Name: ナノ流体技術を用いた単一およびバルク C.エレガンス サンプルにおける高スループット定量RT-PCR (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 学ぶナノ流体技術を用いた高スループット定量RT-PCR法で、C. elegansの単一およびバルクサンプルからRNA抽出不要で遺伝子発現を迅速に解析する方法です。2日間で9,000以上のデータ取得が可能です。

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シャーリーン・マードックとバブラハム研究所の支援に感謝します。JLPはウェルカムトラスト(093970/Z/10/Z)によってサポートされ、OCはERC 638426とBBSRC[BBS/ E/ B000C0426]によってサポートされています。

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著者らは開示するものは何もない。

本論文では、ワーム-to-CTプロトコルは、単一ワームまたは小さなワームプールからRNAを抽出するための迅速かつ効率的な方法であることが示されている。ナノ流体システムによって提供されるハイスループットは、個人間変動測定の定量化に最適です。さらに、この方法の高感度により、単一ワームRNA-seq技術9を用いた場合の検出以下に下がる低レベルで発現した遺伝子の検出が可能となる。
単一ワームからcDNAを準備する方法の選択を検討する場合。Ly et al.29は、プロテクチクル消化のためにプロテナーゼKに依存するプロトコルを最適化した。キューティクルは、ワームからの分子の分離のための主要なハードルであり、プロテアーゼKはそれを壊す効果的な方法を提供します。しかし、リテナーゼKは、逆転写に酵素を使用できるように熱不活性化する必要があります。Lyらは96°Cに10分曝露を用いたが、RNAは容易に分解性であるため、このステップはこのプロトコルでは回避された。プロテナーゼKを使用する代わりに、キューティクルを壊すために繰り返し凍結融解サイクルを使用した。凍結融解は、ワームごとにより多くのRNAを単離することができるので、キューティクルを壊す効果的な方法です。Ly et al. 報告では、1ワーム当たり全RNAはプロテナーゼKを用いて35ngであり、このプロトコルはワーム当たりのRNA全体の51.75 ng±6.74 SEMを得る。熱暴露の回避と予備化ステップは、標準的なプロトコルと比較してワームからCTへのダイナミックな検出範囲を広げるようです。Ly et al. hsp-16.2の場合は 21.1 ± 0.15、ヒートショック後のhsp-70の場合は 0.17 ± 22.8 の絶対Ct値を報告する。同じ熱衝撃条件(30°Cで1h)を使用して、このプロトコルはhsp-16.2の場合は0.57±17.93±、hsp-70の場合は21.13±0.33の絶対Ct値を取得します。 これは、凍結融解法がより高いRNAの収率を提供し、低発現転写物に対してより適切であることを示している。
ナノ流体システムは、特定のターゲットトランスクリプトのセットを調査し、より小さい(マルチアレイチップ)またはより大きな(シングルアレイチップ)数のサンプルを使用して実験の規模に適応させる場合に理想的です。単一のワームで発現されるすべての転写物の公平な画像を得るために、明らかな選択はRNAシーケンシングを使用することです。しかし、実験の焦点が小さいがまだ比較的大きな標的遺伝子セットである場合、研究者がナノ流体PCRマシンにアクセスできれば、このプロトコルを利用する方が費用対効果が高い。ナノ流体系試薬とシングルアレイチップのコストはワームあたり約£13と見積もられていますが、シングルワームシーケンシングの試薬のコストは、シーケンシングコストを含まないワームあたり約£60になります。
使用するPCRプラットフォームを検討する場合、ワーム-to-CT法をナノ流体qPCRに結合すると、時間とスループットに関して利点があります。9,216 RT-qPCRの結果は約2日間の作業で得ることができますが、標準的なqPCRプラットフォームを使用して同じ数のターゲットの増幅は、1日に4プレートを実行し、96ウェルプレートアッセイを使用して約5作業週間かかります。ただし、テスト対象の数が少ない場合は、標準の qPCR マシンと組み合わせた Worm-to-CT を使用する方がコスト効率が高くなります。シングルアレイチップは再実行できないため、空の井戸を実行するとコスト効率が低下します。
この方法の1つの制限は、多重工程中のプライマー-プライマーダイマーの形成の可能性であるが、これは1%未満の場合に起こる。ワーム対CTプロトコルは効率的であり、単一のワームに適用すると信頼性の高い結果を提供しますが、収穫工程中にワームがキャップまたはチューブの上部に閉じ込められたままの場合に対応する可能性が高い、約5%の故障率があります。
