Name: 指向進化方法でサッカロマイセス・セレビシエ：変異体ライブラリーの作成およびスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 学ぶ、Saccharomyces cerevisiaeを用いた指向進化のための変異体ライブラリー構築とスクリーニング手法。計算アルゴリズムで標的領域を選び、単一の形質転換ステップで効率的に高品質な変異体を同定する方法です。

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この作業は、欧州委員会のプロジェクトであるIndox-FP7-KBBE-2013-7-613549、コストアクションCM1303-Systems生体触媒、および国家プロジェクトDewry [BIO201343407-R]とCambios [RTC-2014-1777-3]によって支援されました。

1.変異体ライブラリーの構築<ol><li>選択領域は、利用できる結晶構造または相同性モデル18に基づいて計算アルゴリズムの助けを借りて、モーフィングに供されます。 <ol><li>ここでは、ランダム突然変異誘発および組み換え（メット[α1] -Val109、Phe392-Gln566）、高忠実度PCRによる遺伝子（844塩基対）の残りの部分を増幅しながら（ 図1）のためのエリンギからAAOの2つの領域をターゲットにしています。 注：いくつかのセグメントは独立に、または組み合わせた方法16にモーフィングによって研究することができます。 </li></ol></li><li>突然変異誘発PCRによって標的領域を増幅します。定義された領域のPCR反応を重畳することにより、セグメント間の領域（約50塩基対ずつ）のオーバーラップを作成します。 <ol><li> DNAテンプレート（0.92 ngの/μl）を含む50μlの最終容量中の標的セグメントの変異原性PCRを準備し、90 nMのオリゴセンス（セグメントM-IIのためのセグメントMIとAAO-BP用RMLN）、90 nMのAntisenseプライマー（セグメントM-IIのためのセグメントMIとRMLCためのAAO-92C）、0.3mMのdNTP類（0.075 mMの各）、3％（v / v）ジメチルスルホキシド（DMSO）、1.5のMgCl 2、0.05ミリモルのMnCl 2および0.05 U /μlのTaq DNA ポリメラーゼ 。プライマー配列は、図1に詳述されています。 </li><li>以下のPCRプログラムを使用してください：2分（1サイクル）、95℃を。 45秒、45秒、50℃、45秒間74℃（28サイクル）95℃、そして10分（1サイクル）74°C。 </li></ol></li><li>超高忠実度ポリメラーゼで非変異領域を増幅し、変異原性セグメントおよび/または線状化ベクターのオーバーハングを重ね、対応する領域を含みます。 <ol><li>含む50μlの最終容量で反応混合物を準備します。DNA鋳型（0.2 ngの/μl）を、250 nMのオリゴセンスHFF、250 nMのオリゴアンチセンスHFR、0.8mMのdNTP類（0.2 mMの各）を、3％（v / v）ジメチルスルホキシド（DMSO）およびDNAポリメラーゼではiProof 0.02 U /μlの。プライマー配列は、中に詳述されています&lt;強い&gt;図1。 </li><li>以下のPCRプログラムを使用してください：30秒（1サイクル）98℃を。 10秒間、98℃、55℃45秒（28サイクル）のための25秒、72℃;そして10分（1サイクル）72℃。 注：43 bpの（プラスミド-M1領域）の1.2と1.3の重なりに記載された条件では、 46塩基対（M1地域-HF領域）。 47塩基対（HF地域-M2領域）および61塩基対（M2 region-プラスミド）は酵母においてインビボスプライシングに有利になるように（ 図1）に設計されています。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、商業用ゲル抽出キットを用いて、すべてのPCR断片（変異原性および非変異）を精製します。 </li></ol></li><li>約50塩基対のフランキング領域は、標的遺伝子の5 &#39;末端および3&#39;末端に相同であるが作成されるように、ベクターを線状化。 <ol><li> 2μgのDNA、7.5 U のBam HI、7.5 U のXhoI、バッファBaの 20μgのBSAおよび2μLを含む線形化反応混合物を準備します20μlの最終容量中メートルHI 10倍。 </li><li> 2時間40分間37℃で反応混合物をインキュベートします。その後、80℃で20分間不活性化を進めます。 </li></ol></li><li>残留環状プラスミド（ 図2）の混入を避けるために、アガロースゲル抽出により線状化ベクターを精製します。 <ol><li>同様に隣接するだけでなく、レポーターで反応混合物のアリコート（5μl）を：セミ分取低融点アガロースゲル（V 0.75％、ワット）のメガウェルに消化反応ミックスをロードします。 </li><li>ランDNA電気泳動（電極間の5 V / cmで、4ᵒC）とは、メガウェルに対応したアガロースゲルを分離し、1×TAE中4ᵒCでそれを保存します。 </li><li>分子量ラダーと記者とのレーンを染色。 UV光の下でバンドを可視化。ニック線状化ベクターの場所の位置。 注：精製線形化ベクターの品質がcritiであるよう酵母で成功組換えおよびアセンブリのための校正係数、セミ分取のDNA電気泳動用ゲル染色を避けます。ゲル抽出用染料およびUV照射の使用は、 インビボ組換えの効率を損なう、DNAベクターの安定性に影響を及ぼし得ます。毒性EtBrを染料の代わりに、ゲルレッドおよびSYBR染料は、一般に、ゲル染色のために使用されます。 </li><li>それを単離することができるように、UV光の不存在下で、染色されたレポーターレーンにニックのガイダンスを使用して、メガウェル断片で線状化ベクターを識別する。 </li><li>アガロースから線状化ベクターを抽出し、製造業者のプロトコルに従って、商業用ゲル抽出キットを用いて、それを精製します。 注：抗生物質や栄養要求性マーカーと使用高コピーエピソームシャトルベクター：この例では、酵母GAL1プロモーターの制御下で、ウラシル独立し、アンピシリン耐性pJRoC30ベクトルを採用。 </li></ol></li><li>等モルマイルを準備PCR断片の固定装置および2で線状化ベクターと混ぜる：線状化プラスミドの無未満100 ngので、1の比（等モルのライブラリ/オープンベクトルのテスト異なる比率は、良好な変換収率を達成するために）。 <ol><li>それらの濃度および純度を決定するために、260 nmおよび280 nmでのPCRフラグメントの吸光度および線状化ベクターを測定します。 </li></ol></li><li>商業酵母形質転換キットを用いてDNA混合物で酵母コンピテント細胞を形質転換製造業者の指示に従って（供給するための表を参照のこと ）。 <ol><li>ここでは、欠損およびURA3プロテアーゼを使用-依存S.セレビシエ株、BJ5465。 （下記参照）スクリーニング時に内部標準として親の環状ベクターで細胞を形質転換します。また、PCR断片の不存在下で線状化ベクターを形質転換することにより、背景をチェックしてください。 注：最初の低分泌レベルを検出する場合には、Sを使用しBJ5465のようなセレビシエプロテアーゼ欠損株は、培養上清中の活性タンパク質の蓄積を促進します。標的酵素は、高グリコシルを受ける場合は、グリコシル化欠損株（小さ ​​いマンノースオリゴマーを装着することができるだけである例えば、ΔのKRE2）の使用が適切なオプションである可能性があります。 </li></ol></li><li>プレートは、SCドロップアウトプレート上の細胞を形質転換し、3日間30℃でそれらをインキュベートします。プレート（ウラシルを補充したSCドロップアウトプレート上）URA3 - S.スクリーニングのための陰性対照として、プラスミドを欠くセレビシエ細胞（下記参照）。 </li></ol>スクリーニングアッセイ2.