細胞運動やゼブラフィッシュ胚における個々の神経細胞と神経堤細胞のアクチン細胞骨格のライブイメージング

個々の細胞のin vivo血漿の挙動を画像化するために、細胞特異的なプロモーターを含む血漿DNAを植物相の発現を駆動する4またはバイオセンサーをゼブラフィッシュの胚に注入します。分布効果の動的変化は、UtrophinのF効果と結合ドメインに基づくバイオセンサーを使用してin vivoで可視化されます。新たに受精した胚は、注入スライドに沿って並べられ、上部と下部のスライドの間に形成されたコーナーに配置されます。

フルオロフォーまたはバイオセンサーをコードするDNAが細胞に注入されます。翌日。胚はアロスに取り付けられています。

イメージングスライド上で、胚を標識された細胞を下にして配置し、チャンバーをカバースリップで密封します。こんにちは、ウィスコンシン大学マディソン校のメアリー・ハリン研究所と動物学・解剖学教室のエリカ・アンダーソンです。私はNam Tauri、同じくHallin Labの

Hallin LabのMatt Clayです。本日は、ゼブラフィッシュ胚の個別標識細胞のライブイメージングの手順をご紹介します。この手順を実験室で使用して、軸索伸長および神経堤細胞移動中の細胞の運動性とアクチンダイナミクスを研究しています。

それでは始めましょう。最初にインジェクションスライドを組み立てるには、製造元の指示に従ってシルガードシリコーンエラストマーを準備します。エラストマーベース10部と硬化剤1部を混合します。

シリンダーガードを使用して、3つの標準的なガラス顕微鏡スライドを接着します。2つのスライドを長い方の端に並べて配置します。3 番目のスライドに ARD を適用し、他の 2 つのスライドの上に置きます。

スライドの間から過度ににじみ出さないようにスライドを密封するのに十分な葉巻を使用してください。余分なものは、翌日にカミソリの刃で取り除くことができます。SILガードを一晩中セットして、スライドをイメージングします。

標準的なガラス顕微鏡と同じサイズにカットされたステンレス製の長方形を使用しています 中央に1.5センチの穴が開けられたスライド。22mm四方のカバースリップがスチール製の長方形にシルガードで貼り付けられています。注入スライドとイメージングスライドはどちらも再利用可能で、使用の合間に70%エタノールで洗浄し、その後、胚を注入する前に水ですすい

DNAを1ミリリットルあたり10〜50マイクログラムの最終濃度に希釈します。水中の0.2%フェニル赤のDNA。フェニルレッドは、注入中の可視化を可能にします。

次に、針を充填してキャリブレーションします。アポール毛細血管針を約マイクロリットルのDNA溶液で埋め戻します。針がいっぱいになるのを待ってから、細い鉗子を使用して注射装置の針ホルダーに挿入します。

先端の開口部の直径が約10マイクロメートルになるように、先端を針から切り離します。鉱物油中の液滴の直径を眼球マイクロメーターで測定します。注入量を計算するには、ピコスプリッツァーの持続時間設定を調整します。

したがって、液滴の直径は0.12マイクロメートルまたは体積で約1ナノリットルです。通常、10 ミリ秒から 30 ミリ秒の期間が一般的です。E 3つの胚培地で1つの細胞期の胚を収集し、約30〜60個の胚を注入スライドに移します。

胚をトップスライドの端に沿って配置し、E3の大部分を取り除き、曲げた解剖ピンで表面張力によって胚がスライドに固定されるようにします。細胞が注入スライドの壁に接するように胚を回転させます。マイクロマニピュレーターを使用して、針を胚のコリオンを通して卵黄を通って胚の単一細胞に導きます。

0.5〜1ナノリットルのDNA溶液を細胞に注入します。注入した胚をE3のシャーレに移し、摂氏28.5度のインキュベーターに入れます。必要に応じて、注入の翌日に胚を低温でインキュベートすることにより、発生を遅らせることができます。

胚がイメージングのために所望の年齢に達する約1時間前に、イメージングのために胚を準備します。細い鉗子で胚からCORを取り除きます。通常、受精後約14〜17時間で胚のイメージングを開始します。

