同系ゼブラフィッシュにおける限界希釈細胞移植を用いた腫瘍増殖細胞の頻度を定量化
July 14th, 2011
限界希釈細胞移植アッセイは、腫瘍増殖する細胞の頻度を決定するために使用されます。このプロトコルは、蛍光標識された白血病と成人のゼブラフィッシュの腹腔内に限界希釈法でこれらの白血病細胞を分離して移植する方法の詳細を開発する同系のゼブラフィッシュを生成するための方法を説明します。
限界希釈細胞移植アッセイは、実験動物モデルにおける自己複製の可能性を評価するためのゴールドスタンダードです。このデモンストレーションでは、1細胞期の同系ゼブラフィッシュ胚にRAG 2 MICおよびRAG 2 GFPを注入して、蛍光標識T細胞性急性リンパ芽球性白血病を発症するトランスジェニックゼブラフィッシュを作製します。生後60日までに、初代白血病細胞をゼブラフィッシュから単離し、蛍光活性化細胞ソーティングを用いて精製します。
次に、細胞をゼブラフィッシュ成魚の腹腔内に限定希釈で移植し、腫瘍の増殖を最大90日間モニターします。最後に、極限希釈分析統計ソフトウェアプログラムを使用して、元の腫瘍内の白血病増殖細胞の頻度を定量化します。限界希釈細胞移植解析により、研究者は腫瘍塊の大部分に含まれる自己複製細胞の数を正確に評価できます。
これらの自己再生細胞ががんの形成を促進し、最終的に再発の原因となります。ゼブラフィッシュモデルで限界希釈移植アッセイを行う主な利点は、各実験で多くの魚を移植できるため、自己複製腫瘍増殖細胞の頻度を決定する際の精度が向上することです。この手法は、急性リンパ芽球性白血病であるT細胞の腫瘍増殖細胞に関する洞察を提供します。
また、他のゼブラフィッシュがんモデルを理解するためにも適用できます。研究室の仲間であるジェシカ・ブラックバーンと才能ある技術者であるサリー・リューが、今日は手順を実演します Rag 2 CMとRAG 2つのG-F-P-D-N-Aを線形化するには、摂氏37度で一晩中1つではなく、制限酵素で各プラスミドの10マイクログラムを消化します。フェニルクロロホルム抽出とエタノール沈殿後、各プラスミドを20マイクロリットルの水に懸濁します。
1%アグロゲル上のDNA濃度を測定するには、消化された各プラスミドを20マイクロリットル、10マイクロリットル、および5マイクロリットルの高範囲DNAラダーで1対1、1〜5、および1〜10希釈します。次に、DNAを最終濃度60ナノグラム/マイクロリットルに希釈して、CG 1株シンゲンに注入します。ゼブラフィッシュの胚は、マイクロリットルあたり30ナノグラム、ぼろきれ2CMおよびマイクロリットルあたり30ナノグラムの250ナノリットルを注入します。
2つのGFPを1つの細胞段階のゼブラフィッシュ胚にぼろきれさせ、DNAを卵黄ではなく細胞に直接慎重に標的にします。注入した胚は摂氏28.5度で保存し、死んだ胚は生後5日で24時間後に取り出し、注入の約28日後に動物を大きな水槽に移します。ゼブラフィッシュの幼生に麻酔をかけ、200マイクロリットル/ミリリットルあたり4ナノグラムのトリカSを25ミリリットルの魚系水にペトリ皿で加えます。
蛍光標識されたTALL の発達について幼虫を調べます。落射蛍光顕微鏡を使用して GFP 蛍光を検出します。腫瘍陽性の幼虫と陰性の幼虫を分けて、分析で白血病の魚を見逃さないようにします。陰性の幼虫は、腫瘍が大きく成長した可能性がある場合、後の時点で検査することができます モニター蛍光標識 白血病の魚を少なくとも週に1回、腫瘍の成長を追跡するためにエピ蛍光顕微鏡を使用して
。GFP陽性白血病細胞が動物の50%以上を超えた場合は、1ミリリットルあたり4ナノグラムの1ミリリットルを追加します。魚を犠牲にするために魚システムの水の9ミリリットルを含むペトリ皿にトリカSは、0.9 XPBSで5%胎児ウシ血清の1ミリリットルを含む新しいペトリ皿に魚を置き、カミソリの刃で魚を浸軟させ、大きな細胞の塊を解離するために混合物をピペットで。次に、細胞を40マイクロメートルメッシュのストレーナーに通して50ミリリットルのチューブに入れます。
500マイクロリットルの細胞を4ミリリットルのポリスチレンチューブにピペットで移します。1ミリリットルあたり1ミリグラムの1マイクロリットル、ヨウ化ペリジウムを加えて死んだ細胞の渦を標識し、細胞を氷上に保ちます。また、移植中に腫瘍細胞のキャリアとして機能する正常な血液細胞を、移植中に腫瘍細胞のキャリアとして機能する野生型のCG1匹の魚を準備します50ミリリットルのチューブに50ミリリットルの総体積で
。正常な血液細胞を5%FBSで1ミリリットルあたり10倍から5番目の細胞の3倍に希釈し、0.9 x pbsでカウントし、蛍光活性化セルソーターを使用して96ウェルプレートのウェルあたり100マイクロリットルをピペットで、GFP陽性PI陰性腫瘍細胞を指示された用量で血液細胞を含む96ウェルプレートにソートします。さらに、正常な血球のない井戸に10、000の細胞を選別し、選別された細胞の遠心分離機の純度そして生存率を評価するために事実を使用して再分析します。96ウェルプレートを2000GSで10分間プレート化し、細胞をペレット化します。
95マイクロリットルのスナットを取り外し、残りの5マイクロリットルに細胞を再懸濁します。26 日半ゲージのマイクロ注射器を使用して、60 日齢を超える成体同系ゼブラフィッシュの腹腔に細胞懸濁液を注入します。ゼブラフィッシュは移植前に麻酔をかける必要はありません。
移植の約28日後に、10個の白血病細胞を持つ45匹の魚、100個の細胞を持つ20匹の魚、1000個の細胞を持つ7匹の魚、10,000個の背の高い細胞を持つ5匹の魚を移植します。4 85 20の励起波長と5 30 25の発光フィルターを使用して、落射蛍光顕微鏡でレシピエントのゼブラフィッシュを調べました。GFP蛍光を検出するため。
注入された魚の総数に対する陽性魚の数を記録します。14日ごとに最大90匹の魚を再検査し、陽性の魚の数を記録します。腫瘍陽性の魚がより豊富になると。