ハイスループット（図3） <ol><li>ピペットロボットの助けを借りて、ウェルあたり50μlの最少培地で（2,000クローンのライブラリーを分析するために23プレート）を滅菌96ウェルプレートの適切な数を埋めます。 </li><li>プレートアウトSC-dropから個々のコロニーを選択し、96ウェルプレートに転送。 <ol><li> S. -各プレートには、URA3でH1内部標準と同様に親のタイプと列番号6に接種陰性対照としてプラスミドなしでセレビシエ細胞（SC培地にウラシルを補いました）。 注意：まあH1はウラシルを補充し、ドロップアウトメディアと特異的に充填されています。ウェル細胞を含まない培地を含むブランクもまた、追加の無菌対照として調製することができます。 </li></ol></li><li>彼らのふたでプレートをカバーし、パラフィルムでラップ。 30°C、湿度の高いシェーカーで225rpmで、80％の相対湿度で48時間プレートをインキュベートします。 </li><li>パラフィルムを外し、分注ロボットの助けを借りて、各ウェルに発現培地160μlを添加、プレートを再密封し、さらに24時間のためにそれらをインキュベートします。 注：他の場所で19報告されているように最小培地および発現培地を調製します。分泌レベルは、T、およびそれに応じて研究中の遺伝子に応じて変えることができます彼インキュベーション時間は、すべてのウェルにおける細胞増殖を同期させるために、それぞれの場合に最適化されなければなりません。 </li><li> 4℃で10分間、2,800×gで遠心分離プレート（マスタープレート）。 </li><li>転送ロボットマルチステーションを処理液を用いてレプリカプレートにマスタープレート中のウェルから20μlの上清。 一般的に酵母中での異種発現のために使用されるシグナルペプチドによって標的タンパク質の天然のシグナルペプチドを交換することをお勧めし酵素の分泌を有利にする（ 例えば、α因子プレプロリーダー、SからK 1キラートキシンの指導者注： セレビシエ 、または両方のペプチド13）のさえキメラバージョン。代替的に、天然のシグナルペプチドは、排他的に、酵母での分泌のために進化することができます。 </li><li>ピペッティングロボットの助けを借りて、100 mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0中の2mM のp -methoxybenzylalcohol20μlのを追加します。 96私たちと簡単にプレートをかき混ぜますLLプレートミキサー、室温で30分間、それらをインキュベートします。 </li><li> 2（SO 4）2、100μMキシレノールオレンジ、250μMのFe（NH 4）：ウェル中のFOX混合物の最終濃度（分注ロボットでは、それぞれのレプリカプレートにFOX試薬の160μlを添加し、ミキサーで簡単にかき混ぜますおよび25mM H 2 SO 4）。 <ol><li>このような有機共溶媒（DMSO、エタノール、メタノール）またはソルビトール17としての感度を向上させる試薬には、いくつかの添加剤を加えます。ここでは、100 mMの（ 図4）の最終濃度になるようにソルビトールを添加することにより反応を増幅します。 </li></ol></li><li>プレートリーダーで560 nmでプレート（エンドポイントモード、T 0）を読みます。 </li><li>色が発症するまで室温でプレートをインキュベートし、再び（トン1）吸収を測定します。 <ol><li>インキュベーション後のABS値との差から相対活性を計算し、最初の測定のそれはパレに正規化各プレートについてNTALタイプ（Δtの1 -トン0）。 </li></ol></li><li>偽陽性を排除するために、2つの連続した​​再上映に最高の変異ヒットを施します。 注：典型的には、再上映プラスミド19を新鮮な酵母細胞の形質転換に続いて、大腸菌における酵母、増幅および精製からのプラスミドの単離を含みます。選択された各クローンはpentaplicateで再スクリーニングされます。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