次に、蛍光機能を備えた解剖顕微鏡を使用して細胞を標識した胚を選択し、長い作動距離と高倍率の組み合わせにより、Nikon A Z 100スコープでForex対物レンズを使用します。胚を約50マイクロリットルのV3が入ったマイクロフージチューブに入れます。トリカストックと溶融した1%低融点アグロスを加え、幅の広いボルグガラスピペットを使用して最終濃度0.02%トリカにします。

アロスが硬化する前に、アグロドロップ中の胚をイメージングスライドのカバースリップに直ちに移し、標識された細胞の領域が下部カバースリップに対して下を向くように胚を配置します。次に、イメージングチャンバーを組み立てます。プラスチックリングの片面にシリコンバキュームグリースを塗布し、金属イメージングに貼り付けます。

リングの反対側をグリースでスライドコーティングします。10ミリモルのヒープを含むEスリーでチャンバーを満たし、0.02%トリカは、リングの上部にグリースを塗った表面に22ミリメートル四方のカバースリップを固定することにより、チャンバーの上部を密封しました。これで、胚は、次のセクションに示すように、4Dイメージングの準備が整いました。

画像取得の詳細は、顕微鏡システムの詳細によって異なります。ここでは、オリンパスのFB 1000共焦点顕微鏡のタイムラプス取得プロセスを示します。Zeiss LSM five 10共焦点システムによるタイムラプス取得については、前述のJOプロトコルをご覧ください。

イメージングチャンバーを顕微鏡ステージのスライドホルダーにセットし、10倍または20倍の対物レンズを使用して胚に焦点を合わせます。透過光の下で、60倍対物レンズの開口数1.2以上に切り替え、FVソフトウェアでエピ蛍光で標識された細胞に焦点を合わせます。xyリピートをクリックして、レーザースキャンを開始します。

取得設定と画像取得制御を調整して、Zシリーズを取得するための画像を最適化します。Zackの上限と下限、およびステップサイズを設定します。画像取得制御ウィンドウの深度アイコンをオンにし、XY、Z suiteアイコンをクリックして取得を開始し、タイムラプスシリーズを取得します。

タイムスキャンの時間間隔とタイムポイント数を設定します。撮影設定ウィンドウの見出しで、画像撮影制御ウィンドウの時間アイコンをクリックし、XYZTスイートアイコンをクリックして撮影を開始します。ここでは、個々の標識細胞の代表的な動画と画像を紹介します。

個々のニューロンに標識を付けると、その軸索は他の標識細胞によって隠されることはなく、したがって、軸索と成長円錐のOD伸長がはっきりと見えます。この動画は、膜標的タグRFPで標識された感覚ニューロンを示しています。これは、視野から伸びる2つの軸索を反対方向に伸ばします。

第3の軸索は細胞体から直交して伸び、枝を形成します。同様に、個々の神経堤細胞を標識することで、細胞の運動性に関連する微細な細胞プロセスのイメージングが可能になります。ここでは、2つの神経堤細胞をメンブレンターゲットGFPで標識しています。

それらは、前方に移動する間、広範な突出活動を示します。トランスジェニック系統内の個々の細胞を標識して、集団内の隣接する細胞間の相互作用を視覚化することは、しばしば有用です。この画像は、DNAコードが注入された緑色のニューロンの背景に1つのニューロンを赤色に標識するためにDNAコードタグRFPを注入した、すべての感覚ニューロンでGFPが安定して発現する胚を示しています。

アクチンバイオセンサープローブは、細胞体と比較して、新たに形成された軸索に沿った成長円錐や動的突起のシグナルに強い効果を示します。後の段階では、成長円錐ではシグナルが強いままですが、成熟した軸索ではシグナルが著しく弱くなります。ゼブラフィッシュの胚において、個々に標識されたニューロンと神経堤細胞のライブイメージングを行う方法をお見せしました。

この手順を行うときは、DNAが毒性や細胞死を引き起こすほど高いレベルで発現していない胚を選択することが重要です。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。