Name: 分析インビボ細胞移動 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 学ぶゼブラフィス胚を用いた細胞移植とライブイメージングによるインビボ細胞移動の解析法。候補遺伝子の機能を調べ、発生生物学における細胞動態の理解を深める実験手法を習得できます。

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私たちは、優れたゼブラフィッシュの世話をしてくれたF. BouallagueとIBENS動物施設に感謝します。本書で報告された研究は、Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, grants N° SFI20111203770 and N° PJA 20131200143の支援を受けて行われました。

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<li>Johnson, H. W., Schell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+IP3+3-kinase+is+an+F-actin-bundling+protein%3A+role+in+dendritic+targeting+and+regulation+of+spine+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology.</a> Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、ライブイメージングと細胞移植を使用してキメラ胚の生成を組み合わせることにより、 インビボでの細胞遊走における候補遺伝子の役割を研究するための簡単な方法を提示します。 モザイク胚の作成細胞のダイナミクスを研究することは、細胞質拡張を分析するために、その輪郭の可視化が必要となります。良好な視覚的なコントラストを提供し、環境 - または異なって標識された - これは、そうでなければ、非標識で単離された細胞を標識することによって達成することができます。 確率的に胚における細胞の一部を標識する簡単な方法は、1細胞期16でプラスミドDNAを注入することです。注入されたプラスミドは、ランダムかつ不均等に細胞分裂中の細胞に分離される凝集体を形成します。これは、セルのランダムなサブセットにおけるプラスミドの発現をもたらし、従ってMOを生成するために非常に速く、簡単で非侵襲的方法を表しますSAIC胚。しかし、注入されたプラスミドを発現...

多細胞生物において、細胞遊走は、組織や器官への細胞の組織化を確実に胚の発達のために、それが組織の恒常性（創傷治癒）および免疫性に関与する成人用の両方に必須です。これらの生理学的な機能に加えて、細胞遊走はまた、特に、癌転移を含む多様な病的状態に関与しています。 細胞遊走は、平坦な表面上での細胞の移動を確保する分子機構の全体的な理解を提供する、数十年にわたってインビトロで分析された。 インビボではしかしながら、細胞は、より複雑な環境に直面しています。明らかに、移行を誘導する細胞や分泌ケモカイン隣接、そのような細胞外マトリックスとして生体内移行が外部の合図によって影響され得ることは、過去数年に登場し、その記載されているものと異なる場合があり、細胞移動を駆動機構&lt;em&gt;のin vitroで1,2。 生体内の細胞遊走に確保するメカニズムは、in vitro試験に比べて、主に増加した技術的な困難のため、これまであまり注目されてきた。特に、細胞遊走のインビボ分析遊走細胞への直接的な光アクセスを必要とする、でユニークな細胞を標識するためのテクニックその原動力と形態、ならびにゲインまたは機能の損失を見るためには、候補遺伝子の役割をテストするために近づきます。これまでのところ、これらの特性を保有するだけ少数のモデル系は、 インビボ細胞遊走3 に切開するために使用されています。 我々は最近、 生体内の細胞遊走4,5 に制御する際に候補遺伝子の機能を評価するために、新しい便利なモデルシステムとして初期のゼブラフィッシュの胚に前向き脊索前板の移行を使用していました。 （また、前方の中内として知られている）前向き脊索前板はGASTの開始時に形成する細胞群であります胚の背側にrulation。原腸形成時に、このグループをまとめ脊索前板、中内胚葉の肥厚、脊索に前方、および神経板の下にあるを形成するために、胚6-8の動物極に向かって移動します。その後部の可能性が高い中胚葉9を頭に貢献しながら、脊索前板の前方部分は、孵化腺を生じさせます。外部開発及び魚類胚の光学的透明度のおかげで、細胞遊走を直接かつ容易にこの構造では観察することができます。 細胞移植は、モザイク胚10を迅速かつ簡単に作成できます非常に強力なテクニックです。単離された細胞を標識に移植された細胞の結果で蛍光細胞骨格マーカーを発現する、の形態とダイナミクスを容易に観察することができます。機能の喪失またはゲインにこれ​​をアプローチ組み合わせることにより、缶の細胞自律的な機能の分析を可能にしますdidate遺伝子。 提示されたプロトコルは、我々は生体内 5 に細胞遊走およびアクチンダイナミクスを制御する際にTORC2コンポーネントSIN1の機能を評価する方法について説明します。しかし、結果に記載し、さらに説明するように、 インビボでの細胞遊走を制御する任意の候補遺伝子の潜在的な含意を分析するために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>ガラスキャピラリー(外径1.0mm、内径0.58&nbsp;mm)</td><td>ハーバード装置</td><td>300085</td><td>標準厚さ</td></tr><tr><td>ガラス毛細血管(外径1.0mm、内径0.78mm)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>300085</td><td>thin-walled</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333 10</td><td>&nbsp;000&nbsp;単位 ペニシリン と 10&nbsp;mlの細いピンセットのmgストレプトマイシン</td></tr><tr><td></td><td>Dumontのファインサイエンスツール</td><td>11254-20</td><td>5F</td></tr><tr><td>ガラス底皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>空気transjector</td><td>Eppendorf</td><td>5246</td><td></td></tr><tr><td>Micro-forge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator(注入用)</td><td>成重</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター(細胞移植用)</td><td>ライカ</td><td>ライカ マイクロマニピュレーター</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトン シリンジ</td><td>成重</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>デビッド・コップフ インスツルメン</td><td>ツ モデル720</td><td></td></tr><tr><td>移植型</td><td>アダパティブ・サイエンス・ツール</td><td>PT-1</td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>ナリシゲ</td><td>HI-7</td><td></td></tr><tr><td>チューブコネクタ</td><td>ナリシゲ</td><td>CI-1</td><td></td></tr><tr><td>PTFEチューブ</td><td>ナリシゲ</td><td>CT-1</td><td></td></tr></tbody></table>