この記事では、我々はSに指向進化により酵素を設計するために我々の研究室で使用されるヒントやトリックのほとんどをまとめていますセレビシエ （例としてAAOを使用して）、彼らは単にここに記載の一般的な方法に従って、多くの他の真核生物の酵素系との使用に適合させることができるようになっています。 ライブラリの作成 ​​の面では、モーフィングが変化していないタンパク質16の残りの領域を残しながら、小さなタンパク質のストレッチにランダム突然変異を導入し、再結合するための高速ワンポット法です。いくつかの突然変異負荷を有するライブラリーは容易に完全な自律的に複製するベクターを生成するために、線状化プラスミドと一緒に、調製され、 生体内で再結合することができます。重複配列は、余分なPCR反応を回避し、完全な遺伝子の断片は、 インビボ組換えを介して再組み立てすることを可能にするために、各ストレッチに隣接し、in vitroライゲーションステップにすることが重要です。このP ...

監督分子進化は、酵素1、2を設計するため、堅牢な高速かつ信頼性の高い方法である。ランダム変異、組換えおよびスクリーニングの反復ラウンドを通じて、酵素の改良されたバージョンは、非天然で、小説の反応で、新しい基板に作用を生成することができます環境は、さらに新たな代謝目標3-5を達成するために、細胞を支援します。指向性進化に使用されたホストのうち、ビール酵母サッカロマイセス・セレビシエは、原核生物のカウンターパート6,7でそうでなければ利用できない複雑な真核生物タンパク質の機能発現のためのソリューションのレパートリーを提供しています。 細胞生物学研究で徹底的用い、この小さな真核生物のモデルは、指向進化8によって酵素を設計するための重要な特徴であるその全ての翻訳後修飾、操作および形質転換効率の容易さの点で多くの利点を有します。また、高周波S.における相同DNA組換えのその効率的なプルーフリーディング装置に結合されたセレビシエは、複雑な人工的な経路9-12への単一の酵素とは ​​異なるシステムの進化を促進する、 生体内でのライブラリの作成 ​​および遺伝子アセンブリのための可能性の広い配列を開きます。私たちの研究室では、酵母における異なるリグニナーゼの分子進化（天然木の崩壊の際にリグニンの分解に関与する酸化還元酵素）13-14のためのツールと戦略を設計する過去十年間を費やしてきました。この通信では、我々は準備するための詳細なプロトコルとS.の画面変異体ライブラリーを提示します、簡単に他の多くの酵素に変換することができます-モデルflavooxidase、 -アリール-アルコールオキシダーゼ（AAO 15）のためセレビシエ 。酵母細胞装置16、によって支援：（相同in vivo でグループ化することによって、変異原性組織再結合過程モーフィング）プロトコルは、集束指向進化の方法を含みます培養液17中に分泌AAO活性を検出するために、フェントン反応に基づいて、ダ非常に敏感なスクリーニングアッセイ。

<table><tbody><tr><td><ストロング>1.培地</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>CAS N&ordm; 69-52-3 M.W. 371.39</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>CAS N&ordm; 56-75-7 M.W. 323.13</td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td>CAS N&ordm; 59-23-4 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>CAS N&ordm; 50-99-7 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400</td><td>CAS N&ordm; 17629-30-0 M.W. 594.51</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Difco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム 一塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>CAS N&ordm; 7778-77-0 M.W. 136.09</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>U1128</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキスディ</td><td>フコ</td><td>212750</td><td></td></tr>アミノ酸<tr><td>なし酵母窒素塩基Difco</td><td></td><td>291940</td><td></td></tr>ウ<tr><td>ラシルなし酵母合成ドロップアウトミディアムサプリメント</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>2.PCR Reactions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Agilent genomics</td><td>200415-51</td><td>25 mM each</td></tr><tr><td>iProof High-Fidelity DNA polymerase</td><td>Bio-rad</td><td>172-5301</td><td></td></tr><tr><td>塩化マンガン(II) 四水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td>CAS N&ordm; 13446-34-9 M.W. 197.91</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4545</td><td>エラーの場合傾向のあるPCR</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>3.プラスミドの線形化</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI制限酵素</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>ニューイングランドバイオラボス</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI制限酵素</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>私ではない制限酵素</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>ゲルレッド</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>DNA</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>4.FOX assays</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸塩アンモニウム(II) 六水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3754</td><td>CAS N&ordm; 7783-85-9 M.W. 392.14</td></tr><tr><td>Anysil Alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W209902</td><td>CAS N&ordm; 105-13-5 M.W. 138.16</td></tr><tr><td>D-ソルビトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td>CAS N&ordm; 50-70-4 M.W. 182.17</td></tr><tr><td>過酸化水素 30%</td><td>メルクミリポア</td><td>1072090250</td><td>FOX 標準曲線</td></tr><tr><td>キシレノール オレンジ 二ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52097</td><td>CAS N&ordm; 1611-35-4 M.W. 716.62</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>5.アガロース ゲル stuff</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Norgen</td><td>28035</td><td>CAS N&ordm; 9012-36-6</td></tr><tr><td>ゲル レッド</td><td>ビオチウム</td><td>41003</td><td>DNA 分析色素</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb ラダー</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA M.W. 標準</td></tr><tr><td>ローディング色素 6x</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>バイオ・ラッド</td><td>161-3112</td><td>CAS N&ordm; 39346-81-1</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>strongカタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>6.Kits and cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae strain BJ5465</td><td>LGC Promochem</td><td>ATTC 208289</td><td>Protease deficient strain with genotype: MAT&alpha; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL</td></tr><tr><td>E. coli XL2-Blue competent cells</td><td>Agilent genomics</td><td>200150</td><td>For plasmid purification and amplification</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,609,250</td><td>DNAゲル抽出</td></tr><tr><td>NucleoSpin プラスミドキット</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,588,250</td><td>カラムミニプレップキット</td></tr><tr><td>酵母形質転換キット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>YEAST1-1KT</td><td>含まれるDNAキャリア(サケ精巣)</td></tr><tr><td>Zymoprep 酵母プラスミドミニプレップI</td><td>Zymo研究</td><td>D2001</td><td>酵母からのプラスミド抽出</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>strong><Comments</td></tr><tr><td>7.プレート</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>透明、非滅菌、ポリスチレン(活性測定用)</td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655161</td><td>透明、滅菌、ポリスチレン(マイクロ発酵用)</td></tr><tr><td>96ウェルプレート蓋</td><td>Greiner Bio-One</td><td>656171</td><td>透明、滅菌、ポリスチレン(マイクロ発酵用)</td></tr></tbody></table>

