多光子顕微鏡法に基づく血管可視化のためのイメージングフィクスチャサポートマウス肝臓病期分類:マウス肝臓の血管の多次元画像を取得するための安定化デバイス支援イメージング技術

多光子顕微鏡は、生体組織内の蛍光標識血管系の高解像度の3次元画像をキャプチャできます。麻酔をかけたマウスを仰臥位から始めます。

蛍光色素抱合デキストランの懸濁液を尾静脈に慎重に注入します。注入された分子は循環を通って流れ、肝臓などの臓器に到達します。蛍光色素は血管血清に標識し、血管の視覚化を助け、付属の高分子量デキストランは血管系からの血管の漏出を防ぎます。

マウスの腹部を準備します。真空ポンプに接続されたイメージングレンズ入り吸引リングを備えた臓器イメージングフレームのベースに移します。胸骨下部の境界に沿って切開して肝臓を露出させます。

吸引リングを肝臓に誘導し、真空または負圧を加えて、吸引リング内のレンズへの肝臓の吸着を促進します。このステップにより、イメージング中のモーションアーティファクトが減少します。マウスを含むイメージングフレームを多光子レーザー走査型顕微鏡ステージに移します。

高解像度イメージングのための浸漬媒体として機能する生理食塩水でレンズを覆います。イメージング中、集束された長波長の低エネルギー光子は、より深い組織の浸透を可能にし、焦点の血管内の蛍光色素を励起し、蛍光シグナルの放出と検出を引き起こします。

異なる深さで選択された光学切片からの一連のスキャンにより、組織内の血管の完全な3次元画像が再現されます。

麻酔をかけた8週齢の雄C57BL/6マウスで正位反射の欠如を確認した後、マウスの尾を75%アルコールで拭き取り、30ゲージ針を備えた1マイクロリットルの注射器を使用して、100マイクロリットルのローダミンBイソチオシアネート-デキストランの100マイクロリットルのローダミンBイソチオシアネート-デキストランを尾尾静脈に注入します。

すべての溶液が供給されたら、綿棒を使用して穿刺部位に圧力を加え、滅菌水で濡らしたガーゼを使用して腹部の毛皮を浸します。カミソリを使用して腹部を剃り、毛皮の方向にストロークし、摂氏 37 度のアルコール消毒済み加熱パッドの上にマウスを置きます。

体臓器イメージングフレームでマウス肝臓を固定するには、まず直径5mmの清潔な吸盤を固定位置に置き、加熱パッドと吸盤を75%アルコールで拭きます。吸盤を真空ポンプホースに接続し、ポンプの電源を入れます。

を75%滅菌したテーブルで、手術用ハサミを使用して、マウスの胸骨下縁から2センチの皮膚を切り取り、肝臓を露出させます。マウスと加熱パッドをボディフレームのホルダーベースに置き、吸盤が肝臓を保持できるように臓器イメージングフィクスチャを調整します。次に、30〜35キロパスカルの陰圧を吸引に使用し、肝臓がカップに付着するようにします。

多光子レーザー走査型顕微鏡をセットアップするには、顕微鏡の電源を入れ、60倍対物レンズを選択します。フレームとマウスを対物レンズの下に固定し、レンズを覆うのに十分な大きさの生理食塩水をカップに一滴加えます。レンズが生理食塩水に触れるように対物レンズを調整し、レーザーソフトウェアをオンにします。