この多目的で信頼性の高い方法を組み合わせることで、より標準的な技術に比べてスループットと感度が向上します。この方法は、高スループットスクリーンの検証に非常に有用であり、単一ワーム遺伝子発現レベルを監視または検証するのに最適です。この方法は、単離組織からの遺伝子発現量などの他の困難な手法に適用することができます。例えば、腸、生殖腺、FACsによって単離された細胞などの完全な組織の単離は、RNAシーケンシング実験を行うのに十分な材料を提供する。しかし、限られた量の材料は、多くの場合、まれなトランスクリプトの定量を排除する重複読み取りにつながります。このシナリオでは、ナノ流体工学ベースの技術を使用すると、実験に対する感度を高め、研究者がそれらの組織または細胞内のすべてのトランスクリプトのサブセットのみを監視する必要がある場合は、コスト効率を高める必要があります。

単一細胞RNAシーケンシングおよびqPCRの最適化により、転写パルスまたはバーストが細胞当たりのRNA分子数に大きなばらつきを生じさせる可能性が明らかになった。さらに、これらの技術は、標準的なバルクトランスクリプト法測定によって以前に見逃された実質的な細胞異質性を明らかにした。文脈に応じて、いくつかの単細胞転写変動は、組織の混合細胞組成によって引き起こされる。しかし、同じ環境下で増殖した等元性細胞集団においても、転写ヘテロジニティ2,3が広く存在する。この「生物学的変動」は、細菌から人間まで、細胞ネットワークのユビキタスな特性としてますます同定されています。いくつかのケースでは、開発、癌の進行、HIVの遅延、および化学療法4、5への応答に触れ合った結果を持つことができます。
線虫カエノハブディティスエレガンスは、個人間の生物学的変動の原因と結果を研究するための理想的な特徴を持つユニークなモデル生物です。これらの線虫は959細胞からなる単純なモデル生物であり、その透明なキューティクルは、インビボイメージング研究6に適している。C.エレガンスは主に自己受精を通して繁殖する雌雄同体の種である。これは、等原性の実験室株をもたらした。等原性および制御された培養条件にもかかわらず、多くの形質および転写物は、個体間で可変であり、確率的または微小環境的な違いが、個体間の不均一性に寄与することを示唆する。遺伝子発現におけるこのような変動は、突然変異の浸透の変動、生存、発達タイミング、および胎児性7、8、9を含む複数のフィットネスの結果を有する。これらの特徴により、単一ワーム研究は生物全体の生物学的変動を研究する前例のない機会を提供する。
この分野では、単一ワームレベルでのトランスクリプトの正確な検出のための技術を開発し最適化することが必要です。単一ワームRNAシーケンシング10、単離組織11からのRNAシーケンシング、単一細胞シーケンシング12などの新しい技術がC.エレガンスに利用可能になりました。しかし、主な課題は依然として残っている:相互性を監視する場合、弱く発現した遺伝子はしばしば検出可能なレベル13を下回る。これは、少量の出発物質から分離された稀な転写物に特に関連し、平均発現と技術的差異との間に確立された逆の関係があり、しばしば希少なトランスクリプトが統計的カットオフ13を下回る原因となる。ハイスループット多重qPCR技術の最適化は、哺乳類の単細胞研究に有用であることが証明されており、特に希少転写物14,15の発現を研究する場合である。このテクノロジは、他の単一ワーム テクノロジのベンチマークおよび検証の目的にも使用できます。
ワームからCTは、単一ワームcDNA調製のために、細胞生物学の研究で使用されるキットから適応された高速で堅牢な方法です。この方法と組み合わせたcDNAを多重化したナノ流体qPCR技術と結合させたのは、より高い実験スループット、より広いダイナミックレンジの検出を提供し、単細胞目的14,15のために検証されたからである。また、この cDNA 調製は、標準 PCR 技術での使用にも適用できます。スループットは2つの方法で増加します:まず、cDNA調製は、従来のグアニジウム・チオシアネート・フェノール-クロロホルム抽出よりも速く、信頼性が高く、ワームはリシスバッファーに直接添加され、容易に分解可能なRNAの直接単離をスキップします。第2に、ナノ流体技術を活用することで、同時に実行できるサンプルとターゲットの数が大幅に増加します。本稿では、シングル・アレイ・チップとマルチアレイ・チップの2つのチップを比較します。シングルアレイチップは、96個の単一ワームと96のプライマーセットを実行でき、実験ごとに9,216回の反応を得ることができます。標準の qPCR 技術を使用して同様のスループットを実現するには、96 ウェルプレートを使用して 96 個の個別の qPCR 実験が必要になります。より小型で柔軟性の高いマルチアレイチップは、6個の12 x 12アレイで構成され、864個の反応が得られます。この方法の優れた信頼性と感度は、ナノ流体技術と予備増幅工程の導入によって高められています。本論文で紹介する方法は、生物学的分散を抽出する最先端の統計アルゴリズムと共に使用することを意図している。この記事では、単一ワームとバッチワームの両方のサンプルに対する迅速な cDNA 準備と高スループット qPCR のプロトコルを紹介します。アルゴリズムは他の場所で公開されます。このプロトコルでは、実験の前に各チップの構成を準備する必要があります。表1および表2は、マルチアレイチップとシングルアレイチップに対するこれらの計画の例をそれぞれ示しています。図 1 で説明した Worm-to-CT プロトコルの概要と、図 2のマルチアレイ チップとシングル アレイ チップの実行の概要も示します。