分析<em&gt;インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して&gt;細胞移動

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

細胞移動は、癌の転移を含む多くの生理学的および病理学的状態の鍵となります。細胞遊走の細胞および分子基盤は、in vitroで徹底的に分析されています。 しかし、in vivo細胞遊走はin vitro遊走とは何らかの形で異なり、直接観察や操作が容易ではなく、解析がより困難であることが証明されています。このプロトコルでは、初期のゼブラフィッシュ胚における将来の脊索前板の遊走をモデルシステムとして使用し、細胞遊走における候補遺伝子の機能を研究します。前脊索板前駆細胞は細胞群を形成し、原腸陥入中に、胚オーガナイザーから胚の動物極への指向性移動を受けます。提案されたプロトコルは、細胞移植を使用してモザイク胚を作成します。これにより、良好なイメージングの鍵となる単離細胞の標識と、観察された細胞への機能効果の獲得/喪失を制限するという複合的な利点が提供され、したがって細胞の自律的な効果が確保されます。ここでは、細胞遊走におけるTORC2成分Sin1の機能をどのように評価したかを説明しますが、このプロトコルは、in vivoでの細胞遊走を制御する任意の候補遺伝子の機能を分析するために使用できます。

提示された技術は、 インビボ細胞遊走に制御する際に、SIN1、Torの錯体2（TORC2）のコア要素の1つの役割を分析するために使用しました。細胞移植の使用は、単離された細胞と細胞自律的効果の分析の標識化を可能にします。映画S1は、移植脊索前板前駆細胞の遊走を示しています。 ABP140とアクチン標識がアクチン豊富な細胞質突起の容易な可視化を可能にします。私たちは、その頻度と向きを測定しました。野生型細胞は、移動の方向（ 図3B）、 すなわち動物極の方向に配向頻繁な大きな細胞質突起を生成します。 SIN1の機能の喪失は、アクチンリッチ突起の形成を制御するSIN1の重要性を実証し、残りの大幅な突起の数の減少、およびランダム化につながります。興味深いことに、この表現型は、電子によって救出することができますRac1の15の構成的に活性な形のXPRESSIONは、強くTORC2はRac1の（ 図3B）を介してアクチン動態...

