指向進化方法でサッカロマイセス・セレビシエ：変異体ライブラリーの作成およびスクリーニング
April 1st, 2016
私たちは、Saccharomyces cerevisiaeの指向性進化キャンペーンのための突然変異体ライブラリを構築し、スクリーニングするための詳細なプロトコルを提示します。
このプロトコルの全体的な目標は、指向性進化実験のために出芽酵母の変異体ライブラリを構築およびスクリーニングする方法を示すことです。この方法は、アセンブルやクローニングにオーバーラップ領域をどのように割り当てるかなど、焦点を絞った指向性進化実験のためのラボ作成における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、そのシンプルさと堅牢性であり、たった1つの変換ステップで高品質のレベルを割り当てることができます。
変異体ライブラリを作成およびスクリーニングするためのこのプロトコルは、真菌のアリールアルコールオキシダーゼまたはAAOについて実証されます。焦点を絞った指向性進化の領域は、まず、利用可能な酵素の結晶構造または相同性モデルに基づく計算アルゴリズムの助けを借りて選択されます。AAOの2つの領域、すなわちM1領域とM2領域がランダム変異誘発と組換えの対象となります。
標的領域を増幅するために変異原性 PCR を実施します。酵母のin vivoスプライシングを促進するために、定義された領域のPCR反応を重ね合わせることにより、それぞれ約50塩基対のセグメント間の重なり合う領域が作成されます。50マイクロリットルの容量の変異原性PCRを調製し、それぞれが46ナノグラムのDNAテンプレート、センスおよびアンチセンスプライマーのそれぞれ90ナノモル、DNTPの0.3ミリモル、DMSOの3%、塩化マグネシウムの1.5ミリモル、塩化マンガンの05ミリモル、およびタックDNAポリメラーゼのマイクロリットルあたり05ユニット。
摂氏95度で2分間、摂氏95度で45秒間、摂氏50度で45秒間、摂氏74度で45秒間28サイクル、摂氏74度で10分間のPCRプログラムを使用します。AAO遺伝子の残りの部分であるHF領域は、変異原性セグメントと重なる対応する領域、および/または線形化されたベクターオーバーハングを含む高忠実度PCRによって増幅されます。
10ナノグラムのDNAテンプレート、各250ナノモルのセンスプライマーとアンチセンスプライマー、0.8ミリモルのDNTP、3%のDMSOを含む最終容量50マイクロリットルでハイフィデリティPCRを調製します。以下のPCRプログラムをご利用ください。98°Cで30秒、98°Cで10秒、55°Cで25秒、72°Cで45秒で28サイクル、72°Cで10分間です。
次に、すべてのPCRフラグメントを、製造元のプロトコルに従って市販のゲル抽出キットで精製します。次のステップは、ベクターを線形化して、ターゲット遺伝子の5つのプライム末端と3つのプライム末端に相同な約50塩基対の隣接領域を作成することです。2マイクログラムのDNA、7.5ユニットのBamH-one、7.5ユニットのXHO-one、20マイクログラムのBSA、および2マイクロリットルの10xバッファーBamH-oneを含む20マイクロリットルの直鎖化反応混合物を調製します。
反応混合物を摂氏37度で2時間40分間インキュベートします。その後、80°Cで反応を不活性化し、20分間放置します。直鎖状ベクターを精製して残留環状プラスミドによる汚染を回避するには、消化反応ミックスを半分取低融点アガロースゲルのメガウェルにロードします。
反応混合物の5マイクロリットルをレポーターとして隣接する井戸にロードします。DNA電気泳動を摂氏4度、電極間を5ボルト/センチメートルで行います。次に、メガウェルに対応するアガロースゲルを分離し、1つのXTAEに摂氏4度で保存します。
分子量ラダーとレポーターでレーンを染色します。UVライトの下でバンドを視覚化し、線形化されたベクトルが配置される位置に切り込みを入れます。UV光がない場合、染色されたレポーターレーンのニックのガイダンスを使用して、メガウェルフラグメントの線形化されたベクトルを特定し、それを切り取ります。
アガロースから直鎖状化ベクターを抽出し、メーカーのプロトコルに従って市販のゲル抽出キットで精製します。続いて、精製された直鎖状化ベクターをPCRフラグメントと混合し、このDNA混合物を使用して、製造元の指示に従って市販のキットを使用してコンピテント酵母細胞を形質転換します。形質転換細胞をSCドロップアウトプレートに播種し、摂氏30度で3日間インキュベートします。
このアッセイの準備として、SCドロップアウトプレートから個々のコロニーを取り出し、ウェルあたり50マイクロリットルの最小培地を含む96ウェルプレートに移します。各プレートで、親タイプを内部標準として6列目に接種します。ネガティブコントロールとして、ウラシルを添加したSC培地で満たされたH-ONに、プラスミドを含まないURA3陰性ESI内臓細胞をよく接種します。
プレートを蓋で覆い、パラフィルムで包み、湿度の高いシェーカーで摂氏30度で48時間インキュベートします。48時間後、160マイクロリットルの発現培地を各ウェルに加え、プレートを再シールします。さらに24時間インキュベートします。
プレートを遠心分離した後、液体処理ロボットマルチステーションを使用して、各プレートのウェルから20マイクロリットルの上清をレプリカプレートに移します。20マイクロリットルの2ミリモルP-メトキシベンジルアルコールと100ミリモルのリン酸ナトリウム緩衝液ph6.0を各ウェルに加えます。プレートを96ウェルプレートミキサーで短時間撹拌し、室温で30分間インキュベー
トします。次に、各レプリカプレートに160マイクロリットルのFOXリーガントを追加し、ミキサーで短時間攪拌します。プレートリーダーで560ナノメートルのプレートを読み取ります。プレートを室温で色が現れるまでインキュベートします。
吸収を再度測定します。相対活性は、インキュベーション後の吸収値と初期測定値の差から、各プレートの親タイプに正規化されて計算されます。この代表的なゲル画像は、レーン 2 の直鎖状ベクター、レーン 3 の M1 PCR セグメント、レーン 4 の M2 PCR セグメント、レーン 5 の HF PCR セグメント、レーン 6 の NHE 1 と直鎖化された in vivo 再構成ベクターを示しています。