指向進化方法で<em&gt;サッカロマイセス・セレビシエ</em&gt;：変異体ライブラリーの作成およびスクリーニング

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

生物工学的適用のための酵素を設計する際、サッカロマイセス・セレビシエにおける指向進化は、 生体内での高頻度の相同DNA組換えに結合された、突然変異体ライブラリーの構築、クローニングおよび発現を含むプロセスを多くの魅力的な利点を提供しています。ここでは、その総活性を高めるために、真菌のアリールアルコールオキシダーゼ（AAO）の例に基づいて酵母に変異ライブラリを作成し、画面ためのプロトコルを提示します。 2つのタンパク質セグメントは、ランダム突然変異誘発によっておよびin vivo DNA組換えに焦点を当てた、指向性進化に供しました。各セグメントに隣接〜50塩基対のオーバーハングは、完全な自己複製プラスミドを生じさせる線状化ベクターでAAO-融合遺伝子の正しい再組み立てを可能にしました。機能性AAO変種で強化された変異体のライブラリーは、Sでスクリーニングしましたフェントン反応に基づいて敏感なハイスループットアッセイとセレビシエ上清。の一般的なプロセスS.でライブラリー構築セレビシエは、余分なPCR反応を、 インビトロでの DNA組換え及びライゲーション手順を回避する、ここに記載さ容易に多くの他の真核生物の遺伝子を進化させるために適用することができます。

PからAAO エリンギは、リグニンを攻撃開始するために、H 2 O 2との真菌のペルオキシダーゼを供給する外flavooxidaseです。 AAOの2つのセグメントがその活性およびSにおけるその発現を高めるためにモーフィングにより集束指向性進化に供しましたセレビシエ 19。 S.によって抱い外国酵素のにかかわらずセレビシエ 、酵母に変異ライブラリーを構築する最も重要な問題は、断片と線状化ベクターへのそれらのクローニングの間のスプライシングを優先するように、特定の重複領域のエンジニアリングに関するものです。現在の例では、各PCR反応のために、すべてのフラグメントは、酵母in vivoでのスプライシングを促進するために、約50塩基対のオーバーハングを有していました。セグメント数が組み立てられ、線状化ベクターにクローン化する上での組換え事象の数が依存している（ ...

