指向進化方法で

このプロトコルの全体的な目的は、定方向進化実験のために、Saccharomyces Cerevisiaeにおける変異ライブラリの構築およびスクリーニング方法を示すことです。この手法は、アセンブリおよびクローニングにおける重複領域の割り当て方法など、集中的な定方向進化実験に用いるラボでの作製に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、その簡便さと堅牢性にあり、わずか1回の形質転換ステップで高品質なレベルのライブラリを構築できる点にあります。

変異体ライブラリーの作製およびスクリーニングのための本プロトコルでは、真菌由来のアリールアルコール酸化酵素（AAO）を用いて実演します。フォーカスした指向性進化の対象領域は、まず、利用可能な酵素の結晶構造またはホモロジーモデルに基づく計算アルゴリズムを用いて選択します。AAOのM1領域とM2領域の2つの領域を、ランダム変異導入および組換えの標的とします。

標的領域を増幅するために、変異導入PCRを行います。酵母におけるin vivoスプライシングを促進するため、定義された領域のPCR反応を重ね合わせることで、各セグメント間に約50 base pairsのオーバーラップ領域を作成します。DNAテンプレート 46 nanograms、センスおよびアンチセンスプライマー 各90 nanomolar、DNTPs 0.3 milimolar、DMSO 3%、塩化マグネシウム 1.5 milimolar、塩化マンガン 0.5 milimolar、およびTaq DNAポリメラーゼ 0.5 units per microliterを含む、50 microliterの変異導入PCR反応液を調製します。

以下のPCRプログラムを使用します。95 °Cで2分間、95 °Cで45秒間、50 °Cで45秒間、74 °Cで45秒間を28サイクル繰り返し、最後に74 °Cで10分間加熱します。AAO遺伝子の残りの部分であるHF領域は、変異導入セグメントと重複する対応領域、および/または直線化ベクターのオーバーハングを含むハイフィデリティPCRによって増幅します。

DNAテンプレート10 ng、センスおよびアンチセンスプライマーをそれぞれ250 nM、dNTPs 0.8 mM、DMSO 3%、およびiProof ultra high-fidelity DNA polymerase 0.2 units/µLを含む、最終容量50 µLで高忠実度PCR反応液を調製します。以下のPCRプログラムを使用してください：98 °Cで30秒間、次いで（98 °Cで10秒間、55 °Cで25秒間、72 °Cで45秒間）を28サイクル繰り返し、最後に72 °Cで10分間保持します。

その後、すべてのPCR断片を、メーカーのプロトコルに従い、市販のゲル抽出キットを用いて精製します。次のステップは、標的遺伝子の5'末端および3'末端と相同な約50塩基対の隣接領域を作成するために、ベクターを直線化することです。2 µgのDNA、7.5 unitsのBamH-one、7.5 unitsのXHO-one、20 µgのBSA、および2 µLの10x BamH-oneバッファーを含む、20 µLの直線化反応混合液を調製します。

反応混合物を37 °Cで2時間40分間インキュベートします。その後、80 °Cで20分間加熱して反応を停止させます。残存する環状プラスミドによるコンタミネーションを避けて線状化ベクターを精製するため、消化反応液をセミプレパラティブ低融点アガロースゲルのメガウェルにロードします。

レポーターとして、隣接するウェルに反応ミックスを5 µLロードします。電極間を5 V/cm、4 °CでDNA電気泳動を行います。その後、メガウェルに対応するアガロースゲルを切り出し、1X TAE中で4 °Cで保存します。

分子量マーカーとレポーターを含むレーンを染色します。UVライト下でバンドを可視化し、直線化ベクターが位置する箇所に切り込みを入れます。UVライトを消灯し、染色したレポーターレーンの切り込みをガイドにして、メガウェルフラグメント中の直線化ベクターを特定し、切り出します。

