ハイスループットシーケンシングを利用し全体プロテイン飽和突然変異誘発ライブラリの機能評価のためのプロトコル

このプロトコルの全体的な目標は、ハイスループットシーケンシングを利用して、タンパク質の包括的な単一部位飽和突然変異導入ライブラリの機能評価を説明することです。この方法は、生化学と分子進化の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、タンパク質に対する生化学的、構造的、進化的な制約は何か?

そして、新しい機能を持つタンパク質をどのように操作できるのでしょうか?この手法の主な利点は、ライブラリの構築とシーケンシングを多重化することにより、全タンパク質飽和突然変異誘発研究における多数の有用なシーケンシングリードを最大化することです。テキストのプロトコルに従ってPCR Master Mixのプレートを調製した後、マルチチャンネルピペットを使用して、以前に希釈したセンス突然変異導入プライマーを含む96ウェルプレートから10マイクロリットルをPCRプレートの同族ウェルに移します。

プレートシールを使用して各PCRプレートを覆い、200 Gで2分間遠心分離します。次に、PCRプレートをサーモサイクラーに移し、次のプログラムを実行します。追加のPCRを実施し、反応を1〜100に希釈した後、混合して希釈した第1ラウンド変異原性PCR産物から1マイクロリットルを、マスターミックスを含む新しいPCRプレートの同族ウェルに移します。

プレートシールを使用して、各PCRプレートを覆います。プレートを約200Gで2分間遠心分離します。次に、プレートをサーモサイクラーに移し、ビデオで前述したのと同じプログラムを実行します。

PCR産物のサイズを確認し、テキストプロトコルに従って濃度を測定した後、各NNSサブライブラリPCR産物100ナノグラムを5つのNNSサブライブラリグループに混合します。サブライブラリPCR反応を実行し、PCR反応でクローニングベクターを消化した後、テキストプロトコールに従って、消化された各NNSサブライブラリグループについて、これらのガイドラインに従ってライゲーション反応を設定し、その同族制限消化クローニングベクターを使用します。その後、室温で1時間インキュベートします。

エレクトロコンピテント大腸菌細胞を解凍したら、精製した各ライゲーション反応に10マイクロリットルの細胞を加え、エレクトロプロレーションキュベットに移します。細胞を1.8キロボルトでエレクトロプロレートし、次に1ミリリットルのSOB培地を加え、摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、各回収培養物の10マイクロリットルを990マイクロリットルのLBに再懸濁します。そして、テトラサイクリン1ミリリットルあたり12マイクログラムを含むLBオーガープレートに100マイクロリットルを広げます。

各回収培養ごとに、50ミリリットルのLBと50マイクロリットルのテットストックを含む250ミリリットルの培養フラスコを準備します。残りの約1ミリリットルの回収培養物をフラスコに移します。摂氏37度、200rpmで一晩インキュベートします。

プレート上の成功した形質転換体の数を数え、一晩培養した血液から血漿DNAを単離した後、各プラスミドを100ナノグラム混合します。テキストプロトコールに従ってDNAライブラリーを形質転換した後、ライブラリーを一晩培養してOD-600に希釈し、0.1に等しくします。そして、1つのフラスコに1ミリリットルを追加します。

予備選択培養物を摂氏37度、200RPMでインキュベートします。OD-600 が 0.1 になるまで測定して、成長を定期的に監視します。100ミリリットルの事前選択培養物を2本の50ミリリットルの円錐管に移し、摂氏4度で4, 000Gで6分間遠心分離します。

上清の大部分を取り除き、ペレットを1つの15ミリリットルの円錐管に結合します。その後、遠心分離を繰り返した後、上清液をすべて取り除きます。他の2つのフラスコに、テトラサイクリンを最終濃度12マイクログラム/ミリリットルまで加えます。

そして、最終的なOD-600が0.001に等しくなるような事前選択文化のボリューム。1つのフラスコに、アンピシリン1ミリリットルあたり50ミリグラムを1ミリリットルあたり50マイクログラムの最終濃度で追加します。これが選択文化です。

200 RPMで37°Cで培養物をインキュベートしながら、アンピシリンを含まない培養物がOD-600 0.1に達するまで成長を監視します。選択培養のOD-600も測定します。選択培養物のOD-600を0.1に分割し、100を掛けた後、この容量を50ミリリットルの円錐管に移し、4, 000Gsと摂氏4度で6分間遠心分離します。

