ショットガンプロテオミクスにある深さの特徴付けのためLERLIC-MS / MSおよびグルタミンの定量化およびアスパラギン脱アミド

本手順の全体的な目的は、ショットガンプロテオミクスを用いて、複雑なプロテオーム中の内因性グルタミンおよびアスパラギン脱アミド化生成物を特性評価および定量することです。この手法は、グルタミンおよびアスパラギンの脱アミド化によるアイソマー生成物に対する、自発的および非酵素的なプロセスの影響など、生化学における重要な疑問への回答に役立ちます。この手法の主な利点は、グルタミン脱アミド化アイソマーが長尺のイオン交換キャピラリーカラムで分離されるため、等電点によるペプチドの分離能が最大化されることです。

カラム作製を開始するには、50 milligramsの弱陰イオン交換充填剤を3.5 millilitersの90%イソプロパノール（水溶液）に懸濁させます。内径200 micrometers、長さ50 centimeterのPeak製チューブの一端に、メス-メス継手（マイクロフェルール）とメスナットを固定します。マイクロフェルールの内側にあるチューブの末端に、孔径1 micrometerの1/16インチスクリーンを装着します。

4,500 psiに設定したプレッシャーポンプを使用し、アニオン交換樹脂をキャピラリーに充填し、上端に材料が見えるまで詰めます。充填したキャピラリーの反対側の端に、別のメス-メス継手、マイクロフェラル、およびメスナットを取り付け、カラムの組み立てを完了させます。50〜100 mgの組織を、リン酸緩衝生理食塩水で5分間洗浄します。

この洗浄を2回繰り返し、洗浄した組織を安全キャップ付きのチューブに入れます。各チューブに、組織重量と同量のステンレスビーズと、1% sodium deoxycholateを含む100 millimolar 酢酸アンモニウム水溶液を容量比で2.5倍量加えます。4°Cで最大強度にて5分間、組織をホモジナイズします。

次に、均質液を10,000 x g、4 °Cで10分間遠心分離します。上清を1.5 mLチューブに移します。組織ペレットの均質化と遠心分離を繰り返し、ペレットが観察されなくなるまで、毎回上清を回収して合わせます。

BCA法を用いて、合わせて得られた上清中のタンパク質濃度を定量します。次に、サンプル中のジチオスレイトール濃度が10 mMになるように、100 mM酢酸アンモニウムに含まれる1 Mジチオスレイトール溶液をホモジネートに添加します。ホモジネートを60 °Cのウォーターバスで30分間インキュベートします。

ホモジネートに、サンプルのヨードアセトアミド濃度が20 mMとなるように、100 mM酢酸アンモニウムに含まれる1 Mヨードアセトアミド溶液を加えます。ホモジネートを遮光し、室温で45分間インキュベートします。その後、100 mM酢酸アンモニウムに含まれる10 mMジチオスレイトール溶液を、ホモジネートの2倍量の体積で加えて希釈します。

ホモジネートを37°Cで30分間インキュベートします。サンプル中のタンパク質と酵素の重量比が1:50になるように、100 mM 酢酸アンモニウムに含まれるシーケンシンググレードの修飾トリプシンを十分な量、ホモジネートに添加します。サンプルを30°Cで一晩インキュベートし、ホモジネートを消化させます。

サンプル重量の0.5%のギ酸を加えて消化反応を停止させ、デオキシコール酸ナトリウム（SDC）塩を沈殿させます。SDC塩を含むサンプルを穏やかにボルテックスし、次いで12,000 x g、4 °Cで10分間遠心分離します。SDC塩のペレットを乱さないように注意しながら、上清を新しいチューブに移します。

塩を0.5%（容量比）の水酸化アンモニウム水溶液に再溶解し、激しくボルテックスします。1 gのC-18吸着剤カートリッジに5 mLのアセトニトリルを、続いて0.1%トリフルオロ酢酸水溶液5 mLを流してコンディショニングします。その後、消化したサンプルをカートリッジにロードします。

0.1% TFAを5 mLずつ用いて、サンプルを3〜5回洗浄します。次に、ペプチドを75%アセトニトリルおよび0.1%ギ酸の水溶液5 mLで希釈します。真空濃縮機で液体を乾燥させます。

残渣に0.1%ギ酸含有75%アセトニトリルを200 µL加えます。混合物を10分間以上ボルテックスし、その後、乾燥したペプチドを再溶解させるために30分間以上超音波処理を行います。注入されるサンプルに1〜3 µgのタンパク質が含まれるように、必要に応じてサンプルを希釈します。

LAXキャピラリーカラムを超高圧液体クロマトグラフィー装置に接続します。水およびアセトニトリルで0.1%ギ酸溶液を調製します。流速を0.4 µL/minに設定し、1,200分のグラジエントランをセットアップします。

フルフーリエ変換質量分析とフーリエ変換タンデム質量分析の間でデータ収集を交互に行うように、質量分析計のスキャンイベントを設定します。LERLIC MS/MSを実行して、ペプチドの分離および特性解析を行います。得られたデータとプロテオミクスソフトウェアを使用して、タンパク質データベース検索を行います。

データベースの検索結果をスプレッドシートソフトにエクスポートします。脱アミド化されたペプチドのリストと、それに対応する非脱アミド化ペプチドを特定し、抽出します。これらの各ペプチドについて、質量許容範囲を5 ppmとしてイオンクロマトグラムを抽出します。

抽出イオンクロマトグラムを確認し、異性体生成物による二重ピークの錯覚が分離していないか検査します。LERLIC MS/MSを用いて、タンパク質試料からグルタミンおよびアスパラギンの脱アミド化アイソフォームを2つの異なる保持時間で分離し、同定しました。また、反転したγ-αグルタミル比を示す、トランスアミダーゼ反応により酵素的に修飾された中間体グルタミン残基を同定しました。

この手法を用いて、アスパラギン残基におけるコハクイミド中間体も同定されました。緩やかな酸性の試料処理条件が、コハクイミド中間体を安定化させるためです。このことは、LERLIC MS/MS法が、プロテオーム全体にわたるコハクイミド中間体の研究に適用可能であることを示唆しています。

この技術の開発により、生化学の研究者は、考古学から生物医学研究に至るまで、さまざまな文脈におけるタンパク質の脱アミド化を特性評価することが可能となりました。