官能基化されたワイヤーベースの標的細胞単離:スパイク末梢血から癌細胞を単離するためのex vivo技術

上皮細胞接着分子(EpCAM)は、前立腺癌の急速に増殖する上皮細胞で過剰発現する表面膜貫通糖タンパク質です。EpCAM発現細胞を単離するには、機能化された金でコーティングされた先端を備えた医療グレードのワイヤーから始めます。官能基化は、共有結合したEpCAM特異的抗体を含む高分子ゲルを層状にします。

蛍光標識がん細胞を含む末梢血懸濁液にワイヤーを浸します。官能化部分が血液懸濁液に浸されたままであることを確認してください。がん細胞上のEpCAMは、ワイヤー上で機能化された特異的抗体を認識し、結合します。

バッファーで洗浄して、ワイヤ表面から結合していない細胞を除去します。ワイヤーを曲げて、機能化部分を緩衝液に浸した状態で、緩衝液を含むスライドガラスに取り付けます。蛍光顕微鏡を使用して、細胞質と核からの明るい蛍光を確認し、ワイヤー上に捕捉された細胞の存在を確認します。

ワイヤーをリリースバッファーで処理します。バッファー中のタンパク質分解酵素はポリマーゲルを切断し、抗体とがん細胞複合体をバッファーに放出します。ワイヤーアセンブリを遠心分離して、遊離された抗体細胞複合体をペレットに収集します。ワイヤーと酵素含有上清を取り除きます。標的細胞含有ペレットを適切な培地に再懸濁します。

末梢血5ミリリットルに、約500〜50万個の細胞を加え、チューブを反転させて混合します。収納コンパートメントからワイヤーを取り出した後、ワイヤーを保持しているゴムキャップを取り外し、ワイヤーを1xリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、チューブのキャップに取り付けます。次に、傾斜したローラーミキサー上でチューブを毎分5回転で室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、ワイヤーを1xリン酸緩衝生理食塩水で3回すすぎます。次に、ワイヤーを1xリン酸緩衝生理食塩水を含む15ミリリットルのチューブに入れて暗所で保管します。

グリースペンを使用してスライドガラスに長方形の領域を描き、その上に500マイクロリットルの1xリン酸緩衝生理食塩水を加えます。ワイヤーの機能部分を1xリン酸緩衝生理食塩水に浸すには、ワイヤーの非機能部分を曲げてスライドガラスの上に置きます。キャプチャされたセルの数を数えるには、ワイヤの両側を目視検査します。検査後、ワイヤーを1xリン酸緩衝生理食塩水を入れた15ミリリットルのチューブに戻し、暗所に保管します。

1ミリリットルの1xリン酸緩衝生理食塩水に、4ミリグラムの放出緩衝成分を溶解します。次に、溶液を0.2マイクロメートルの滅菌フィルターでろ過し、すぐに使用できるバッファーを取得します。次に、離型バッファーを摂氏37度で5分間温めます。温めたら、1.6ミリリットルの放出バッファーを移して、1.5ミリリットルの反応チューブを完全に満たします。次に、ワイヤーの機能部分を離型バッファー中で摂氏37度のウォーターバスで20分間インキュベートします。

インキュベーション後、ワイヤーを毎分500回転でシェーカーに15分間置きます。次に、ワイヤーを300 x g で10分間遠心分離します。遠心分離が終了したら、チューブからワイヤーを外し、キャップを閉じて、チューブを300 x g で10分間再度遠心分離します。

• Epithelial Cell Adhesion Molecules (EpCAMs) – Overexpressed in rapidly proliferating cells in prostate cancers.
• Free Floating Cancer Cells – Malignant cells in blood that have detached from a primary tumor.
• Cytocentrifugation Method – A procedure used to concentrate cells from a fluid sample.
• Functionalization – Process of equipping the wire with EpCAM-specific antibodies.
• Mccoy's 5a Medium Modified – A commercially available solution for culturing human cells.

• The EpCAMs are surface transmembrane glycoproteins overexpressed in rapidly proliferating epithelial cells (e.g., prostate cancer).
• These molecules bind to specific antibodies bound to a functionalized wire in a fluid suspension (e.g., cytocentrifugation method).
• A washing step removes unattached cells, leaving only the target cells bound to the wire (e.g., free floating cancer cells).
• The immersing and release process allows for the focus on the captured cells on the wire, and their subsequent collection.

• What is an EpCAM and how does it relate to prostate cancer and the isolation process?
• How does cytocentrifugation assist in concentrating the target cells?
• How does the wire's functionalization and release process work in terms of capturing and collecting cells?

• Isolating EpCAM-expressing cells for study can lead to advancements in cancer research (e.g., free floating cancer cells).
• Techniques like cytocentrifugation have numerous applications in cell biology and medical diagnostics (e.g., cytocentrifugation method).
• The process provides greater insights into the nature and behavior of cancers cells, potentially leading to more effective treatments (e.g., EpCAMs).
• Focused studies of such nature often lead to significant scientific advancements in cancer research and treatment.