上清の大部分を取り除いた後、ペレットを1つのチューブにまとめてから、再度回転させてすべての上清を取り除きます。ハイスループットシーケンシングを行うには、PCR Master Mixを調製し、23マイクロリットルを10本のPCRチューブに移します。精製プラスミドDNAのマイクロリットルあたり0.5ナノグラムの1マイクロリットルを、事前選択培養からチューブ1〜5に添加します。

そして、選択文化からチューブ6から10まで。50マイクロリットルの50マイクロモルの前方直交プライマー(OP1FからOP5F)と、それぞれの逆直交プライマー(OP1RからOP5R)を混ぜ合わせます。同じ順序で、1マイクロリットルをPCRチューブ1〜5、および6〜10に移します。

PCRチューブをサーモサイクラーに移し、次のプログラムを実行します。次に、各チューブから1マイクロリットルを99マイクロリットルの水に移すことにより、PCR反応を100倍に希釈します。よく混ぜてから、チューブから99マイクロリットルをピペットで取り出し、廃棄します。

50マイクロリットルのフォワードプライマーとリバースプライマーを混ぜ合わせます。次に、1マイクロリットルをPCRチューブ1〜5、および6〜10に移します。次に、PCR Master Mixを調製した後、各PCRチューブに23マイクロリットルを加え、次のプログラムを実行します。

インデックス配列を添加する最終PCRを実施するには、PCR反応を前回と同様に100倍に希釈し、1マイクロリットルを保持した後、PCR Master Mixを23マイクロリットル加える。NNSサブライブラリグループ1から5に由来するテンプレートを持つチューブの場合、501Fから505Fにそれぞれ0.5マイクロリットルのフォワードプライマーを追加します。事前選択および選択培養から得られたテンプレートを含むチューブの場合は、0.5マイクロリットルのリバースプライマー701Rおよび702Rを追加します。

示したのと同じPCRプログラムを実行します。次に、テキストプロトコルに従って各反応の濃度を測定した後、各PCR産物100ナノグラムを1つのマイクロ遠心チューブに混合します。6Xゲルローディング色素を添加した後、混合したPCRサンプル全体を2%アガロースゲルにロードします。

そして、ゲルを100ボルトで50分間泳がせます。長波長UVイルミネーターを使用して、約360塩基対のPCR産物を含むスライスを視覚化し、切り出します。テキストプロトコルに従ってサンプルを精製、配列決定、および分析します。

ここには、直交プライミング部位を含む5つの修飾pBR322プラスミドのプラスミドマップが示されています。PCRを用いた直交プライマーの特異性試験では、適合するプラスミドが反応に含まれた場合にのみ、正しいPCR産物が得られることが示されました。そして、それがなければ、どんなサイズの製品も得られませんでした。

実験処理後、事前選択条件から10の6.2倍から6回目の読み取り、アンピシリン条件から10の6.3倍から6回目の読み取りが得られました。事前選択条件からの各アミノ酸変異のカウントは、対数正規分布を示します。この図は、TEM-oneの各位置における各突然変異に対する相対適応度効果FIAを示しています。

そして、その分布をここに示します。50マイクログラム/ミリリットルのアンピシリンでの選択下では、ほとんどの突然変異は中立またはほぼ中立の適応効果を示します。ここの白いピクセルとここの大きなピークに対応します。

この抗生物質濃度での突然変異のごく一部は、フィットネスに大きな影響を与えます。予想通り、これらには高度に保存された活性部位残基内の突然変異が含まれます。対照的に、著しく赤く見えるピクセルはほとんどありません。

一度習得すれば、このテクニックは約1週間で完了します。それが適切に行われ、すべての試薬が利用可能である場合。この手順を試行する際は、クローニング中に整理整頓を保ち、変異原性PCR産物を正しいグループに組み合わせ、正しいベクターにクローニングすることを覚えておくことが重要です。

また、シーケンシングの準備中に、正しいプライマーを使用します。この手順から拡張して、プロトコルの主要なステップは、突然変異の組み合わせ、異なる選択環境、および他のタンパク質システムを調べるために変更することができ、突然変異の遺伝的および環境的文脈依存性に関する追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、全タンパク質飽和突然変異導入ライブラリーの構築に必要な作業と、ハイスループットシーケンシングを使用して各変異の機能的影響を同時に評価するために必要な作業について十分に理解できるはずです。

エチジウムブロマイドや紫外線を扱う作業は危険な場合があり、このプロトコルの一部を実行する際には、手袋、白衣、UVシールドなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。