<table><tbody><tr><td>100&マイクロ;目的の遺伝子のためのMストックプライマー。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96.96チップ用</td><td>20X DNA結合染料</td><td>Fluidigm</td><td>100-7609</td>(シングルアレイチップ)</tr><tr><td>2Xアッセイローディング試薬</td><td>Fluidigm</td><td>100-7611</td><td></td></tr><tr><td>384ウェルプレート</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8ストリップPCRチューブ96</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウェルアイスブロック</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96.96 ダイナミックアレイ IFC</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td>原稿全体で「シングルアレイチップ」として参照</td></tr>されている<tr><td>96ウェルシーリングテープ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioMark &EP1ソフトウェア</td><td>Fluidigm</td><td>101-6793</td><td>内容: Biomark HDデータ収集ソフトウェア、リアルタイムPCR解析ソフトウェア、SNPジェノタイピング解析ソフトウェア、デジタルPCR解析ソフトウェア、メルトカーブ解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>BioMarkまたはBioMark HDシステム</td><td>Fluidigm</td><td>100-2451 K1</td><td>原稿全体で「ナノ流体サーモサイクラー」として参照</td></tr>されています<tr><td>96.96およびFlexSix IFCs用コントロールライン流体キット</td> 流体<td>igm</td><td>89000021</td><td>原稿全体で「コントロールライン流体」として参照</td></tr>されています<tr><td>DNA懸濁液バッファー</td><td>TEKnova</td><td>T0021</td><td></td></tr>ドーム<tr><td>型PCRキャップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エキソヌクレアーゼI</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0293L</td><td></td></tr><tr><td>エキソヌクレアーゼI反応バッファー</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>B0293S</td><td></td></tr><tr><td>FLEXsix DELTAgene サンプル試薬</td><td>フルイディム</td><td>100-7673</td><td>原稿全体で「サンプル試薬」として参照</td></tr><tr><td>FLEXsix Gene Expression IFC</td><td>Fluidigm</td><td>100-6308</td> 原<td>稿全体で「マルチアレイチップ」として参照</td></tr><tr><td>Fluidigm Real-Time PCR Analysis ユーザーガイド</td><td>Fluidigm</td><td>68000088</td><td>これは、原稿内で参照されているプロトコルのセクション2の基礎として使用されるプロトコルです。</td></tr><tr><td>IFC Controller MX</td><td>Fluidigm</td><td>68000112 I1</td><td>原稿全体で「ナノ流体 PCR プライミングマシン」として参照</td></tr>されています<tr><td>IFC コントローラー SOFTWEAR</td><td>Fluidigm</td><td>100-2297</td> デュワー<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td>StarLab</td><td>C1301B-230V</td> <td>で IFC コントローラー MX 液体窒素を実行するために必要なすべてのソフトウェアとスクリプトが含まれていますプロトコールでPCRチューブストリップをスピンダウンするために使用されます。</td></tr><tr><td>Nuclease Free Water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プレートスピナー</td><td>Labnet</td><td>K4050725</td><td>mini plate spinner, mps 1000. プロトコルを通じて「卓上プレートスピナー」として参照される</td></tr><tr><td>Power SYBR Green Cells-to-Ct kit</td><td>invitrogen</td><td>4402955</td><td>このキットは、Worm-to-CTプロトコルの線虫での使用に適したものです。