内タンパク質の定方向進化のための変異導入と機能選択プロトコル E.大腸菌

この手順の全体的な目標は、特定の標的DNA配列に対するランダムな変異体ライブラリを作成し、半定量的な機能選択を使用して変異体を迅速に同定し、特性評価することです。これは、まず、標的配列を含む複製の1つの起点である大腸菌でプラスミドを変異体株に形質転換することによって達成されます。細胞を一晩プレーティングしてインキュベートした後、それらを収穫し、標的プラスミドを単離して変異体ライブラリーを取得し、次いで、変異体ライブラリーを読み出し株に変換して、プロトコルの第2部分の突然変異を特徴付け、勾配成長プレートを構築し、読み出し株の細菌培養物を柔らかいエアを含む別のペトリ皿にロードする。

手順の最後のステップは、これらの細菌培養物をグラジエントにスタンプ転写することです。最終的には、薬物勾配上の成長の違いを通じて、所与の標的配列の表現型プロファイルの変化を示す結果を得ることができます。このビデオでは、大腸菌のタンパク質の指向性進化の方法を紹介しています。

このプロセスは、ランダムな栄養素ライブラリの生成における自然な進化を模倣し、その後、その多様性を制限する選択が続きます。したがって、産業または生物医学の目的で新しい生化学的活性を生成する能力が向上します。この手順には、ランダムな変異体ライブラリの生成と、この機能獲得突然変異を取得するための機能選択の2つの要素があり、この手順は私の研究室の技術者であるJennifer Allenです。

このプロトコルの開始に先立って、DNAポリメラーゼ1または低忠実度の極の低忠実度の変異体を発現するエレクトロコンピテントJS200細胞は、書かれたプロトコルに記載されているように以前に調製されていたものと考え、これらの細胞は、低忠実度の極1の活性が摂氏37度を優勢とするような極1の温度感受性対立遺伝子を含んでおり、 建てる。大腸菌を含有する標的プラスミドであって、複製起点に隣接してクローニングされた標的配列を有する複製起点1つ、大腸菌を開始する低忠実度の極1つ、大腸菌の複製を開始する1つのプラスミド。したがって、突然変異誘発を開始するための突然変異を導入します。

40マイクロリットルのエレクトロコンピテントセルと30〜250ナノグラムの標的血漿DNAを2ミリメートルのギャップで組み合わせます。エレクトロポレーション獣医パルス、1800ボルトのエレクトロ中の混合物。時定数またはTCをチェックして、各サンプルのイオン条件が均一であることを確認してください。

理想的には、TC は 5 ミリ秒から 6 ミリ秒に等しくなります。細胞DNA混合物を1ミリリットルのLBブロスで37〜250RPMで振とうしながら40分間回復させます。適切な抗生物質を含む摂氏37度に予温した100ミリメートルLVアグロペトリ皿を入手し、両方のプラスミドについて回復した細胞を適切な希釈でプレートし、この例に示すように、コロニーの明確だが数えられない数として定義される芝生に近い濃度を得る。

一晩のインキュベーション後、LBブロスでペトリ皿の細菌コロニーを収穫します。プラスミドを単離し、採取した細胞からDNA、得られたプラスミドを単離する。DNAはランダムな変異体ライブラリを構成します。

プラスミドライブラリーを切断し、標的プラスミドと極の両方を直鎖化することにより、制限酵素化を行います。1つのプラスミドは、単離されたプラスミドDNAに分析用aroゲルを泳動させ、品質と量を確認します。プラスミドが検証されたら、ポールワンプラスミドを直鎖化する制限酵素でライブラリの1マイクログラムを消化しますが、ターゲットプラスミドは切断しません。

制限酵素消化が完了したら、DNA精製キットを使用してライブラリーをクリーンアップします。最後に、クリーンライブラリをリードアウト株に変換して、突然変異を特徴付けます。グラデーションの準備を開始するには、正方形のシャーレの底の一方の端に等間隔で10レーンをマークします。

下部のマークされた端が7ミリメートル高くなるように、皿を傾斜の上に置きます。25ミリリットルの温かいlb寒天を、適切な濃度の選択剤とよく混合して傾斜皿に注ぎます。これはグラデーションの最下層です。

