質量分析法とあいまってペプチドイムノエンリッチメントを使用したタンパク質の定量化
July 31st, 2011
安定同位体の標準と抗ペプチド抗体（SISCAPA）によって、それぞれのタンパク質の代用物としてのペプチドの定量的な測定を提供するために、安定同位体希釈質量分析法（MRM - MS）を有するペプチドの結合親和性の濃縮をキャプチャします。ここでは、部分的に自動化された形式で磁性粒子を使用してプロトコルを記述する。
次の手順の全体的な目標は、それぞれのタンパク質の代替物として機能する複雑な混合物中のペプチドを単離し、定量することです。まず、混合物内の大きなタンパク質は、トリプシンなどの酵素を使用して成分ペプチドに消化されます。次に、標的ペプチド分析種とスパイクした安定同位体標識内部標準液をアンチプペプチド抗体を用いて濃縮し、単離後にプロテインGコード磁性粒子に固定化します。
標的ペプチドは磁性粒子から言及され、質量分析法によって分析され、内部標準に対する定量が行われます。従来のイムノアッセイのような既存の方法に対するこの手法の主な利点は、多数のアッセイを構築する際により速く、より費用対効果が高いことです。成功率が高く、容易に多重化できるため、手順がレイアウトされます。
実験室の技術者は、濡れた氷の上で10マイクロリットルの血漿EloquaをHawします。サンプルを1000マイクロリットルの深さのウェルプレートに移し、寓話フィルムで覆ってタンパク質を変性させます 20マイクロリットルの新鮮な9モル尿素30ミリモルDTTでタンパク質を変性させ、30分間インキュベートします 摂氏37度で、各サンプルに3マイクロリットルの新鮮な500ミリモルIオトアセトアミドを加え、室温で暗闇で30分間インキュベートします。次に、尿素を100ミリモルトリスpH 8で0.6モルに希釈し、1マイクロリットルトリップごとに1マイクログラムの10マイクロリットルを追加し、1対50の酵素対基質比の溶液をストックします。
反応を摂氏37度で一晩、3マイクロリットルのきちんとしたギ酸で1%の最終濃度までインキュベートした後、安定同位体標準または複数の標準を添加し続けます。マルチプレックスアッセイを実施する場合は、Oasisカートリッジプレートを80%ACEニトリル中の0.1%ギ酸500マイクロリットルでよく洗浄し、流れを捨てます。次に、500マイクロリットルの0.1%ギ酸を水に追加してカートリッジプレートを平衡化し、流れを捨てます。
ダイジェストサンプルをカートリッジプレートにロードし、流れが非常に遅くなるように真空度を調整します。500マイクロリットルの0.1%ギ酸を水で3回洗浄し、80%アセト試験で500マイクロリットルの0.1%ギ酸でペプチドを2回溶出する流れを廃棄し、溶出液を凍結乾燥またはスピードアップして乾燥させ、乾燥ペプチドを50マイクロリットルのPBSプラス0.03%チャップスで再構成し、サンプルを標準的なKingfisher 96ウェルプレートに移し、1マイクログラムの抗体と1.5マイクロリットルのプロテインGを追加しますターゲットごとにコード化された磁気ビーズ。添加する前にビーズをボルテックスします。
ビーズがしっかりと吊り下げられていることを確認するため。プレートをホイルで覆い、穏やかなタンブリング遠心分離機で一晩インキュベートします。プレートを400RPMで10秒間押し、ホイル表面から液体を取り除きます。
ホイルカバーを取り外します。サンプルの操作は、Kingfisherプラットフォーム上の自動化されたKingfisherプラットフォームで行われます。PBSプラス0.03%チャップスの200マイクロリットルと10のPBSプラス0.03%チャップスの10マイクロリットルの200マイクロリットルで1回とビーズを2回洗浄すると、5%酢酸プラス0.03%チャップスの25マイクロリットルでペプチドを逃れます。
溶出プレートを磁石に置き、残ったビーズが移らないように注意しながら溶出液を96ウェルプレートに移します。プレートを天井マットで覆い、溶出液を含むこのプレートをトリプル、クワッド質量分析計に送って分析します。MRM法は、最適なトランジションフラグメントイオンを選択して最適化するよりも、目的のペプチドのタンデム質量スペクトルを取得することによって構築されます。
通常、MRM 分析のコンフィギュレーションでは、C 18 トラップと 2 つの移動相を持つ分析カラムを使用します。サンプルの10マイクロリットルをロードし、線形勾配で溶出します。軽質ペプチドと重ペプチドのピーク面積を統合し、各サンプル中の非標識ペプチドと標識ペプチドのピーク面積比を計算します。
軽いペプチドと重いペプチドは同時に溶出し、各ペプチドについて複数の遷移をモニターすることができる 同一性を確認するために、内因性ペプチドのピーク面積を内部標準の面積に対して相対的に測定し、標的ペプチドの定量的測定を提供する。このビデオを見れば、この手法を研究室でどのように実装するかを十分に理解できるはずです。目的のタンパク質の定量に使用できるため、生物学研究の幅広いアプリケーションに適しています。
概要
この記事では、ペプチドの親和性濃縮と定量ペプチド測定のための安定同位体希釈質量分析を組み合わせたStable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies（SISCAPA）技術について説明します。このプロトコルは効率を高めるために、部分的に自動化されたフォーマットで磁性粒子を使用します。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 生化学
- 質量分析
背景
- SISCAPAは、タンパク質の代用としてペプチドの定量化を可能にします。
- この方法は従来の免疫アッセイよりも速く、費用対効果が高いです。
- 複数のペプチドを同時に分析できるため、多重アッセイに適しています。
- この技術はタンパク質をペプチドに分解し、特定の抗体を使用してそれらを濃縮します。
研究の目的
- 複雑な混合物からペプチドを分離し、定量化すること。
- ペプチド分析の効率を高めるプロトコルを示すこと。
- 生物学研究に広く適用できる方法を提供すること。
使用された方法
- トリプシンを使用してペプチドを生成するためのタンパク質の消化。
- 磁性粒子上の抗ペプチド抗体による標的ペプチドの濃縮。
- ペプチドの定量化のための質量分析。
- Kingfisherプラットフォームを使用した部分的に自動化されたワークフローの実装。
主な結果
- SISCAPA法はペプチド定量化において高い成功率を提供します。
- 効果的にアッセイを多重化できることを示します。
- 軽いペプチドと重いペプチドの比率を比較することで定量測定が達成されます。
- この技術は様々な関心のあるタンパク質に適応可能です。
結論
- SISCAPAは生物学サンプルにおけるペプチド定量化のための堅牢な方法です。