注:-20°CでDNase Iおよび20X RT酵素ミックスを停止溶液、2X SYBR RT Buffer(原稿全体でRTバッファーとして参照)、およびPower SYBR&reg;Green PCR Master Mix(原稿を通じてPCRマスターミックスとして参照)。このキットは400反応用で、40反応と100反応用のキットもあります。</td></tr><tr><td>PreAmp Master Mix</td><td>Fluidigm</td><td>100-5580, 100-5581</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Transcription Master Mix(逆転写マスターミックス)480 反応</td><td>Fluidigm</td><td>100-6299</td><td>1 つのチューブで 96 反応にも対応可能 (PN100-6298)</td></tr><tr><td>Rnase Free water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>172-5211</td> 原<td>稿全体で「蛍光プローブ スーパーミックス」として参照</td></tr>されている<tr><td>標準 96 および 384 ウェル サーマル サイクラー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE バッファー (10mM Tris), pH8.0, 1.0mM EDTA</td><td>TEKnova</td><td>T0224</td><td>原稿全体で Tris-EDTA バッファーとして参照</td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000031</td><td>本文全体で「サーマルミキサー」として参照</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15596026</td><td>プロトコルでは「グアニジウム チオシアン酸フェノール クロロホルム」として参照</td></tr>されています 温水<tr><td>浴</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ナノ流体技術を用いた単一およびバルク c.エレガンス サンプルにおける高スループット定量rt-pcr

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

本論文では、高速、堅牢、高感度の カエノハブディティス・エレガンス に対するハイスループット逆転写定量PCR(RT-qPCR)アッセイを紹介する。このプロトコルは、単一ワームまたはバルクサンプルから遺伝子発現の正確な測定を取得します。ここで示すプロトコルは、ナノ流体RT-qPCRプラットフォームに結合された相補DNA(cDNA)調製のための既存の方法の新しい適応を提供する。このプロトコルの最初の部分は「ワームからCTへ」と名付けられ、事前のmRNA分離を必要とせずに線虫から直接cDNAを産生することができます。3.5時間で96ワームからcDNAを調製することで、実験的なスループットを向上させます。プロトコルの 2 番目の部分では、既存のナノ流体技術を使用して、cDNA 上で高スループット RT-qPCR を実行します。本論文では、2つの異なるナノ流体チップ(最初のラン96サンプルと96ターゲット)を評価し、約1.5日間のベンチワークで9,216回の反応を示します。2番目のチップタイプは6つの12 x 12アレイで構成され、864個の反応が得られます。ここで、ワーム-to-CT法は、単一ワームおよびバルクサンプルからヒートショックタンパク質をコードする遺伝子のmRNAレベルを定量することによって実証される。提供されるプライマーの広範なリストは C.エレガンス ゲノム内のコード遺伝子の大部分のために処理されたRNAを増幅するように設計されている。

cDNA調製方法としてのワーム-CTの検証
ワーム対CTプロトコルが有効なcDNA抽出方法であるかどうかを試験するために、標準的なグアニジウム・チオシアネート・フェノール-クロロホルム抽出方法と比較した。結果は 図3に示されており、cDNAは標準のグアニジウム・チオシアネート・フェノール-クロロホルム抽出技術22 およびワームツーCT法を用いた30ワームから平均1,000ワームから調製された。試料を同時に熱衝撃(34°Cで30分)とした。世界的に、全RNAの 100ng当たりのhsp-70 mRNA発現レベルは、両方の方法を用いて比較可能であった。しかしながら 、hsp-70 発現が最も高い場合(すなわち、N2ではヒートショック後)発現レベルがワーム-ct法と共に高く、感度が向上したことを示す。