この次のゲルは、レーン 2 で再構成されたベクターのプラスミド ミニプレップ、レーン 3 で NHE 1 と直鎖化されたプラスミド、レーン 4 で BamH 1 と XHO 1 で直鎖化されたプラスミド、レーン 5 でゲル抽出とクリーンアップによって得られた直鎖化プラスミドを示しています。突然変異負荷は、異なるランドスケープの変異体ライブラリをサンプリングし、親酵素活性の10%未満のクローンの数を計算し、さらに活性バリアントと非アクティブバリアントのランダムサンプルをシーケンシングして検証することによって調整しました。このアッセイの検出限界の評価は、黒い円で表されるソルビトールの存在下でアッセイが線形であることを示しました。
白い四角で表されるソルビトールがない場合、直線性はより持続性がありましたが、応答は弱かった。AAO濃度と吸光度との間には線形相関が観察されました。2, 000クローンの変異ライブラリーを構築し、このアッセイでスクリーニングしました。
影付きの四角は、P-メトキシベンジルアルコールに対する分泌と活性が著しく改善されたAAO変異体を示しています。一度マスターすれば、適切に実行すれば、約4時間でミュータントライブラリを作ることができます。この手順を試みる際には、各PCRファミリーに適切なオーバーラップ領域と、in vivoスプライシングとクローニングのための直鎖状化ベクターを1つの形質転換ステップで割り当てることを忘れないようにすることが重要です。
同様のアプローチに従って、in vivo DNAサンプリング、飽和突然変異導入ライブラリ、DNAアセンブリなどの他の方法を実行して、変異ライブラリや代謝経路を構築することができます。その開発後、この技術は、バイオエンジニアリングの分野の研究者が活動、安定性を探求し、さらには無限の種類の相互作用を発明する道を開きました。このビデオを見れば、このSaccharomyces Cerevisiaeデバイスを図書館の建設とスクリーニングにどのように活用するかを十分に理解できるはずです
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
このプロトコルは、Saccharomyces cerevisiaeにおける誘導進化実験のための変異体ライブラリーの構築とスクリーニングを概説しています。効果的な変異誘発と組換えを可能にする簡単なアプローチを強調しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- バイオテクノロジー
- 遺伝子工学
- 微生物学
背景
- 誘導進化は、望ましい特性を持つタンパク質を開発するために使用される方法です。
- Saccharomyces cerevisiaeは、これらの実験のモデル生物として機能します。
- ランダムな変異誘発と組換えは、このプロセスにおける重要な技術です。
- 計算アルゴリズムは、変異誘発の対象領域を選択するのに役立ちます。
研究の目的
- 誘導進化のための変異体ライブラリーの作成とスクリーニングのプロトコルを示す。
- 誘導進化における組立とクローン化の重複領域を特定する。
- 真菌のアリール-アルコールオキシダーゼ（AAO）の特定領域を強化するためにターゲットにします。
使用した方法
- 計算アルゴリズムを使用した対象領域の選択。
- AAOのM1およびM2領域のランダムな変異誘発。
- 単一の形質転換ステップによる変異体ライブラリーのスクリーニング。
- 得られた変異体の品質の評価。
主要な結果
- Saccharomyces cerevisiaeにおける変異体ライブラリーの成功した構築。
- 望ましい特性を持つ効果的な変異体の特定。
- プロトコルの堅牢性の実証。
- AAOの誘導進化プロセスに関する洞察。
結論
- このプロトコルは、誘導進化研究のための信頼できる方法を提供します。
- 特定の領域をターゲットにすることで、変異誘発の効率が向上します。
- このアプローチは、AAO以外の様々なタンパク質にも適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Directed evolution in yeast enables rapid generation of functional enzyme variants for biotechnological applications, reducing reliance on in vitro steps and accelerating protein engineering timelines. This approach supports target validation by linking genetic modifications to measurable activity improvements in a eukaryotic host. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing quantitative, secretion-linked activity readouts relevant to industrial enzyme production.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of structure-guided regions (M1, M2) to clarify functional contributions to enzyme activity.
- Operational Value: Uses overlapping ~50 bp homology arms for seamless in vivo reassembly, minimizing cloning steps and transformation burden.
- Scientific Value: Screens mutant libraries in yeast supernatants using a Fenton-based assay, directly correlating genotype with secreted enzyme function.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Employs a high-throughput, sensitive assay based on P-methoxybenzyl alcohol oxidation to quantify aryl-alcohol oxidase activity in 96-well format.
- Operational Value: Normalizes activity to parental type and uses internal controls (parental strain, negative control) to ensure assay robustness across plates.
