分析インビボ細胞移動

この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュ胚における細胞移植とライブイメージングを組み合わせて、in vivo細胞移動を制御する候補遺伝子の機能を分析することです。この方法は、in vivo細胞遊走における新しい候補遺伝子の役割と重要性を決定するなど、細胞遊走分野における重要な問題に対処するのに役立ちます。この技術の主な利点は、良好なイメージングと細胞腺筋症を可能にするモザイク胚を作成することです。

細胞移植針を準備するには、マイクロピペットプーラーを使用してガラス製のキャピラリーを引っ張ります。次に、マイクロフォージで、内径が35マイクロメートルの点で針の先端を切断します。マイクログラインダーを使用して、キャピラリーの切断端を45度の角度で面取りします。

ガラス残渣を除去するには、シリンジに取り付けられたニードルホルダーに針を挿入し、2%フッ化水素酸を使用して、溶液を出し入れして針の内側を3回すすぎます。続いて、針をアセトンで3回すすいでください。注射または細胞移植用の皿を準備するには、0.5グラムのアガロースを含む50ミリリットルの胚培地を電子レンジで1分間フルパワーで加熱することにより、1%アガロースを調製します。

アガロースゲルを約60°Cに冷却し、全量を90mmのペトリ皿に注ぎます。金型を挿入して、注入用のラインを作成したり、細胞移植用のウェルを作成したりします。アガロースゲルをセットしたら、鉗子を使用してカビを取り除きます。

ドナー胚を注入するには、実体顕微鏡で鉗子を使用して、収集したトランスジェニック胚を胚培地で満たされた注射皿のラインに優しく絞ります。鉗子を使用して、細胞を上に向けて胚を向け、次に胚が4細胞段階に達するまで摂氏28度で皿をインキュベートします。次に、mcherryに結合した酵母アクチン結合タンパク質140のアクチン結合ドメインを含む予め調製した注射液の2マイクロリットルを注射針にロードする。

次に、マイクロマニピュレーターに取り付けられ、エアトランスジェクターに接続されたニードルホルダーに針を挿入します。細い鉗子を使用して針の先端にそっと触れるか、先端をつまんで針を開きます。次に、針を4つの細胞のいずれかに挿入し、溶液を注入して細胞体積の70%を満たします。

同様の方法で30個の胚を注入します。胚が球体段階に達したら、プラスチック製の牧草ピペットを使用して、宿主のトランスジェニック粘液質GFP胚と以前に注入したドナー胚を別々の35ミリメートルペトリ皿に移し、胚培地に1ミリメートルのアガロースでコーティングし、ペン/連鎖球菌胚培地で満たします。細いピンセットを使用して、絨毛膜から胚を手動で抽出します。

次に、胚を摂氏28度のインキュベーターに入れます。胚が蛍光顕微鏡でシールド段階に達したら、緑色のシールド内でABP140 mcherryを発現するドナー胚を選択します。ファイヤーポリッシュされた牧草地ピペットを使用して、ペン/連鎖球菌EMで満たされた細胞移植皿のウェルの列に宿主胚を移します。次に、ドナー胚を隣接する列に置きます。

次に、まつげで、シールドを上にして胚の向きを慎重に合わせます。次に、シリンジに取り付けられたニードルホルダーを使用して、70%エタノールを吸い込み、排出して針の先端をすすぎます。針に空気を吸い込んで針を乾かします。

針が乾いたら、斜角を上に向けてハミルトンシリンジに接続された針ホルダーに挿入します。シールドtoシールド移植を行うには、移植針でドナー胚のシールドに入り、ABP140マッチェリーで標識された細胞を約10〜20個引き出します。卵黄を引かないように注意してください。

細胞を宿主胚のシールドに移植し、すべての宿主胚が移植されるまで細胞移植を繰り返します。移植が完了したら、火で磨いた牧草地ピペットを使用して、損傷した胚を取り出します。移植した胚を摂氏28度で約30分間インキュベートし、回復させます。

前に示したように、胚を解体した後に単一の前脊索板前駆細胞を移植するには、火で磨いた牧草地ピペットを使用して、3つのドナー胚をPen/Strepカルシウム遊離リンガーで満たされた細胞移植皿に移します。各胚の細かいピンセットを使用して、注入されたABP140 mcherry標識細胞を含む外植片を解剖し、残りの胚を迅速に廃棄します。まつげを使用して、細胞が解離するまで外植片を穏やかにかき混ぜます。

次に、移植針に単離された単一の細胞を描き、ビデオの前半で示したように、宿主胚のシールドに移植します。吸引と移植を最適に制御するために、針の端から約20センチメートルの空気/水の分離を保ちます。胚をマウントするには、ガラス底のバイアルにEM中の1ミリメートルの高温の0.2%アガロースを入れます。バイアルを摂氏42度に保温し、ヒートブロックに入れます。

選択した胚をアガロース溶液に移し、余分な胚培地をピペットから廃棄します。次に、胚をアガロースでピペットに引き込み、アガロースの滴と共に事前に準備したイメージングチャンバーに移します。アガロースをセットする前に、直立顕微鏡でイメージングする場合はパースペクティブプレコードプレートを上向きに、倒立顕微鏡でイメージングする場合はガラス底部にパースペクティブを配置して、まつげを使用して胚の向きを調整します。

室温にもよりますが、アガロースゲルが固まる前に胚の向きを変えるのに約40秒かかります。非常に壊れやすい卵黄ではなく、胚盤葉を操作することにより、胚を迅速に方向付けます。すべての胚をマウントし、アガロースをセットした後、ペン/連鎖球菌感染症を使用してチャンバーを満たし、胚が乾燥するのを防ぎます。

テキストプロトコルに従って、ライブセルイメージングと細胞ダイナミクスの実験を実施します。このビデオで紹介した手法は、in vivo細胞遊走の制御におけるTOR複合体2のコアコンポーネントの1つであるSin1の役割を分析するために使用されました。移植した前索板前駆細胞の遊走を撮影した動画です。

アクチン標識により、アクチンに富む細胞質突起を可視化することができます。頻度と向きの分析を通じて、野生型細胞は、動物の極の方向と移動の方向に向けられた大きな細胞質突起を頻繁に生成することが観察されました。この図に見られるように、Sin1の機能喪失は突起数の激減と残りの突起のランダム化につながり、アクチンリッチな突起形成を制御する上でのSin1の重要性を示しています。

興味深いことに、Sin1の表現型は、恒常的に活性なRac1の発現によって救われる可能性があり、TOR C2がRac1を介してアクチンダイナミクスと細胞突出形成を制御していることを強く示唆しています。この手法は、細胞遊走におけるARP2/3複合体の阻害剤であるアルピンの役割の解析にも使用されました。このように、アルピンの機能が失われると、突起形成の頻度が高まるか、突起安定性が増すため、突起周波数が増加します。

アルピンがない場合の突起寿命の測定では、突起の時間的持続性が2倍になり、安定性が向上したことが明らかになりました。一度マスターすれば、約30個の胚の移植を45分で行うことができます。この手順を試みるときは、すべてのステップが重要なタイミングで行われるため、胚の発達に注意することが重要です。

この手順に続いて、ライブ共焦点顕微鏡などの他の方法を実行して、より優れたイメージングを提供し、細胞質要素、極性マーカー、付加タンパク質、またはその他の細胞成分のサブセル組織に関する問題に対処できます。このビデオを見れば、in vivo細胞遊走における候補遺伝子の役割を解析するために、前脊索板前駆細胞の移植をどのように使用するかについて十分に理解できるはずです。