マウス角膜と結膜のライブイメージングのためのカスタム多光子顕微鏡プラットフォーム
2020年5月17日
ここでは、生きたマウス眼球表面イメージング用の多光子顕微鏡プラットフォームを紹介します。蛍光トランスジェニックマウスは、細胞核、細胞膜、神経線維および毛細血管を眼表面内で可視化します。コラーゲン構造に由来する非線形第二高調波生成信号は、間質アーキテクチャにラベルフリーイメージングを提供します。
このプロトコルは、二重蛍光トランスジェニックマウスモデルにおけるマウス眼球表面の構造全体のライブイメージング用マルチフィルター顕微鏡を使用します。カスタムマルチフォトン顕微鏡プラットフォームと二重蛍光トランスジェニックマウスの組み合わせにより、眼表面の構造と構造をリアルタイムで可視化できます。マルチフォトン顕微鏡をセットアップするには、水浸漬20X、1.00 NA目的を選択し、直立顕微鏡上の励起源としてチタンサファイアレーザーを設定します。
レーザー出力波長をEGFP用880ナノメートル、tdTomatoの場合は940ナノメートルに設定します。SHG EGFPとEGFP tdTomatoの分離のための2つの二色性ミラーを含み、SHG EGFPおよびtdTomato信号をスペクトル的に分離するために434-17、510-84および585-40ナノメーターのバンドパスフィルターを使用する。眼ホルダーを設置するには、8-12週齢のマウスでペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、加熱顕微鏡ステージにマウスを置き、温度監視プローブを挿入します。
カスタムステレオタキシックマウスホルダーにマウスを置き、外部聴覚肉にイヤーバーを挿入します。ヘッドホルダーを固定し、0.4%オキシブプロカイン塩酸塩と生理食塩水を眼表面に塗布するために3点固定を使用します。PEチューブループで5番デュモン鉗子のペアの先端をカバーします。
3分後に眼球の突起を確認するために手動眼瞼引き込み、眼瞼のマージンに沿ってPEホルダーチューブループを慎重に配置して眼表面を露出させます。そして、鉗子で眼球を安定させるためにホルダーのノブを使用します。その後、角膜表面を1.338の屈折率で目のゲルで覆います。
角膜表面のZシリアルイメージングでは、水銀光源を使用してターゲットフィールドを画像化し、顕微鏡ソフトウェアを開きます。眼表面の細胞構造を視覚化するための適切な写真乗数とデジタルゲインを選択し、画像スタックの取得を可能にする最初と最後のスライドを設定します。画像解像度を 512 x 512 ピクセルに設定し、Z ステップを 1 マイクロメートルに設定します。
次に、SHG EGFP信号収集用880ナノメートル励起を用いた1つのライブ画像を取得するZシリアル画像を収集し、各領域内のEGFP tdTomato信号コレクション用の940ナノメートルの励起で1つのライブ画像を収集するために、開始をクリックします。画像全体を通して、ステッパー電動ステージホルダーを使用して眼球を回転させ、角膜表面全体をイメージングできるようにします。すべての画像が取得されたら、フィジーにZシリアル画像をロードし、中央値3Dフィルタプラグインを選択します。
バックグラウンドノイズを除去した後、鮮明なマスクフィルターパッケージフィジーを選択して画像をシャープにし、自動輝度コントラストをクリックして画像の品質を自動的に最適化します。処理後、イメージをシリアル画像シーケンスとして保存し、適切な3D再構成ソフトウェアプログラムにイメージシーケンスをエクスポートします。マルチフォトン顕微鏡画像の全てにおいて、EGFP tdTomatoとSHG信号をそれぞれ擬似緑、赤、シアンで表示してから、スナップショットで3D構造画像をキャプチャします。
多光子顕微鏡検査により、二重蛍光トランスジェニックマウスの角膜上皮における表在翼細胞および基底細胞の可視化が可能となる。基底層からの単一細胞は、単一の六角形の表面細胞と同様に表層にマッピングすることができる。tdTomatoシグナルの細胞質発現によって明らかにされるように、ゴルジ装置および小胞体を含む膜タンパク質は、翼細胞内に散乱される。
コラーゲン質間質の中で、星状の同流部位は、これらのマウスのEGFP蛍光を標的とする膜によって概説される。カレッジ間質に埋め込まれたコレートサイトは、内皮細胞内よりも緩やかに間隔が大きい。さらに、角膜間質内の細い分岐神経は、tdTomatoシグナルを標的とする膜によっても可視化され、角膜内皮細胞単層はハニカムパターンで連結された比較的均質な六角形の形状を示す。
四肢上皮は上皮細胞の1〜2層から成る。二重蛍光レポータートランスジェニック株はまた、血管内皮を概説する毛細血管の3Dアーキテクチャの再構築を促進する、結膜内の毛細血管のイメージングを可能にする。眼球を損傷のない中程度の圧力で安定させることは、不十分または過度の圧力が画質を損なう可能性があるため、良質の画像を取得するために重要です。
このNVivo画像イメージングプラットフォームは、眼表面下の構造の可視化のために変更することができ、様々な眼疾患のin-situ研究に適用することができます。
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概要
本論文では、二重蛍光トランスジェニックマウスモデルを用いた、マウス眼表面の生体イメージングのためのマルチフォトン顕微鏡プラットフォームを提示します。このシステムにより、眼表面内のさまざまな細胞構造をリアルタイムで可視化することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 眼科学
- 顕微鏡観察
背景
- マルチフォトン顕微鏡法は、強力なイメージング技術です。
- 蛍光トランスジェニックマウスを用いることで、細胞構成要素の視覚化を向上させることができます。
- 眼表面の構造を理解することは、さまざまな研究用途において極めて重要です。
- ラベルフリーイメージング技術は、蛍光法を補完することができます。
研究目的
- マウス眼表のライブイメージング手法を開発すること。
- 可視化能を向上させるため、カスタムマルチフォトン顕微鏡を活用すること。