- Scientific Value: Detects improved secretion and activity, enabling identification of variants with enhanced performance under screening conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates linearity of assay response with enzyme concentration, supporting reliable quantification across mutant libraries.
- Operational Value: Confirms assay performance in presence/absence of sorbitol, defining working range for accurate hit selection.
- Scientific Value: Validates hits through sequencing of active and non-active clones, linking phenotype to genotype for downstream characterization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates library construction and functional screening into a discovery workflow from target region selection to hit identification, enabling iterative enzyme optimization campaigns.
- Discovery Biology: Uses computational algorithms to select mutagenesis sites based on AAO structure, focusing evolution on functionally relevant regions.
- Screening: Delivers quantitative, supernatant-based activity readouts that support reproducible, plate-to-plate comparison of mutant function.
- Analytics: Measures relative activity via absorbance shift at 560 nm, normalized to parental strain, enabling objective variant ranking.
- Translational Research: Secretion-linked screening in yeast provides early insight into expressibility and function, relevant for biologics and industrial enzyme development.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other eukaryotic genes, avoiding repeated optimization of PCR, recombination, and screening steps.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking targeted mutagenesis to measurable changes in enzyme activity and secretion.
- Operational Value: Achieves library construction and screening in ~4 hours post-transformation, enabling rapid design-build-test cycles.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enriching libraries with functional variants and minimizing false negatives through sensitive detection.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying mutants with improved activity, guiding investment toward promising enzyme candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast molecular biology, PCR optimization, and agarose gel purification for linearized vector preparation.
- Dependent on thermocyclers, gel electrophoresis systems, plate readers, and liquid-handling robots for supernatant transfer and reagent addition.
- Necessitates standardization of overlapping regions (~50 bp) and transformation efficiency to ensure consistent in vivo reassembly across projects.
- Adaptation to other genes may require re-evaluation of homology arm length, mutagenic conditions, and assay compatibility with target enzyme activity.
- Practical limitation: Assay sensitivity depends on substrate choice and buffer conditions; optimization may be needed for enzymes with low activity or alternative reaction mechanisms.