hsf-1(sy441)23におけるhsp発現の予想減少が予想されるかどうかを判断するために、分子シャペロン23,24の主転写調節因子における突然変異を再現することができ、短い熱ショックに続く転写シャペロン誘導を比較した。両方の方法でhsp-70誘導の減少はhsf-1(sy441)動物で検出された。これは、変異型hsf-1(sy441)動物がHSF-1のトランス活性化ドメインにおける切り捨てによるシャペロン誘導能の低下を示すため、予想された。グアニジウム・チオシアネート・フェノール-クロロホルム抽出hsp70の場合、野生型動物と比較して対照と比較して82.7%、ワームからCTに対して92.3%減少した(図3)。結果は両方の方法で比較可能であり、以前のレポート23と同等であった。これらの結果は、ワームツーCT法が標準的なcDNA合成技術に代わる有効な代替手段であることを示している。
mRNA標的の増幅に用いられるナノ流体PCRプラットフォームの検証
転写増幅のためのナノ流体qPCRを用いた結果の一貫性をテストするために、ワーム-CTバルク法から得られたPCR結果を、標準qPCRシステム(材料表)とマルチアレイチップを用いたナノ流体qPCRシステムの両方で比較した。3つの異なる遺伝子の発現の折り目変化を、野生型と比較して、dbl-1(dbl-1(nk3))25でヌルアレーレを持つ動物で、sma-3(図4A)、sma-10(図4B)、およびdnj-26を監視した。Dbl-1は、骨形態形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路の唯一のリガンドをコードする。sma-3およびsma-10は、BMPシグナル伝達カスケードの主要成分であるSMADオルソローグをコードする遺伝子である。Dnj-26は、BMPシグナル伝達の標的である分子シャペロンをコードする。これらの結果は、2つの方法の結果を比較する折り目変化にほとんどまたは全く違いを示さないため、sma-3、sma-10、およびdnj-26の場合、それぞれ有意なP値は0.3113、0.2635、および0.3481で示されない。 これらの結果は、バルクサンプルに適用されるワーム-to-CT法が、少数のワームからRNAを抽出する効率的かつ迅速な方法であり、標準PCRシステムまたは高スループットナノ流体ベースのqPCRプラットフォームと組み合わせた場合に信頼性の高いデータを提供することを示しています。
一回のワームから得られた平均を用いてバルクサンプルによって得られた発現レベルの比較
相対発現レベルは、バルクサンプル(25ワーム)から得られたcDNAまたは平均36個の単一ワームサンプルから計算した(図5)。cDNAはいずれもワームツーCT法を用いて取得し、ナノ流体PCR技術を用いて増幅した。A–C図5に観察されるように、試験されたすべてのシャペロン(すなわち、hsp16.1、F44E5.4、hsp-70)について、同等の発現レベルを検出した。 これらの結果は、単一ワームから得られたパラメータが信頼できる状態であることを示しています。
ワーム--CT結合ナノ流体技術の応用による単一ワーム遺伝子発現パラメータの推定
シングルアレイチップは、96個の個々のサンプルで最大96のターゲットトランスクリプトを監視できるため、単一ワーム間の転写表現の個々の変動を監視するのに適しています。図6Aは、短い熱ショック後の単一ワームからの複数のhsp転写物の平均発現を示す代表的な結果を示す。図に示すように、転写物の発現のばらつきは遺伝子によって大きく異なった(図6A)。さらなる洞察を得るために、変動係数(CV)を、標準偏差を式レベル26の平均で割って計算した(図6B)。CV値が以前に別の方法で推定された3つの遺伝子を監視した(未発表データ)。2つの安定した転写物(ife-1およびY45F10D.4)と1つの変数(nlp-2927)は、予想される変動性を示した。また、このグラフは、変動性値と式レベル26の間の既知の逆関係を明確に示しています(図6B)。
一括サンプルを使用する際に再現性を確保するために、技術的な複製が最も重要です。しかし、これは必ずしも単一細胞実験14、15、28の場合には当てはまらない。単一ワームサンプルを使用する場合にパラメータ推定に技術的な複製を使用する必要があるかどうかを判断するために、短い熱ショックの後に28個の個々のワームが収穫され、技術的な三重体を使用して処理されました。三重化(図7、技術CVの青い点)で得られた単一ワームデータから算出されたCV値と、個々のワームから得られたすべての転写物(図7の赤い点、生物学的変動性)について比較した。テストされたすべてのトランスクリプトについて、技術的なCVは生物学的CVよりも低く、技術的トリクセートはパラメータ推定に必要でないことを示した。技術的な複製が必要とされないという事実は、品質を損なうことなく実験のスループットを増加させます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig01.jpg"> 図 1: ワームツーCT プロトコルの概要 この図は、Worm-to-CT プロトコルを使用してワームを実行するために必要なさまざまな手順の概要を示しています。逆転写のステップでは、2 つのオプションの方法が示されています。