LB寒天がペトリ皿をコーティングし、皿の高いマークされた端に約1ミリメートルのLB寒天が含まれ、下がった部分に約8ミリメートルが含まれるようにしてください。換気のためにプレートを蓋KUで覆い、アグリを10〜15分間固めます。LB寒天の最下層が固まったら、皿を平らな面に移します。

次に、選択剤を使用せずに25ミリリットルの温かいlb寒天を注ぎ、最初の農業表面を覆い、最下層全体を覆うことを確認します。換気のためにプレートを蓋KUで覆い、その後、アグリを10〜15分間セットして、バクテリアのスタンプ転写を行います。まず、読み出した菌株の細菌培養物を入手し、それらを希釈して、光学密度が600ナノメートルで1.0未満で同一の細胞密度を持つようにします。

次に、100ミリメートルの丸いペトリ皿の底に摂氏42度に平衡化した液体軟質寒天の2ミリリットルを移し、細菌培養物の40マイクロリットルを柔らかいものにピペットで移し、次いでプレートを揺さぶって混合する。ガラス顕微鏡スライドの長辺に柔らかい混合物をコーティングします。次に、スライドのコーティングされたエッジをグラデーション皿の下部マークに合わせます。

滑り台を寒天の表面に接触させます。柔らかい寒天のリボンをグラデーション面に移すには、柔らかな手触りで十分です。その後、スライドはクリーニングと再利用のために取っておきます。

このプロセスを繰り返します。残りのサンプル、実験コントロールは、各グラジエント皿に含める必要があります。複数のグラジエントを実行する場合は、グラジエントディッシュをトップダウンして摂氏37度の時間で一晩インキュベートし、インキュベーションの温度は読み出した細菌株ごとに異なる場合がありますが、通常は摂氏37度で一晩で目に見える成長に十分です。

最後に、書かれたプロトコルに記載されているように、細胞増殖を画像化し、分析します。表示。これは、ミュートされていない P-G-F-U-V または PG FPUV 変異体ライブラリのいずれかで変換された読み出し株の画像です。突然変異誘発の暗いまたは暗いコロニーの4ラウンドは、GFP不活性化変異を含むプラスミドを示しています。

この図は、100塩基対間隔での標的プラスミドの中性配列全体の突然変異の頻度を表しています。突然変異はプラスミド配列全体にわたって発生しますが、複製の起点に最も近い最高周波数で発生することに注意してください。ここでは、変異体の成長が薬物勾配に対して示されています。

勾配の頂上に向かって成長した距離は、変異体間で異なる薬剤耐性プロファイルを示しています。この例では、ヒト酸化的デメチラーゼABH 2のプラスミドライブラリーを、薬物選択勾配を用いてメチルメタンスルホン酸に対する耐性が増加した変異体についてスクリーニングした。2。突然変異誘発プロトコルの2回および4回の反復を表すこのようなライブラリは、親の野生型および空のベクターと比較して示されています。

白い線は、個々の変異コロニーが分離された閾値を示しています。さらなる表現型解析のために、β-ラクタマーゼ変異体、R1 64HおよびE 1 0 4KR1 64HG2 67Rは、低忠実度のP one突然変異誘発およびastriおよびm選択を用いて以前に同定され、0.4マイクログラム/ミリリットルおよび4マイクログラム/ミリリットルで示される。セフォタキシムに対するセフォタキシム勾配保護は、拡張スペクトルベータラクタマーゼ活性を示しています。.

野生型β-ラクタマーゼ酵素は、空のベクターを発現する細胞と比較して保護を付与しないことに注意してください。したがって、これらの変異体は、新しい生化学的活性の適応または進化を表しています。ここでは、この世代の新しい生化学的活性のための突然変異誘発と機能選択の強力な組み合わせを示しました。

機能的選択は、薬物選択または遺伝的補完のいずれかによって取得でき、大きな遺伝的多様性を生み出す能力を利用します。病因は、既存のタンパク質活性を最適化するため、または部位特異的な病因のために、特定の配列に制限しなければならない場合があります。これらはクローニングによって簡単に行うことができます。

さらに、突然変異誘発は、シグネチャー攻撃または突然変異フットプリントを得るために、機能選択から切り離すことができます。