- このプロトコルは多様な用途のために研究室で実施できます。
- 従来の方法に比べて利点があるため、研究において価値あるツールとなります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative protein measurement remains a critical bottleneck in target validation and biomarker discovery, where traditional immunoassays face cost, lead time, and interference limitations. SISCAPA offers a scalable, multiplexable alternative that enhances predictive confidence in early discovery by providing stoichiometric, antibody-independent quantification of proteotypic peptides. This supports risk-adjusted portfolio decisions and translational continuity from hypothesis to preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise quantification of target proteins in complex matrices.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by using proteotypic peptides as stoichiometric surrogates for protein concentration.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by delivering reproducible, multiplexable data for target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated peptide enrichment workflows compatible with downstream SRM/MRM-MS quantification.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through stable isotope internal standards and magnetic bead enrichment.
- Scalability: Facilitates multiplexed assay development for parallel target evaluation without plasma depletion.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing quantitative peptide readouts translatable across sample types.
- Mechanistic De-risking: Enables biomarker alignment through specific, interference-resistant peptide detection in disease-relevant systems.
- Predictive Confidence: Supports risk-adjusted advancement decisions via quantitative, antibody-free protein measurement.
Pipeline & Workflow Integration
SISCAPA integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling quantitative measurement of proteins as a foundation for assay development and screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying target proteins in native biological contexts.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible peptide enrichment and quantitative MS readouts for compound evaluation.
- Analytics: Provides light/heavy peptide peak area ratios as quantitative outputs for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Enables continuity from discovery to preclinical validation through standardized peptide quantification.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for multiplexed target quantification across projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, antibody-based enrichment, and mass spectrometry.
- Depends on access to SRM/MRM-capable mass spectrometers and magnetic bead handling platforms.
- Necessitates cross-team standardization of antibody validation and peptide selection criteria.
- Involves adaptation considerations for different sample types, including plasma, cell lysates, and tissue extracts.
- Involves practical limitations related to antibody availability for specific peptides and trypsin digestion efficiency.
