A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Michael Allen Stiffler; Subu K Subramanian; Victor H Salinas; Rama Ranganathan

doi:10.3791/54119

ハイスループットシーケンシングを利用し全体プロテイン飽和突然変異誘発ライブラリの機能評価のための...

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A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

ハイスループットシーケンシングを利用し全体プロテイン飽和突然変異誘発ライブラリの機能評価のためのプロトコル

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11:36 min

July 3, 2016

DOI: 10.3791/54119-v

Michael Allen Stiffler¹, Subu K Subramanian¹, Victor H Salinas¹, Rama Ranganathan¹

¹Green Center for Systems Biology,University of Texas Southwestern Medical Center

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

我々は、ハイスループットシーケンシングを利用したタンパク質の包括的な単一部位飽和突然変異誘発ライブラリの機能評価のためのプロトコルを提示します。重要なことに、このアプローチは、ライブラリー構築および配列決定を多重化するために直交するプライマー対を使用しています。アンピシリンの臨床的に関連する用量で選択されたTEM-1βラクタマーゼを使用して、代表的な結果を提供しています。

このプロトコルの全体的な目標は、ハイスループットシーケンシングを利用して、タンパク質の包括的な単一部位飽和突然変異導入ライブラリの機能評価を説明することです。この方法は、生化学と分子進化の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、タンパク質に対する生化学的、構造的、進化的な制約は何か?

そして、新しい機能を持つタンパク質をどのように操作できるのでしょうか?この手法の主な利点は、ライブラリの構築とシーケンシングを多重化することにより、全タンパク質飽和突然変異誘発研究における多数の有用なシーケンシングリードを最大化することです。テキストのプロトコルに従ってPCR Master Mixのプレートを調製した後、マルチチャンネルピペットを使用して、以前に希釈したセンス突然変異導入プライマーを含む96ウェルプレートから10マイクロリットルをPCRプレートの同族ウェルに移します。

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