トリカ米国の過剰摂取によって動物を犠牲にし、結果を表に入力し、データをウェブベースの極限希釈分析ソフトウェアにアップロードして、一次TALL CG内の自己更新白血病細胞の頻度を決定しました。1株の胚にRAG 2つのcmicとRAG 2つのGFP幼虫を注射しました。 注射された魚の約5%は胸腺内にGFP陽性T細胞を持っており、これらの魚の100%は白血病を発症します。ここでは、65日齢の罹患動物から蛍光標識されたTALL細胞を選別し、限界希釈細胞移植アッセイに使用しました。まず、単一細胞を選択するための歩行を描きました。
次に、ヨウ化プロピジウム陰性細胞を選択しました。そして最後に、GFP陽性の白血病細胞だけを選んで選別する歩行をしました。このトールの例では、28日目にトールを移植した魚の早期腫瘍が、注射部位近くのGFP陽性細胞の領域として見られました。
一部のTLSはより進行しており、これらの実験では腹腔を埋めるように拡張し、220匹以上の動物を移植しました。これは、1人で数時間以内に簡単に達成できます。eldaのソフトウェアを用いたデータ解析では、平均して135Tに1細胞が自己複製性白血病増殖細胞であることが示されました。このビデオを見れば、同系ゼブラフィッシュの腹腔に限定希釈で腫瘍細胞を移植する方法や、得られたデータを使用して特定の腫瘍内の腫瘍増殖細胞の頻度を決定する方法についてよく理解できるはずです。
遺伝子改変動物を利用したさらなる研究は、これらの腫瘍増殖細胞の自己複製を支配するメカニズムを特定するのに役立つ可能性があります。
概要
この記事では、白血病における腫瘍形成細胞を研究するために、同系ゼブラフィッシュで制限希釈細胞移植アッセイを実施するためのプロトコルについて説明します。この方法には、蛍光標識されたゼブラフィッシュの生成と、成体ゼブラフィッシュへの移植用に白血病細胞を分離することが含まれます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 腫瘍学
- トランスジェニックモデル
背景
- 制限希釈アッセイは、腫瘍の自己更新能力を評価するために不可欠です。
- 同系ゼブラフィッシュは白血病の研究モデルを提供します。
- 蛍光標識により、腫瘍細胞の容易な識別が可能になります。
- 腫瘍形成細胞の理解は、がん治療戦略に情報を提供します。
研究の目的
- 白血病形成細胞の頻度を定量化する。
- 白血病細胞の分離と移植の方法を示す。
- ゼブラフィッシュをがん研究のモデルとして利用する。
使用した方法
- ゼブラフィッシュの胚へのトランスジェニック構築物の注入。
- 蛍光活性化細胞ソーティングを用いた白血病細胞の分離。
- 成体ゼブラフィッシュへの白血病細胞の移植。
- 統計ソフトウェアを使用した腫瘍成長のモニタリングと結果の分析。
主要な結果
- 白血病を伴う蛍光標識されたゼブラフィッシュの成功した生成。
- 移植用に生存可能な白血病細胞の分離。
- 極限希釈分析を用いた自己更新する白血病細胞の定量化。
- がん研究におけるゼブラフィッシュモデルの精度の実証。
結論
- ゼブラフィッシュにおける制限希釈アッセイは白血病の研究に効果的です。
- この方法は、腫瘍生物学と自己更新の理解を深めます。
- 結果は改善されたがん治療法に貢献する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of tumor-propagating cell frequency is critical for de-risking oncology targets and prioritizing therapeutic strategies. The syngeneic zebrafish limiting dilution assay enables high-throughput, reproducible measurement of self-renewing cell frequency, improving predictive confidence in preclinical models. This approach supports early discovery decisions by providing statistically robust data on tumor-initiating cell populations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying self-renewing cell frequency in tumor models.
- Operational Value: Supports biological de-risking through limiting dilution transplantation in genetically identical hosts.
- Strategic Value: Enhances target confidence by providing limiting dilution-derived frequency metrics for go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative tumor-propagating cell frequency data for assay standardization.
- Operational Value: Enables scalable transplantation of hundreds of zebrafish per experiment for reproducible limiting dilution analysis.