これらは、どちらのタイプのチップでも交換可能な方法です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig02.jpg"> 図2:ナノ流体qPCRの調製と実行の概要 この図は、マルチアレイチップとシングルアレイチップを使用したナノ流体qPCRシステムの実行準備を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig03.jpg"> 図 3: バルク サンプル上のワームから CT へのプロトコルが、信頼できる結果を提供しました。 バルクサンプル上の通常のグアニジウム・チオシアネート・フェノール・クロロホルム抽出22とのワーム対CTプロトコルの比較。hsf-1(sy441)変異体23における以前の知見と一致して、熱ショックに応答したhsp転写物のレベルは低下した。上記のヒストグラムは、34°Cで30分の短い熱ショック(-)の不在時のhsp-70の誘導を示しています。 cDNAは、1,000ワーム(左)に適用されたグアニジウム・チオシアネート・フェノール・クロロホルム抽出を用いて、または30個のプールワームに適用されたワームからCTへの方法を用いて得られた(右)。各方法で得られた全RNAの100ng当たりhsp-70の発現レベルを比較した。予想通り、hsf-1(sy441)では、熱ショックに応答したhsp-70の転写誘導は、グアニジウム・チオシアネート・フェノールクロロホルムを用いて82.7%有意に減少し、ワーム-to-CT法を用いて92.3%減少した。標的遺伝子からのmRNAレベルを、3つのハウスキーピング遺伝子cdc-42、pmp-3、およびire-1の平均に対して正規化した。 各ドットは、生物学的複製を表す。データは、パラメトリック分析に必要な規則を満たさなかったため、統計分析のためにログ変換されました。統計分析は、シダックの多重比較検定を使用して、RM-One-way ANOVAを使用して行われました。ワイルドタイプ = N2, hsf-1 = hsf-1 (sy441)棒は平均の標準誤差を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig04.jpg"> 図4:発現パターンは、標準qPCRとナノ流体qPCR系の間で一貫していた。 (A)sma-3(A)、sma-10(B)またはdnj-26(C)mRNAの発現レベルは、野生型株(N2)およびdbl-1(nk3)ノックアウト株25からワーム-CTを介して生成されたcDNAの3つの生物学的複製から、通常のqPCRおよびナノ流体qPCR(マルチアレイチップ)を介して決定された。 デルタCt法21を用いて各株についてmRNA発現レベルを相対的に求めた。次に、dbl-1(nk3)ワームで得られた発現レベルをN2株の対応するmRNAレベルで割ることによって折り畳み変化を求めた。パネルAに示すように、パターンは個々の生物学的複製の両方の方法について一貫していた。(B) および (C) は、 sma-10およびdnj-26 mRNA レベルの場合は、 それぞれ (A) と同じです。標的mRNAレベルは、ハウスキーピング遺伝子cdc-42およびpmp-3に対して正規化した。統計解析は、標準qPCRを介して生成された3つの生物学的複製の結果とナノ流体qPCRを介して生成されたものを比較する対t検定を用いて、各遺伝子について計算した。これらの比較のP値は、それぞれ0.3113,0.2635,0.3481,sma-10,dnj-26であった。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig5v2.jpg"> 図 5: ワーム対 CT メソッドをバルク サンプルまたは単一ワームに対して使用すると、ワームごとに正規化された場合と同様のレベルの表現が提供されました。 (A) hsp-16.1/11、 (B) F44E5.4, および(C) hsp-70 (C12C8.1) の発現レベルを、熱ショックがない状態で若年成動物で分析した。ワームごとにデータを正規化した場合、両方の方法を使用して各トランスクリプトについてワームごとに得られるレベル間に有意な差はなかった。標的遺伝子からのmRNAレベルを、cdc-42、pmp-3、およびire-1の3つのハウスキーピング遺伝子の平均に対して正規化した。棒は平均の標準誤差を表します。統計 = ペアの t 検定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig5v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig06.jpg"> 図 6: ワームから CT への方法を使用する単一ワームの高スループット RT-qPCR は、遺伝子発現における個人間の変動を監視できます。 (A)短い熱ショック(34°Cで30分)に曝された場合に得られた53の転写物の平均発現レベル。箱ひげ図は、個々のワームからの平均mRNA発現の分布を表します(個々のワームごとに平均3つの技術的複製が使用されました)。ドットは、28 個の個別ワームの式レベルを表します。標的遺伝子からのmRNAレベルを、cdc-42、pmp-3、およびire-1の3つのハウスキーピング遺伝子の平均に対して正規化した。(B)短い熱ショックへの曝露後の53個の転写物に対する平均mRNA発現の関数としての変動係数26(CV)を、28個の個別の動物から計算した(パネルBに示す生データ)。トランスクリプトのセットには、変数nlp-29トランスクリプト27と 2 つの安定したトランスクリプト(ife-1およびY45F10D.4;未公開データ) が含まれています。