アガロースから線状化したベクターを抽出し、市販のゲル抽出キットを用いて製造者のプロトコルに従って精製します。続いて、精製した線状化ベクターをPCR断片と混合し、このDNA混合液を用いて、市販のキットを用いて製造者の指示に従いコンピテント酵母細胞に形質導入します。形質導入した細胞をSCドロップアウトプレートに播種し、30 °Cで3日間インキュベートします。

本アッセイの準備として、SCドロップアウトプレートから個別のコロニーをピックアップし、1ウェルあたり50 µLの最小培地を含む96ウェルプレートに転移させます。各プレートの6列目には、内部標準として親株を接種します。陰性対照として、ウラシルを添加したSC培地を満たしたH-1ウェルに、プラスミドを含まないURA3陰性のESI内臓細胞を接種します。

プレートに蓋をし、パラフィルムで密閉して、加湿シェーカーを用いて30 °Cで48時間インキュベートします。48時間後、各ウェルに160 µLの発現培地を加え、プレートを再度密閉します。さらに24時間インキュベートします。

プレートを遠心分離した後、液体ハンドリングロボットマルチステーションを用いて、各プレートのウェルから20 µLの上清をレプリカプレートに分取します。各ウェルに2 mMのp-メトキシベンジルアルコールと100 mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）を20 µLずつ添加します。96ウェルプレートミキサーでプレートを短時間撹拌し、室温で30分間インキュベートします。

次に、各レプリカプレートに160 µLのFOX試薬を加え、ミキサーで短時間撹拌します。プレートリーダーを用いて、560 nmでプレートを読み取ります。色が発色するまで、プレートを室温でインキュベートしてください。

再度吸光度を測定します。相対活性は、各プレートについて、インキュベーション後の吸光度と初期測定値との差を算出し、親株で規格化することによって求めます。この代表的なゲル画像は、2番目のレーンに線状化したベクターを、3番目のレーンにM1 PCRセグメントを、4番目のレーンにM2 PCRセグメントを、5番目のレーンにHF PCRセグメントを、そして6番目のレーンにNHE1で線状化したin vivo再構成ベクターを示しています。

次のゲルでは、2番目のレーンに再構築したベクターのプラスミドミニプレップを、3番目のレーンにNhe Iで直線化したプラスミドを、4番目のレーンにBamH IおよびXho Iで直線化したプラスミドを、そして5番目のレーンにゲル抽出およびクリーンアップによって得られた直線化プラスミドを示しています。変異負荷は、異なるランドスケープを持つ変異ライブラリをサンプリングし、親酵素活性の10%未満であるクローン数を算出し、さらに活性および非活性バリアントのランダムサンプルをシーケンシングして検証することで調整しました。本アッセイの検出限界を評価したところ、黒い円で示されるソルビトール存在下において、本アッセイは線形であることが示されました。

白い四角で示されるソルビトール不在下では、直線性はより持続しましたが、応答は弱くなりました。AAO濃度と吸光度の間に直線的な相関が観察されました。このアッセイを用いて、2,000クローンの変異体ライブラリを構築し、スクリーニングを行いました。

網掛けの正方形は、P-メトキシベンジルアルコールに対する分泌能と活性が著しく向上したAAO変異体を示しています。この手法を習得すれば、適切に実施することで、変異体ライブラリを約4時間で作成することが可能です。本手順を行う際は、in vivoスプライシングおよび単一の形質転換ステップでのクローニングのために、各PCRファミリーと線状化ベクターに対して適切なオーバーラップ領域を割り当てることが重要です。

同様のアプローチを用いて、in vivo DNAサンプリング、飽和変異ライブラリ、またはDNAアセンブリなどの他の手法を実行し、変異ライブラリや代謝経路を構築することができます。この技術の開発により、バイオエンジニアリング分野の研究者が活性や安定性を探索し、さらには無限の種類の中間相互作用を創出するための道が開かれました。このビデオを視聴することで、ライブラリの構築およびスクリーニングにこの Saccharomyces Cerevisiae デバイスをどのように活用するかについて、十分な理解が得られるはずです。