開発ゼブラフィッシュの表皮から細胞の押出のライブイメージング

上皮組織の維持には、バリア機能を中断することなく、損傷した細胞や死にかけている細胞を継続的に除去する必要があります。この上皮突出を達成するためには、死にかけている細胞を囲む細胞内でアクチンとミオシンの輪を形成および収縮させることにより、死にかけている細胞を排出し、その出口から生じた可能性のあるギャップを埋めます。このビデオ記事では、ゼブラフィッシュの幼生の表皮からのアポトーシス細胞の押し出しをリアルタイムで誘導し、画像化する方法をご紹介します。

これは、表皮で緑色蛍光タンパク質を発現する1細胞期のトランスジェニックゼブラフィッシュ胚に赤色蛍光タンパク質標識Fアクチンプローブを注入し、上皮組織における作用性フィラメントを可視化することによって達成されます。4日目、GFPとRFPの両方を発現するパーソナライゼーション後の幼虫をG4 18で処理して、表皮にアポトーシスを誘導します。押出成形中に発生するアクチン動態と上皮細胞の形状変化は、スピニングディスク共焦点顕微鏡でのタイムラプスイメージングによって視覚化されます。

この手法が免疫力や分析などの既存の方法よりも優れている点は、生体上皮組織内での押し出しプロセス中に発生する急速な変化とアクチンダイナミクスを観察できることです。この動画では、発育中のゼブラフィッシュの表皮からアポトーシス細胞の押出しをリアルタイムでイメージングする手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して、細胞がバリア機能を維持しながらアポトーシス細胞を排除するためにアクトン細胞骨格を協調的に再配置する方法と、押し出しプロセスの混乱がどのように特定の病状につながるかを理解しています。

では、発生中のゼブラフィッシュの表皮での細胞の押し出し中の作用ダイナミクスを視覚化するには、以前に転写されたRNAを氷上で解凍することから始めます。ウトロフィンの相同性ドメインで頭皮に融合した赤色蛍光タンパク質をコードするMr.mRNAを転写し、結合タンパク質に作用します。フェノールレッドを1対1の比率でRNAに添加し、最終RNA濃度をマイクロリットルあたり約30ナノグラムにし、バックフィルにより引っ張った毛細血管針に1マイクロリットルの溶液をロードします。

E threeバッファーに約75個の1細胞期C-K-G-F-P胚を採取します。採取した胚を5/4パスタピペットと3/4パスタピペットでマイクロインジェクション型にピペットで入れ、FST Dumontで胚をトラフに優しく向き付けます。第5に、鉗子は迅速に機能するため、標準的な実験室解剖実体顕微鏡で多段階の胚にRNAを注入する必要がなくなります。

圧力制御されたマイクロインジェクターを使用して、フェノールの化石としてRNAを胚のヨークに注入します。注射後の胚に赤が見えるはずです。各実験で少なくとも50個の胚を注入するようにしてください。

胚を選別して、未受精卵または損傷した卵子を取り除き、残りのすべての胚を摂氏28度で孵化させます。24時間後、蛍光解剖顕微鏡を使用して、表皮に高レベルのGFP蛍光を持ち、RFP標識された作用蛍光を持つゼブラフィッシュ胚を選択します。選択した胚を、アミノ配糖体へのアポトーシス曝露を誘導するための薬物治療を進める準備ができるまで、摂氏28度でインキュベー

抗生物質G four 18または薬は、発育中のゼブラフィッシュの幼生の表皮からアポトーシス細胞の押し出しを引き起こします。重要なことに、この治療法は、受精後4日で細胞の押し出しを誘発するそれ以上の幼虫にのみ機能します。受精後4日で最大25匹のゼブラフィッシュの幼生を集め、GFPとRFPの両方を発現させて、3ミリリットルのE、3培地を含む10mmの培養皿に入れます。

培地をG 4 18の1ミリリットルあたり1ミリグラムを含む3ミリリットルのE 3と慎重に交換し、幼虫を28°Cの暗闇で4時間薬でインキュベートします。次に、培地を取り出し、0.02%トリカを含む予温Eの3つの培地と交換し、幼虫のマウントに進み、イメージングのために幼虫をマウントします。最大3匹の幼虫を1.5ミリリットルのフェンダーチューブに移し、Eスリーメディウムのほとんどを取り除きます。

