二酸化チタンによるリン酸化ペプチドの濃縮:ペプチドライブラリーからのリン酸化ペプチドの選択的単離法

ホスホペプチドは、リン酸化セリン、スレオニン、またはチロシン残基を含む短いアミノ酸ストリングです。ペプチドミックスからホスホペプチドを単離するには、まず二酸化チタンビーズをチューブに入れます。焼入れ剤を含む適切な酸性化結合バッファーを使用してビーズを平衡化して調整します。所望の濃度のペプチド混合物をビーズスラリーに加えます。

ビーズが沈殿しないように、混合物を連続振とうしながらインキュベートします。酸性条件は、ホスホペプチドのリン酸基がチタンビーズと配位結合を形成することを促進します。バッファー中の急冷剤は、ビーズへの非リン酸化ペプチドの非特異的結合を減少させ、ビーズを懸濁液に残します。

ホスホペプチド結合ビーズを遠心分離してペレット化し、リン酸化されていないペプチドは上清に残ります。上清を捨てます。ホスホペプチド結合ビーズを、事前に組み立てられたスピンフィルターカラムに移します。遠心分離して結合バッファーを除去し、ホスホペプチド結合ビーズをトラップします。

フィルターを清潔なチューブに移し、アンモニア含有溶液を加えます。アンモニアは懸濁液を塩基性に変え、ホスホペプチドをビーズから外します。アセンブリを遠心分離して、結合していないホスホペプチドを溶出して収集します。二酸化チタンビーズはフィルターカートリッジに残ります。ホスホペプチドを乾燥させて、アンモニアの痕跡を取り除きます。

二酸化チタンを500マイクロリットルの100%ACNで2回前処理します。次に、二酸化チタンを500マイクロリットルの0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7)で2回コンディショニングします。最後に、300マイクロリットルの平衡バッファーを使用してビーズを3回洗浄します。400マイクロリットルの50%ACN、0.1%TFAを低タンパク質結合チューブに加えます。次に、84マイクロリットルの乳酸を加えます。

再懸濁したホスホペプチドを低タンパク質結合チューブに移し、エンドオーバーエンドローテーターを使用して室温で1時間インキュベートします。ビーズをペレット化した後、300マイクロリットルの平衡バッファーを使用して2回洗浄し、スピンダウンします。300マイクロリットルのすすぎバッファーを使用して、ビーズを2回すすぎます。次に、それらを0.2マイクロメートルのスピンフィルターに移します。

回転後、フィルターユニットを清潔な1.5ミリリットルの低タンパク質結合チューブに移し、200マイクロリットルの0.9%アンモニウムを水に溶かして、内容物を2回溶出します。pHを確認した後、溶出液を真空濃縮して一晩乾燥させ、アンモニアを蒸発させます。