細胞移植、細胞骨格標識、機能喪失/獲得アプローチを組み合わせて、このプロトコルは、移動するゼブラフィッシュの有望な脊索前板を使用して、in vivo細胞移動における候補遺伝子の機能を分析する方法を説明しています。

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

この手順の全体的な目的は、ゼブラフィッシュ胚における細胞移植とライブイメージングを組み合わせ、生体内（in vivo）の細胞遊走を制御する候補遺伝子の機能を解析することです。この手法は、生体内細胞遊走における新規候補遺伝子の役割や重要性を決定するなど、細胞遊走分野における重要な課題の解決に役立ちます。本技術の主な利点は、モザイク胚を作製できることであり、これにより良好なイメージングと細胞の追跡が可能になります。細胞移植用針を調製するために、マイクロピペットプラーを用いてガラスキャピラリーを延伸させます。次に、マイクロフォージを用いて、内径が 35 micrometers になる位置で針の先端を切断します。マイクログラインダーを使用し、キャピラリーの切断端を 45 度の角度で面取りします。ガラス残渣を除去するために、針をシリンジに取り付けたニードルホルダーに挿入し、2% フッ化水素酸を用いて、溶液を吸い込み、排出することを3回繰り返して針内部を洗浄します。続いて、アセトンで針を3回洗浄します。注入または細胞移植用のディッシュを準備するために、0.5 g のアガロースを含む胚培地 50 mL を電子レンジの強モードで1分間加熱し、1% アガロース溶液を調製します。アガロースゲルを約60 °Cまで冷却し、全量を90 mmのペトリ皿に注ぎます。注入用のラインまたは細胞移植用のウェルを作成するために、モールドを挿入します。アガロースゲルが凝固したら、ピンセットでモールドを取り除きます。ドナー胚を注射するため、実体顕微鏡下でピンセットを用い、回収したトランスジェニック胚を胚培養液で満たした注射用ディッシュのライン上にそっと並べます。ピンセットで胚の細胞側が上を向くように向きを調整し、胚が4細胞期に達するまでディッシュを28 °Cでインキュベートします。次に、mcherryを結合させた酵母アクチン結合タンパク質140のアクチン結合ドメインを含む、調製済みの注射溶液2 µLを注射針に充填します。次に、マイクロマニピュレーターに取り付けられ、エアトランスジェクターに接続されたニードルホルダーにニードルを装着します。微細ピンセットでニードルの先端に軽く触れるか、末端を挟んでニードルを開きます。その後、4つの細胞のうち1つにニードルを刺入し、細胞体積の70%が満たされるまで溶液を注入します。同様の方法で30個の胚に注入します。胚が球状期に達したら、プラスチック製のパスツールピペットを使用して、ホストとなるtransgenic goosecoid GFP胚と、先に注入したドナー胚を、1 mmのアガロースでコーティングし、Pen/Strep配合の胚培地を満たした別々の35 mmシャーレに転移させます。精密ピンセットを用いて、胚を卵膜から手作業で取り出します。その後、胚を28 °Cのインキュベーターに入れます。蛍光顕微鏡下で胚がシールド期に達したら、緑色のシールド内にABP140 mcherryを発現しているドナー胚を選択します。火炎滅菌したパスツールピペットを用いて、ホスト胚をPen/Strep含有EMで満たした細胞移植プレートのウェルの列に転移させます。次に、ドナー胚をその隣の列に配置します。次に、まつげを使用して、胚のシールドが上を向くように慎重に方向を調整します。その後、シリンジに取り付けたニードルホルダーを用い、70% ethanolを吸い込み、排出することでニードルの先端を洗浄します。空気を吸い込むことでニードルを乾燥させます。針が乾いていることを確認し、面取り部分を上に向けて、Hamiltonシリンジに接続されたニードルホルダーに挿入します。シールド間移植を行うには、移植用針をドナー胚のシールドに刺入し、ABP140 mcherryで標識された細胞を10～20個程度吸引します。この際、卵黄を吸引しないよう細心の注意を払ってください。細胞をホスト胚のシールドに移植し、すべてのホスト胚への移植が完了するまで細胞転移を繰り返します。移植が完了したら、火炎研磨したパスツールピペットを使用して、損傷した胚を取り除いてください。