピスタシス）対話画面が遺伝的冗長性と経路のクロストークを探索するために使用することができます。ここで、我々は上位性の関係を解明するとの遺伝的相互作用ネットワークを探索するために開発されeSGAと呼ばれるハイスループット定量合成遺伝子配列のスクリーニング技術を記述...

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

耐熱性工学の分野に特有の新奇向進化法は溶菌酵素のために開発され、結果的に検証されました。高温のインキュベーションの後、野生型タンパク質と比較した場合、ランダム突然変異誘発の唯一の1ラウンドの後、進化した溶菌酵素、PlyC...

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大腸菌Site-Specifically アセチル化蛋白質を生成する安易なプロトコル

この資料では、分裂酵母のターゲット遺伝子のランダム突然変異誘発のための詳細な方法論について説明します。たとえば、ターゲットrpt4 +、19 s...

分裂酵母におけるプロテアソーム変異体のヘテロクロマチン不安定を選択するランダムな変異を遺伝子をターゲットとしました。

サイト指示された突然変異誘発は、デオキシリボ核酸 (DNA) の特定の突然変異を導入する技術です。このプロトコルは、2 ステップでサイト指示された突然変異誘発を行う方法をについて説明し、3 ステップのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) ベースのアプローチは、興味の DNA...

サイト指示された突然変異誘発のため生体外でそしてエシェリヒア属大腸菌の RNA 相互作用に代表される生体実験

新しい配列特異性を有する制限エンドヌクレアーゼは、部分的に縮退配列を認識する酵素から開発することができる。ここでは、NlaIV酵素の配列特異性を変更するために使用した詳細なプロトコルを提供します。プロトコルの主な成分は、転写/翻訳反応のインビトロ区画化と新しい配列特異性を有するバリアントの選択である。...

より厳格な特異性を有する制限エンドヌクレアーゼのインビトロ指向進化

全体プラスミドの部位特異的突然変異誘発は、元のプラスミドのわずかに異なるバリエーションを作成する簡単な方法です。ここでは、プラスミドを使用して、標準試薬に塩基置換を導入しやすいと費用対効果の高い方法を示しています。...

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学ぶランダム変異ライブラリー作成と機能選択を用いたタンパク質の定方向進化プロトコル。大腸菌のミューテーター株を利用し、新規酵素活性の獲得変異を効率的に同定する方法です。

内タンパク質の定方向進化のための変異導入と機能選択プロトコル E.大腸菌

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