私たちは、Saccharomyces cerevisiaeの指向性進化キャンペーンのための突然変異体ライブラリを構築し、スクリーニングするための詳細なプロトコルを提示します。

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

このプロトコルの全体的な目的は、定方向進化実験のために、Saccharomyces Cerevisiaeにおける変異ライブラリの構築およびスクリーニング方法を示すことです。この手法は、アセンブリおよびクローニングにおける重複領域の割り当て方法など、集中的な定方向進化実験に用いるラボでの作製に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、その簡便さと堅牢性にあり、わずか1回の形質転換ステップで高品質なレベルのライブラリを構築できる点にあります。変異体ライブラリーの作製およびスクリーニングのための本プロトコルでは、真菌由来のアリールアルコール酸化酵素（AAO）を用いて実演します。フォーカスした指向性進化の対象領域は、まず、利用可能な酵素の結晶構造またはホモロジーモデルに基づく計算アルゴリズムを用いて選択します。AAOのM1領域とM2領域の2つの領域を、ランダム変異導入および組換えの標的とします。標的領域を増幅するために、変異導入PCRを行います。酵母におけるin vivoスプライシングを促進するため、定義された領域のPCR反応を重ね合わせることで、各セグメント間に約50 base pairsのオーバーラップ領域を作成します。DNAテンプレート 46 nanograms、センスおよびアンチセンスプライマー 各90 nanomolar、DNTPs 0.3 milimolar、DMSO 3%、塩化マグネシウム 1.5 milimolar、塩化マンガン 0.5 milimolar、およびTaq DNAポリメラーゼ 0.5 units per microliterを含む、50 microliterの変異導入PCR反応液を調製します。以下のPCRプログラムを使用します。95 °Cで2分間、95 °Cで45秒間、50 °Cで45秒間、74 °Cで45秒間を28サイクル繰り返し、最後に74 °Cで10分間加熱します。AAO遺伝子の残りの部分であるHF領域は、変異導入セグメントと重複する対応領域、および/または直線化ベクターのオーバーハングを含むハイフィデリティPCRによって増幅します。DNAテンプレート10 ng、センスおよびアンチセンスプライマーをそれぞれ250 nM、dNTPs 0.8 mM、DMSO 3%、およびiProof ultra high-fidelity DNA polymerase 0.2 units/µLを含む、最終容量50 µLで高忠実度PCR反応液を調製します。以下のPCRプログラムを使用してください：98 °Cで30秒間、次いで（98 °Cで10秒間、55 °Cで25秒間、72 °Cで45秒間）を28サイクル繰り返し、最後に72 °Cで10分間保持します。その後、すべてのPCR断片を、メーカーのプロトコルに従い、市販のゲル抽出キットを用いて精製します。次のステップは、標的遺伝子の5'末端および3'末端と相同な約50塩基対の隣接領域を作成するために、ベクターを直線化することです。2 µgのDNA、7.5 unitsのBamH-one、7.5 unitsのXHO-one、20 µgのBSA、および2 µLの10x BamH-oneバッファーを含む、20 µLの直線化反応混合液を調製します。反応混合物を37 °Cで2時間40分間インキュベートします。その後、80 °Cで20分間加熱して反応を停止させます。残存する環状プラスミドによるコンタミネーションを避けて線状化ベクターを精製するため、消化反応液をセミプレパラティブ低融点アガロースゲルのメガウェルにロードします。レポーターとして、隣接するウェルに反応ミックスを5 µLロードします。電極間を5 V/cm、4 °CでDNA電気泳動を行います。その後、メガウェルに対応するアガロースゲルを切り出し、1X TAE中で4 °Cで保存します。分子量マーカーとレポーターを含むレーンを染色します。UVライト下でバンドを可視化し、直線化ベクターが位置する箇所に切り込みを入れます。UVライトを消灯し、染色したレポーターレーンの切り込みをガイドにして、メガウェルフラグメント中の直線化ベクターを特定し、切り出します。アガロースから線状化したベクターを抽出し、市販のゲル抽出キットを用いて製造者のプロトコルに従って精製します。続いて、精製した線状化ベクターをPCR断片と混合し、このDNA混合液を用いて、市販のキットを用いて製造者の指示に従いコンピテント酵母細胞に形質導入します。形質導入した細胞をSCドロップアウトプレートに播種し、30 °Cで3日間インキュベートします。