カットされたピペットチップピペットを使用して、120マイクロリットルの1%低メルトアロスをチューブミックスに入れます。次に、幼虫とaroの混合物をマテックカルチャーディッシュの底にあるカバーガラスにそっとピペットで移します。インサートピンまたはタングステン針が取り付けられたFSTピンホルダーを使用して、幼虫がカバーガラスに対してまっすぐで平らになるように、幼虫をすばやく向けます。

アオスが固まるのを待ちます。次に、0.02%トリカを含むE3培地を皿にそっと満たします。私たちは、発育中のゼブラフィッシュの幼生の表皮からアポトーシス細胞を押し出している全過程が約20分かかることを発見しました。

ここでは、スピニングディスク共焦点顕微鏡とAND/またはIQソフトウェアを使用して、ゼブラフィッシュの表皮の単層からシリーズZ平面を収集するためのタイムラプスイメージング実験を設定する方法を示します。まず、アルゴンとヘリウムネオンレーザーの顕微鏡カメラと落射蛍光灯をおよびまたはIQソフトウェア内で電源を入れます。画像化する波長を含む時系列プロトコルを作成します。

画像キャプチャの間隔の頻度とキャプチャを繰り返す回数 標本が入ったマットテック皿を顕微鏡ステージにそっと置き、透過光の20倍対物レンズを使用して幼虫に焦点を合わせます。40倍水浸対物レンズを正しい位置に移動します。この対物レンズを使用すると、フィールドあたり約20〜25個の細胞を撮影できるため、押し出し中の細胞の挙動を追跡しながら、細胞内の作用ダイナミクスを解決できます。

40倍の対物レンズの上部に一滴の水を慎重に置き、マットテック皿をすばやく上に置きます。明視野照明を使用して試料を同定し、488ナノメートルの落射蛍光を使用して、GFP陽性の表皮に特異的に焦点を合わせます。共焦点スキャンモードに切り替えます。

それに応じて、各チャンネルのレーザー強度と露光時間を調整します。レーザーの出力と露光時間のバランスを取り、信号を最適に検出し、光毒性を防ぐように注意してください。押し出されている細胞を同定するには、蛍光エピを使用してGFP標識表皮を視覚化し、中央の小さな丸い細胞を囲む細胞の集まりで構成される古典的なロゼットパターンの細胞群を同定します。

さらに、RFPで標識されたアクチンが蓄積し、中央の小さな丸いセルの周りにリングとして見える必要があります。これは、細胞の押し出しの特徴です。押し出しセルを特定したら、Zシリーズの上限と下限、およびステップサイズをすばやく設定します。次に、4つのD共焦点データセットの取得を開始して、データを表示し、アクチンリングの収縮と死にかけている細胞の周囲で発生する上皮の挙動を視覚化します。

時間をかけてZシリーズの3D投影を行い、データをムービーファイルとして保存します。この手順は、さまざまなソフトウェアパッケージを使用して実行できます。この図は、受精後4日間のCK GFPゼブラフィッシュ幼生の表皮におけるRFP UTR CHの発現を示しています。

ここでは、タイムラプス映画のZプロジェクションをライブ演技のダイナミクスに追従してフレームに収めています。上皮細胞の押し出しの過程で、矢印は隣接する細胞によって形成されたアクチンの環を示し、これは2分間にわたって収縮および閉じます。この手順に続いて、化学阻害剤や遺伝子変異の使用など、この手法と組み合わせて他の方法を使用して、押し出しの変更が特定の病状にどのようにつながるかをよりよく理解することができます。

アポトーシス細胞の除去に失敗したことから、発育中のゼブラフィッシュの表皮からの押し出しプロセスを視覚化するためのタイムラプスイメージング実験の設定方法を紹介しました。この手順を実行するときは、光の漂白や毒性を防ぐために、標本にさらされる光の量を制限することを忘れないでください。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。