ショットガンプロテオミクスにある深さの特徴付けのためLERLIC-MS / MSおよびグルタミンの定量化およびアスパラギン脱アミド

この手順の全体的な目標は、ショットガンプロテオミクスを使用して、複雑なプロテオーム中の内因性グルタミンおよびアスパラギン脱アミド化産物を特徴付け、定量化することです。この方法は、グルタミンの等尺性生成物臀部やアスパラギム脱アミノ化に対する自発的およびアンチマティックプロセッサの影響など、生化学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、グルタミン脱アミノ化異性体が長尺のイオン変化キャピラリーカラム上で分離されるため、アイソマティックポイントによるペプチドの分離能力が最大化されることです。

カラムの作製を開始するには、50ミリグラムの弱陰イオン交換充塡剤を3.5ミリリットルの90%イソプロパノールに懸濁します。メス-メスフィッティング、マイクロフェラル、およびメスナットを、内径200マイクロメートルのピークチューブの長さ50センチメートルの一端に固定します。マイクロフェラル内のチューブの端に1マイクロメートルの細孔がある1/16インチのスクリーンを取り付けます。

4, 500 psiに設定された圧力ポンプを使用して、材料が上部に見えるまで陰イオン交換をキャピラリーに詰めます。別のメス-メスフィッティング、マイクロフェラル、およびメスナットを、反対側の端にあるパックされたキャピラリーの上部に取り付けて、カラムの組み立てを終了します。50〜100ミリグラムの組織をリン酸緩衝生理食塩水で5分間洗浄します。

この洗浄を 2 回繰り返し、洗浄したティッシュを安全キャップ付きのチューブに入れます。各チューブに、重量相当のステンレス鋼ビーズ 1 個と、酢酸アンモニウムと 1% デオキシコール酸ナトリウムの 100 ミリモル水溶液の体積 2.5 相当量を追加します。組織を最大強度で5分間、摂氏4度で均質化します。

次に、ホモジネートを10,000 x gおよび摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を1.5ミリリットルのチューブに移します。組織ペレットのホモジナイズと遠心分離を続け、ペレットが観察されなくなるまで毎回上清を結合します。

結合した上清中のタンパク質濃度をビシンコニン酸アッセイで定量します。次に、ホモジネートに100ミリモル酢酸アンモニウム中のジチオスレイトールの1モル溶液を添加して、サンプル中のジチオスレイトール濃度を10ミリモルにします。ホモジネートを摂氏60度の水浴中で30分間インキュベートします。

ホモジネートに100ミリモル酢酸アンモニウム中のヨードアセトアミドの1モル溶液を添加して、サンプル中のヨードアセアミド濃度を20ミリモルにします。ホモジネートを室温で、光の無所で45分間インキュベートします。次に、ホモジネートを100ミリモルの酢酸アンモニウム中のジチオスレイトールの10ミリモル溶液の2容量当量で希釈します。

ホモジネートを摂氏37度で30分間インキュベートします。ホモジネートに、100ミリモル酢酸アンモニウム中のシーケンシンググレードの修飾トリプシンを十分な量添加して、サンプル中のタンパク質酵素比を1〜50重量比で達成します。サンプルを摂氏30度で一晩インキュベートし、ホモジネートを消化します。

ギ酸のサンプル重量の0.5%で分解を急冷し、デオキシコール酸ナトリウム塩を沈殿させます。SDC塩を含むサンプルを穏やかにボルテックスし、次にサンプルを12、000 x g、摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を新しいチューブにデカントし、SDC塩のペレットを乱さないように注意してください。

塩を水酸化アンモニウムの0.5体積%水溶液に再溶解し、激しくボルテックスします。1グラムのC-18吸着剤カートリッジに5ミリリットルのアセトニトリルを入れ、続いて5ミリリットルの0.1%トリフルオロ酢酸を水に含ませます。次に、分解したサンプルをカートリッジにロードします。

0.1%TFAの5ミリリットル部分でサンプルを3〜5回洗浄します。次に、ペプチドを75%アセトニトリルと0.1%ギ酸の水溶液5ミリリットルで希釈します。真空濃縮器で流体を乾燥させます。

残渣に0.1%ギ酸を含む200マイクロリットルの75%アセトニトリルを加えます。混合物を少なくとも10分間ボルテックスし、次いで混合物を少なくとも30分間超音波処理して乾燥ペプチドを再構成する。必要に応じてサンプルを希釈し、注入したサンプルに1〜3マイクログラムのタンパク質が含まれるようにします。

LAXキャピラリーカラムを超高圧液体クロマトグラフィー装置に接続します。0.1%ギ酸溶液を水とアセトニトリルに調製します。流量を毎分0.4マイクロリットルに設定し、1, 200分のグラジエントランを設定します。

質量分析計のスキャンイベントは、フルフーリエ変換質量分析とフーリエ変換タンデム質量分析の間で交互にデータ取得を行うように構成します。LERLIC MS/MSを実施して、ペプチドを分離し、特性評価します。得られたデータとプロテオミクスソフトウェアを使用して、タンパク質データベース検索を実行します。

データベースの検索結果をスプレッドシートソフトウェアにエクスポートします。脱アミド化ペプチドと対応する非脱アミド化ペプチドのリストを同定し、抽出します。これらの各ペプチドのイオンクロマタグラムを、5 ppm の質量許容誤差で抽出します。

抽出したイオンクロマタグラムで、異性体生成物の分離したダブルピーク錯視がないか調べます。LERLIC MS/MS を使用して、グルタミンとアスパラギンの脱アミド化アイソフォームを分離し、2 つの異なる保持時間でタンパク質サンプルから同定しました。逆γαグルタミル比を示すトランスアミド化の酵素修飾中間グルタミン残基を同定した。

アスパラギン残基中のスクシンイミド中間体もこの方法で同定されました。弱酸性のサンプル処理条件により、スクシンイミド中間体が安定します。このことは、LERLIC MS/MS技術がスクシンイミド中間体のプロテオームワイド研究に適用できることを示唆しています。

その開発後、この技術は、生化学の研究者が考古学から生物医学研究に至るまでの文脈でタンパク質の脱アミド化を特徴付ける道を開きました。