本アッセイの準備として、SCドロップアウトプレートから個別のコロニーをピックアップし、1ウェルあたり50 µLの最小培地を含む96ウェルプレートに転移させます。各プレートの6列目には、内部標準として親株を接種します。陰性対照として、ウラシルを添加したSC培地を満たしたH-1ウェルに、プラスミドを含まないURA3陰性のESI内臓細胞を接種します。プレートに蓋をし、パラフィルムで密閉して、加湿シェーカーを用いて30 °Cで48時間インキュベートします。48時間後、各ウェルに160 µLの発現培地を加え、プレートを再度密閉します。さらに24時間インキュベートします。プレートを遠心分離した後、液体ハンドリングロボットマルチステーションを用いて、各プレートのウェルから20 µLの上清をレプリカプレートに分取します。各ウェルに2 mMのp-メトキシベンジルアルコールと100 mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）を20 µLずつ添加します。96ウェルプレートミキサーでプレートを短時間撹拌し、室温で30分間インキュベートします。次に、各レプリカプレートに160 µLのFOX試薬を加え、ミキサーで短時間撹拌します。プレートリーダーを用いて、560 nmでプレートを読み取ります。色が発色するまで、プレートを室温でインキュベートしてください。再度吸光度を測定します。相対活性は、各プレートについて、インキュベーション後の吸光度と初期測定値との差を算出し、親株で規格化することによって求めます。この代表的なゲル画像は、2番目のレーンに線状化したベクターを、3番目のレーンにM1 PCRセグメントを、4番目のレーンにM2 PCRセグメントを、5番目のレーンにHF PCRセグメントを、そして6番目のレーンにNHE1で線状化したin vivo再構成ベクターを示しています。次のゲルでは、2番目のレーンに再構築したベクターのプラスミドミニプレップを、3番目のレーンにNhe Iで直線化したプラスミドを、4番目のレーンにBamH IおよびXho Iで直線化したプラスミドを、そして5番目のレーンにゲル抽出およびクリーンアップによって得られた直線化プラスミドを示しています。変異負荷は、異なるランドスケープを持つ変異ライブラリをサンプリングし、親酵素活性の10%未満であるクローン数を算出し、さらに活性および非活性バリアントのランダムサンプルをシーケンシングして検証することで調整しました。本アッセイの検出限界を評価したところ、黒い円で示されるソルビトール存在下において、本アッセイは線形であることが示されました。白い四角で示されるソルビトール不在下では、直線性はより持続しましたが、応答は弱くなりました。AAO濃度と吸光度の間に直線的な相関が観察されました。このアッセイを用いて、2,000クローンの変異体ライブラリを構築し、スクリーニングを行いました。網掛けの正方形は、P-メトキシベンジルアルコールに対する分泌能と活性が著しく向上したAAO変異体を示しています。この手法を習得すれば、適切に実施することで、変異体ライブラリを約4時間で作成することが可能です。本手順を行う際は、in vivoスプライシングおよび単一の形質転換ステップでのクローニングのために、各PCRファミリーと線状化ベクターに対して適切なオーバーラップ領域を割り当てることが重要です。同様のアプローチを用いて、in vivo DNAサンプリング、飽和変異ライブラリ、またはDNAアセンブリなどの他の手法を実行し、変異ライブラリや代謝経路を構築することができます。この技術の開発により、バイオエンジニアリング分野の研究者が活性や安定性を探索し、さらには無限の種類の中間相互作用を創出するための道が開かれました。このビデオを視聴することで、ライブラリの構築およびスクリーニングにこの Saccharomyces Cerevisiae デバイスをどのように活用するかについて、十分な理解が得られるはずです。

directed-evolution-method-saccharomyces-cerevisiae-mutant-library

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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学ぶ、Saccharomyces cerevisiaeを用いた指向進化のための変異体ライブラリー構築とスクリーニング手法。計算アルゴリズムで標的領域を選び、単一の形質転換ステップで効率的に高品質な変異体を同定する方法です。

指向進化方法で

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