CVは、平均に対する標準偏差の比率です。このCVは、個々のワーム間の転写発現における個人間変動を推定するために利用された。予想通り、平均発現レベルの低下に伴って個人間変動が拡大した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig07.jpg"> 図7:ナノ流体チップを用いた遺伝子発現の個々の変動性を解析する際に技術的複製は必要なかった。 このグラフに示されたデータは、短い熱ショック(34°Cで30分)に続く28個のワームで得られた。各赤い点は、28個のワーム(バイオCV)間でアッセイされた1つの転写物に対する平均転写発現レベルの変動係数(CV)を表す。各青い点は、1つのワームから得られた3つの技術的複製の間の発現レベルのCVを表し、トランスクリプトごとにアッセイ(技術的CV)を示す。このグラフは、技術的な変動(技術的複製間)が生物学的変動性(個々のワーム間)よりもはるかに低いことを示し、単一ワームにおける遺伝子発現をアッシングする際にナノ流体遺伝子発現アレイ上で技術的複製を行う必要がないということを示している。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig07large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表 1: マルチアレイ チップのレイアウトを計画する 上の表は、マルチアレイチップの実行を計画する際に利用できるシンプルなレイアウトを示しています。左側には、対象となるプライマー ターゲットで埋める必要があるスペースがあり、右側には目的のサンプルを埋める必要があるスペースがあります。各アッセイとサンプルアレイは、チップを介して数的にペア化されます。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_1.xlsx" target="_blank">こちらの表をダウンロードしてください。</a>
表 2: シングル・アレイ・チップのレイアウトを計画する。 上の表は、シングル・アレイ・チップの実行を計画する際に使用できるシンプルなレイアウトを示しています。左側には、対象となるプライマーターゲットで埋める必要があるスペースがあり、右側には目的のサンプルで埋める必要があるスペースがあります。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_2.xlsx" target="_blank">こちらの表をダウンロードしてください。</a>
表3:本研究で用いたRT-qPCRプライマーのリスト<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_3.xlsx" target="_blank">こちらの表をダウンロードしてください。</a>
補足表1:RT-qPCRプライマーのデータベースからのプライマー<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_S1.xlsx" target="_blank">こちらの表をダウンロードしてください。</a>

本稿では、単一またはバルク C.エレガンス サンプル中の遺伝子発現レベルの迅速かつ信頼性の高い決定のためのハイスループットプロトコルについて説明する。このプロトコルはRNAの単離を必要とせず、サンプルから直接cDNAを生成します。高スループットの多重化されたナノ流体リアルタイムqPCRプラットフォームと一緒に使用できます。

ナノ流体技術を用いた単一およびバルク C.エレガンス サンプルにおける高スループット定量RT-PCR

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...

当社のプロトコルは、RNA単離を必要とせずに、単一の1または小さなバルクサンプルから直接RT-qPCRデータを取得するためのスループットと時間効率の両方を改善しました。このプロトコルを使用すると、標準的な96ウェルqPCRを使用すると通常約5週間かかるこのプロセスを、わずか2日間のベンチワークで9,000を超えるRT-qPCR結果を得ることができます。このプロトコルは、C.elegansにおけるより迅速で堅牢かつ高感度のRT-qPCRアッセイを提供し、同質遺伝子線虫間の遺伝子発現の個体間変動のモニタリングに最適です。まず、バクテリアの芝生から新鮮な種をまいていない線虫の成長培地プレートにワームを選び、ワームがプレートの周りを5分間移動するのを待ちます。線虫が順応している間に、RNaseフリーフードで、10マイクロリットルの溶解バッファーをサンプルあたり1〜100個のDnase Iと混合し、PCRストリップの蓋を逆さまにして解剖スコープのプラットフォームに置きます。次に、10マイクロリットルの溶解混合物をドーム型PCRチューブキャップに加え、プレートから線虫をすくい取り、蓋の各スロットに細菌が移らないようにします。すべてのワームが移されたら、キャップを閉じてチューブを5秒間回転させてから、チューブを液体窒素のデュワーフラスコに入れます。最後の5秒後、チューブを摂氏40度の水浴で解凍してから、凍結/解凍手順をさらに9回繰り返します。