移植した胚を28°Cで約30分間インキュベートし、回復させます。前述の手順に従い胚の脱膜を行った後、単一の前脊索板前駆細胞を移植します。火炎研磨したパスツールピペットを用いて、ドナー胚3つをPen/Strep添加カルシウムフリーリンガー液を満たした細胞移植用ディッシュに移動させます。微細ピンセットを用い、各胚からABP140 mcherryラベル細胞が注入された外植片を切り出し、胚の残りの部分は速やかに廃棄します。まつ毛を用いて、細胞が解離するまで外植片を穏やかに撹拌します。次に、移植用ニードルで単一の孤立した細胞を吸い上げ、ビデオの前半で示したようにホスト胚のシールドに移植します。吸引と移植を最適に制御するため、空気と水の境界線はニードルの先端から約20 centimetersに維持してください。胚を固定するには、ガラス底バイアルにEMで調製した1 millimeterの熱い0.2% agaroseを満たします。このバイアルをヒートブロックに入れ、42 degrees Celsiusに保持します。選択した胚をアガロース溶液に移し、ピペット内の余分な胚培養液を除去します。次に、アガロースと共に胚をピペットで吸い込み、あらかじめ準備しておいたイメージングチャンバーにアガロースの一滴と共に移します。アガロースが凝固する前に、アイラッシュを使用して胚の向きを調整し、正立顕微鏡で観察する場合は前前索板側を上に、倒立顕微鏡で観察する場合はガラス底側に配置します。室温によりますが、アガロースゲルが固まるまで胚を方向付けする時間は約40秒です。非常に壊れやすい卵黄ではなく、胚盤を操作して迅速に胚の方向を調整してください。すべての胚を固定し、アガロースが固まった後、胚の乾燥を防ぐため、チャンバーをPen/Strep EMで満たしてください。テキストプロトコルに従って、生細胞イメージングおよび細胞ダイナミクス実験を実施します。このビデオで実演した手法は、in vivoにおける細胞遊走の制御におけるTOR複合体2のコアコンポーネントの一つであるSin1の役割を解析するために用いられました。この動画では、移植した前索板前駆細胞の遊走を示しています。アクチン標識により、アクチンが豊富な細胞質突出を可視化することができます。頻度と方向性の解析を通じて、野生型細胞は、動物極および移動方向に向けて、大きな細胞質突出を頻繁に形成することが観察されました。本図に示されているように、Sin1の機能喪失は、突出数の劇的な減少と残存する突出の無作為化をもたらし、アクチン豊富な突出の形成制御におけるSin1の重要性が示されました。興味深いことに、Sin1の表現型は構成的活性型Rac1の発現によって回復させることができ、このことはTOR C2がRac1を介してアクチンダイナミクスと細胞突起の形成を制御していることを強く示唆しています。この手法は、細胞遊走におけるARP2/3複合体の抑制因子であるarpinの役割を解析するためにも用いられました。ここで示されているように、arpinの機能喪失は、突起形成の頻度増加、あるいは突起の安定性の向上により、突起形成頻度の増加をもたらします。arpinが存在しない状態で突出部の寿命を測定したところ、突出部の時間的持続性が2倍になり、安定性が向上していることが明らかになりました。習熟すれば、約30個の胚の移植を45分で行うことができます。この手順を行う際は、すべてのステップにおいてタイミングが非常に重要なため、胚の発育状況を常に注意深く観察することが重要です。この手順に続き、生細胞共焦点顕微鏡などの他の手法を用いることで、より詳細なイメージングが可能となり、細胞骨格要素、極性マーカー、接着タンパク質、またはその他の細胞構成成分の細胞内組織に関する疑問を解決することができます。このビデオを視聴することで、前索板前駆細胞の移植を用いて、in vivoにおける細胞遊走における任意の候補遺伝子の役割を解析する方法について、十分に理解できたはずです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

ゼブラフィッシュ細胞移植は、組織特異的キメラを生成するために遺伝学と発生学の組み合わせを可能にします。このビデオでは、原腸胚の研究室では前脳の交連形成時のアストログリア集団と特定の指導の手がかりの役割を調査することを許可している細胞移植を段階を示しています。...