- Strategic Value: Facilitates assay readiness through one-cell transplant capability and long-term engraftment in syngeneic hosts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system for monitoring tumor propagation over 90 days post-transplant.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation via serial transplantation and tumor tracking.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking limiting dilution output to relapse potential.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical modeling by delivering quantitative self-renewal metrics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via limiting dilution transplantation of leukemia cells.
- Screening: Delivers assay reproducibility and quantitative outputs through limiting dilution cell dosing and tumor incidence scoring.
- Analytics: Enables extreme limiting dilution analysis to derive statistical frequency of tumor-propagating cells.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through long-term engraftment and tumor propagation monitoring in syngeneic zebrafish.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for limiting dilution assays across zebrafish cancer models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through accurate self-renewing cell frequency measurement.
- Operational Value: Standardization and scalability via high-number zebrafish transplantation and FACS purification.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions and reduced late-stage biological risk through limiting dilution-derived tumor-propagating cell quantification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on limiting dilution analysis of leukemia-propagating cell frequency.
Implementation Considerations
- Required expertise in zebrafish husbandry, transgenic injection, and fluorescence-activated cell sorting.
- Need for microinjection equipment, FACS, epi-fluorescence microscopy, and extreme limiting dilution analysis software.
- Standardization across labs requires consistent syngeneic zebrafish strains and limiting dilution dosing protocols.
- Adaptation to other cancer models depends on fluorescent labeling and tumor cell isolation feasibility.
- Practical limitation: immune regeneration in non-syngeneic hosts may cause tumor regression, necessitating syngeneic models for long-term studies.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:40
DNA Microinjection of Zebrafish Embryos
2:47
Screening for Primary T-ALL in Zebrafish Larvae
3:25
Isolation and Purification of Fluorescently-labeled Primary Leukemia Cells
4:57
Limiting Dilution Transplantation into Adult Zebrafish
5:31
Analysis to Determine: Leukemia-initiating Cell Frequency
6:15
Representative Results
7:26
Conclusion