最後の凍結融解サイクルの後、溶解したサンプルをサーマルミキサーで4°C、毎分約1800回転で20〜30分間混合します。ミキシングインキュベーションの終了時に、示されているようにサンプルをスピンダウンし、解凍したばかりのストップ溶液を1マイクロリットル各チューブに加えます。バルク温サンプルの逆転写には、RNaseフリーフードで酵素バッファーマスターミックスを調製し、各サンプルの11マイクロリットルに14マイクロリットルのマスターミックスを加えます。示された逆転写プログラムを使用してサンプルをサーモサイクラーに通し、得られたcDNA産物をヌクレアーゼフリー水で1〜4の比率で希釈します。ターゲット特異的なプレアンプでは、96ウェルプレートのサンプルあたり1ウェルに3.75マイクロリットルのプレアンプマスターミックスを添加し、マスターミックスの各ウェルに各cDNA溶液1.25マイクロリットルを添加します。すべてのサンプルがロードされたら、プレートをシーリングテープで覆い、サンプルを短時間ボルテックスしてから遠心分離でスピンダウンしてから、プレートをサーモサイクラーにロードし、指示どおりにプログラムを実行します。プレアンプから未取り込まれたプライマーを除去するには、サーモサイクルの最後にサンプルプレートを遠心分離し、シールを慎重に剥がします。I Master Mixを各プレアンプ反応に2マイクロリットルのエキソヌクレアーゼを加え、再シール、遠心分離、プレートをサーモサイクラーに戻します。サイクルの最後に、サンプルを18マイクロリットルのTris-EDTAバッファーで希釈します。マルチアレイチップをセットアップするには、3.6マイクロリットルのアッセイローディングマスターミックスと0.4マイクロリットルの50マイクロモルフォワードリバースプライマーを384ウェルプレートのサンプルごとに1ウェルに加えます。次に、2.2マイクロリットルのサンプルマスターミックスと、サンプルを処理した各プレアンプ化エキソヌクレアーゼ1.8マイクロリットルをプレートの適切なウェルに加えます。シングルアレイチップをセットアップするには、第2の384ウェルプレートの1サンプルにつき1ウェルに5.4マイクロリットルのアッセイローディングマスターミックスと0.6マイクロリットルのフォワードリバースプライマーを添加し、次いで3.3マイクロリットルのサンプルマスターミックスと2.7マイクロリットルの各予増幅エキソヌクレアーゼを調製したシングルアレイプレートの適切なウェルにサンプルを添加する。ナノ流体チップを最初のランでプライミングするには、チップを45度の角度でゆっくりと保持し、150マイクロリットルの制御ライン流体をチップのアキュムレータに慎重に注入します。すべての液体がロードされたら、チップの底から青い保護フィルムをはがし、バーコードを外側に向けてチップをナノ流体PCRプライミングマシンに入れます。次に、Prime(153x) スクリプトを実行します。プライミング後、チップを暗い表面に置き、各アッセイまたはサンプルミックスをロードするときに、必要に応じて対応するバリアプラグを取り外し、実験計画に従ってナノ流体チップの対応するインレットに適切な量のアッセイまたはサンプルミックスを追加します。ロード後、チップをナノ流体サーモサイクラーに入れ、データ収集ソフトウェアで適切なプロトコルを実行します。マルチアレイチップ全体を使用しない場合は、ポストスクリプト実行を実行して、残りのチップアレイをダウンストリームで使用できるようにします。worm-to-Ctプロトコルが有効なcDNA抽出法であるかどうかを検証するために、この方法を標準的なチオシアン酸グアニジウム-フェノール-クロロホルム抽出法と比較しました。世界的に、全RNA100ナノグラムあたりのhsp-70 mRNA発現レベルは、フェノール-クロロホルム法とワーム-to-Ct法の両方を使用して同等でした。しかし、hsp-70の発現が最も高い場合、Worm-to-Ct法の方が発現が高く、感度が向上したことが示されました。バルクサンプルのグアニジウムチオシアン酸-フェノール-クロロホルム抽出では、hsp-70は対照と比較してhsf-1変異体で82.7減少し、ウォーム-Ctで92.3%減少し、2つの方法間で減少が同等であったことを示しています。25匹の線虫のバルクサンプルまたは平均36匹の線虫サンプルから得られたcDNAを使用して、試験したすべてのシャペロンについて同等の発現レベルを検出し、1匹の線虫から得られたパラメーターが信頼できることを示しました。ここでは、短時間のヒートショック後の単一の線虫からの複数のhsp転写産物の平均発現を示しています。観察されたように、転写産物の発現の変動性は、遺伝子によって大きく異なります。単一の線虫サンプルを使用して試験したすべての転写産物について、技術的な変動係数は生物学的な変動係数よりも低く、単一の線虫でqPCRを実行した場合、パラメーター推定に技術的なトリプリケートは必要なかったことを示しています。このプロトコルを実行する際には、少量を正確にピペットでピペットし、ナノ流体チップに逆ピペットで入れないことが不可欠です。このプロトコルは、大量のRT-qPCRデータを取得するために使用でき、ExcelまたはRスクリプトを使用して必要に応じてエクスポートおよび処理できます。

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