組織標的胚キメラ：ゼブラフィッシュの原腸胚細胞移植

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の生体内で個々の神経細胞や神経堤細胞のイメージングを説明します。このメソッドは、蛍光共焦点タイムラプス顕微鏡を使用して細胞の行動とアクチンの局在を調べるために使用されます。...

細胞運動やゼブラフィッシュ胚における個々の神経細胞と神経堤細胞のアクチン細胞骨格のライブイメージング

このビデオでは、トランスジェニックゼブラフィッシュ胚の周辺領域への乳がん細胞送達のためのマイクロインジェクション方法を説明しています。インキュベーション後、蛍光顕微鏡で胚を可視化し、がん細胞の浸潤、播種、転移を観察します。...

zPDX-侵襲性の解析:ゼブラフィッシュ胚異種移植片における転移性がん細胞の侵襲性挙動の調査

出典:Williams, A. L., et al.リアルタイムで発生を視覚化する多光子タイムラプスイメージング:ゼブラフィッシュ胚の移動する神経堤細胞の可視化。J. Vis. Exp.

マルチフォトンタイムラプスイメージングによるゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞遊走の可視化

有糸分裂はすべての生物にとって重要であり、欠陥はしばしば癌や発達障害を引き起こします。このイメージングプロトコルとゼブラフィッシュをモデルシステムとして使用することで、研究者は生きた脊椎動物の有糸分裂と、有糸分裂プロセスに欠陥がある場合に生じる多数の欠陥を視覚化することができます。...

ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂とダイナミクスを観察します

ここでは、侵襲的な行動を調査し、それぞれ、ヒト乳癌細胞の脈管内および血管外漏出の可能性を評価するために、二つの異なる注射部位、 すなわち、卵黄周囲のスペースとキュビエのダクトを使用して異種移植ゼブラフィッシュモデルを記述します。...

胚ゼブラフィッシュにおけるヒト乳癌細胞の浸潤挙動

明確な遺伝的背景における個々のWT網膜前駆細胞のライブトラッキングは、神経発生時の細胞非自律的なシグナル伝達の寄与を評価することができます。ここでは、胚移植を介して、およびin vivoタイムラプス共焦点イメージングにおける遺伝子ノックダウン、キメラ世代の組み合わせは、この目的のために利用しました。...

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

長い波長多光子蛍光励起顕微鏡レーザーの高度な光学技術の組み合わせは、Tg (sox10:EGFP) および Tg (foxd3:GFP)...

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプス イメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

透明ゼブラフィッシュ胚の卵黄への異種移植のプロトコルについて、シンプルで迅速な病期分類法によって最適化されています。注射後の解析には、生存率と、フローサイトメトリーによる異種移植細胞の疾患負荷の評価が含まれます。...

透明ゼブラフィッシュ胚における腫瘍異種移植解析のための簡便、迅速、効果的な方法

私たちは、高速走査型共焦点顕微鏡法を利用して、発生中のゼブラフィッシュの視蓋でミクログリア細胞のライブイメージングを行い、これらの細胞のin...

ゼブラフィッシュ胚におけるミクログリア動態のライブイメージングとキャラクタリゼーション

ここでは、受精後少なくとも1〜7日の任意の段階で、ゼブラフィッシュの胚と幼虫に高い空間的および時間的解像度で細胞を移植するためのプロトコルを紹介します。...

ゼブラフィッシュの胚および幼生における高分解能細胞移植

学ぶゼブラフィス胚を用いた細胞移植とライブイメージングによるインビボ細胞移動の解析法。候補遺伝子の機能を調べ、発生生物学における細胞動態の理解を深める実験手法を習得できます。

分析

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