より厳格な特異性を有する制限エンドヌクレアーゼのインビトロ指向進化

当社のプロトコルは、体外区画化と指向進化におけるユニークな選択戦略を使用して、変化した、より厳格な配列特異性を持つ制限酵素の作成を可能にします。制限エンドヌクレアーゼに適用され、選択は元のコネートシーケンスのより厳しいバージョンに向けることができるので、潜在的にそれは非常に普遍的です。新しく作成された変異体がin vitro転写翻訳によって発現される場合、プロトコルは特異性を絞り込むだけでなく、特異性を変化させるのにも適している。

亜飽和変異形成の部位を決定するには、サイトの仮定の重要性に応じて変異発生頻度を選択し、ライブラリ全体の複雑さに制限を念頭に置きます。合成を開始するには、新しい樹脂を詰めた列をシンセサイザーに挿入します。トリプレットまで全てのカラムのオリゴヌクレオチドを合成し、3素端から数える第2の亜飽和変異発生部位の直前に。

合成し、5素数のトリチウム基を最後に残す。保護グループは、次の合成サイクルの開始時に削除されます.合成カラムを開き、乾いた1.5ミリリットルのチューブに短時間遠心分離して樹脂を回収します。

CPG合成サポートを引き出し、渦によって混合します。混合CPG樹脂を新しい合成カラムに再分割します。湿度は全体的な収量を減少させるので、導入を避けてください。

亜飽和変異生成部位トリプレットから始めて、合成を継続する。目的の突然変異発生頻度に従って、カラムをランダム化NNS三つ子または野生型三つ子に割り当てます。追加の亜飽和部位が存在する場合は、次の亜飽和変異形成部位の前に三重項に進む。

下流に亜飽和部位が存在しない場合は、合成を完了し、最後に5原性トリチウム基を残す。広いボアピペットチップを使用して、スパン80の225マイクロリットルとTween 80の25マイクロリットルを15ミリリットルの円錐形チューブに5ミリリットルのミネラルオイルを加えることによって、油界面活性剤混合物を調製します。穏やかな反転で15回徹底的に混ぜます。

このステップでの混合物は半透明である必要があります。各ライブラリーについて、950マイクロリットルの油界面活性剤混合物を2ミリリットルの丸底極低温バイアルに移す。ライブラリ名でラベルを付け、氷に移します。

各バイアルに小さな円筒形の攪拌棒を1つ入れます。メーカーの提案に従って、インビトロ転写翻訳反応混合物を準備します。1.5 ミリモルの最終濃度に塩化マグネシウムと混合物を補います.

反応混合物の50マイクロリットルのアリコートを氷上の1.5ミリリットルのチューブに分配する。氷上の反応混合物にライブラリの1.7フェムトモレを追加します。まず、攪拌速度を1150 RPMに設定して、磁気攪拌機に氷で満たされた小さなビーカーを置くことによって、各ライブラリに連続して油水中エマルジョンを調製します。

その後、950マイクロリットルの油界面活性剤混合物と小さな攪拌バーを備えた極低温バイアルを磁気攪拌機の氷冷ビーカーに移します。攪拌バーが回転していることを確認します。30秒間隔で2分間にわたってインビトロライブラリ転写翻訳混合物の5つの10マイクロリットルのアリコートを加え、さらに1分間攪拌を続ける。

エマルジョンを使用してバイアルを氷容器に移します。この時点で、液体は半透明ではなく不透明でなければなりません。次に、次のライブラリに進みます。

すべてのライブラリが処理された後、キットメーカーの推奨に従って、すべてのライブラリのインキュベーションを開始します。バイアルを、少なくとも10分間氷の上に置く前に、さらに2時間、設計されたエンドヌクレアーゼに最適な温度に移します。1.5ミリリットルのチューブに極低温バイアルからエマルジョンを転送します。

5モルEDTAの1マイクロリットルを加えます。そして、室温で5分間13,000倍gでそれらを遠心分離します。遠心後に水油界面がはっきりと見えない場合は、上部油相の吸引前に混合物を凍結してください。

上部の油相をピペットで動かし、廃棄します。水相にフェノールクロロホルム150マイクロリットルと10ミリモルトリス-HClの100マイクロリットルを加えて抽出をすぐに行います。ボルテックスを、次いで13,000倍gで30秒遠心分離を経て相分離を行う。

上部水相を収集します。3モル酢酸ナトリウム15マイクロリットル、グリコーゲン2.5~5マイクログラム、エタノール375マイクロリットルを添加してDNAを沈殿させる。サンプルをマイナス20度で1時間インキュベートした後、遠心分離機は13,000グラム、摂氏4度で15分間処理します。

上清を捨て、冷たい70%エタノールの1ミリリットルでペレットを短時間洗います。DNAグリコーゲンペレットをスピードバクまたはエアドライヤーで5分以上乾燥します。その後、ペレットを10ミリモルトリス-HClの50マイクロリットルに溶解する。

次に、メーカーの指示に従って調製したストレプトアビジン磁気ビーズを5マイクロリットル加えます。室温で1時間混合し、好ましくはカルーセルミキサーで、または穏やかな渦によって混合する。チューブを磁気スタンドに移してビーズを分離します。

その後、ビオチンを含まないDNAに濃縮された液体を回収する。このプロトコルは、不活性な酵素およびエンドヌクレアーゼを不変の野生型配列特異性で枯渇させることによって、設計された制限エンドヌクレアーゼの所望の変異体の頻度を増加させるツールである。成功したスクリーニングは有望な変種の20%まで識別できる。

変異体は、野生型酵素とは異なる切断パターンを生成する場合、有望な変異体として標識される。シーケンスの優先順位を変更した可能性があるバリアントにもラベルが付けられます。ここに示されているのは、非アクティブな分散の大部分と明らかに変化していない切断パターンを持つ1つの変異体を伴うスクリーニングに失敗した。

この場合、ライブラリはストレプトアビジンキャプチャ選択ステップを逃れた非アクティブなバリアントによって支配されている可能性が最も高い。選択された、カウンター選択された配列を慎重に設計し、少数の選択された位置で置換を生成する変異生成戦略によってライブラリーの多様性を制限することが重要である。選択された最良の変異体は、最初のスクリーニングからの結果に基づいて、好ましいと切断された配列に結合および切断動態について十分に特徴付けるべきである。

我々の試験事例では、変異遺伝子形成部位を相同性モデルに基づいて選択した。驚くべきことに、結晶構造は後に、いくつかの改変された残基がDNAと直接接触していない可能性が最も高いことを示した。