- イメージングにおける二重蛍光トランスジェニックマウスの有用性を実証すること。
使用方法
- 特定の対物レンズとレーザー設定を用いたマルチフォトン顕微鏡のセットアップ。
- 信号分離のためのダイクロイックミラーおよびバンドパスフィルターの使用。
- 加熱顕微鏡ステージ上での麻酔下マウスのライブイメージング。
- 眼表面構造のリアルタイム可視化。
主な結果
- 細胞核、細胞膜、および神経線維のイメージングに成功。
- 第二高調波発生を用いたストローマ構造のラベルフリーイメージング。
- マルチフォトンプラットフォームの有効性を実証。
- リアルタイム可視化能力を検証。
結論
- マルチフォトン顕微鏡プラットフォームは、眼球イメージングに有効である。
- 二重蛍光トランスジェニックマウスにより、眼球構造の可視化が向上する。
- 本手法は、眼球生物学および関連分野の研究を促進することができる。
よくある質問
産業界における重要性
このマルチフォトン顕微鏡プラットフォームは、マウスの眼表構造の生体でのラベルフリーイメージングを可能にし、眼科薬探索における角膜および結膜の生物学的な重要な知見を提供します。細胞ダイナミクス、実質構造、および血管ネットワークを生体内で可視化することにより、本手法は眼疾患の前臨床モデルにおける治療標的のメカニズム的なリスク低減を支援します。正確なポジショニングにより眼表全体をイメージングできるこのプラットフォームの能力は、標的バリデーションおよびアッセイ開発パイプラインにおける予測的な信頼性を向上させます。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 生体の眼組織において、細胞核、細胞膜、神経線維、および毛細血管を可視化することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用上の価値： 第二高調波発生によるストロマ構造のリアルタイム観察および、デュアル蛍光リポーターによる細胞ダイナミクスの観察を通じて、機能的ターゲットのバリデーションを支援する。
- 予測的価値： 疾患関連の眼モデルにおける構造的・細胞的変化の定量的かつ再現可能なリードアウトを提供し、ポートフォリオの優先順位付け（トリアージ）を効率化する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値：上皮、間質、内皮、および血管区画の高解像度イメージングを可能にし、ダウンストリームワークフローに向けた検証済み生物学的システムを準備します。
- 運用の価値：精密なZスタック撮影、SHG信号と蛍光信号のスペクトル分離、および安定した眼球ポジショニングにより、アッセイの標準化と再現性の課題を解決します。
- 戦略的価値：光毒性を最小限に抑えつつ、角膜および結膜表面全体のイメージングを可能にすることで、スクリーニングへの適合性とプラットフォームの再利用性を強調します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値：結膜における3次元毛細血管構造の再構築および輪部上皮層の可視化を可能にすることで、疾患との関連性について論じています。
- 運用の価値：眼表面の各領域にわたる正確なポジショニングによる生体内イメージングをサポートし、創薬から前臨床検証までの連続性を記述しています。
- 予測的価値：ラベルフリーな実質イメージングと細胞マッピングを提供し、眼科病理のメカニズム的理解を深めることで、リスク調整後の開発推進上の意思決定に寄与します。
パイプラインとワークフローの統合
本手法は、初期のターゲット検証から前臨床イメージングに至るディスカバリー・コンティニュアムに統合され、眼科研究における仮説検証およびメカニズムのデリスキングを支援します。
- 探索生物学：眼表面における細胞および構造ダイナミクスのライブイメージングを可能にすることで、本手法がどのように仮説検証、パスウェイの解明、および生物学的リスク低減を支援するかを解説します。
- スクリーニング：Zシリアルイメージング、スペクトル信号分離、および安定化したイメージング条件を通じて、アッセイの準備状況、再現性、および定量的出力を記述します。
- 分析：コラーゲン構造のためのSHGや、膜および核局在のためのtdTomato/EGFPなど、チームが条件を比較する際に役立つ測定、リードアウト、または統計的出力を強調します。
- トランスレーショナルリサーチ：疾患関連モデルにおける毛細血管の3D再構築および上皮層マッピングを可能にすることで、本手法を前臨床の連続性やバイオマーカーの整合性に結びつけます。
- エンタープライズ再利用：本手法を単発の技術ではなく、さまざまな眼疾患モデルやイメージングエンドポイントに適応可能な、再利用可能な機能として位置づけます。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 予測精度の向上、ターゲットの妥当性確認、および眼表面生物学におけるメカニズム的な曖昧さの解消。
- 運用上の価値： カスタマイズされたアイホルダー、定位固定ステージ、および制御されたイメージングパラメータによる、標準化、再現性、およびスケーラビリティの実現。
- 戦略的価値： ターゲットへの結合および組織反応の早期可視化を可能にすることで、より適切な意思決定（Go/No-go判断）、資本効率の向上、および後期段階における生物学的リスクの低減を実現。
- ポートフォリオへの影響： 角膜および結膜の各区画における定量的なラベルフリーおよび蛍光読み取りにより、リスク調整後の優先順位付けと開発推進の決定を可能にする。
実施上の注意点
- マルチフォトン顕微鏡法、眼球解剖学、およびトランスジェニックモデルの取り扱いに関する専門的な科学的知見が必要である。
- チタンサファイアレーザー、ダイクロイックミラー、バンドパスフィルター、電動ステージ、および3D再構成ソフトウェアを含む、機器および解析インフラストラクチャが必要である。
- イメージングプロトコル、信号検出設定、および画像処理パイプライン（例：ノイズ低減およびコントラスト強調のためのFijiプラグイン）に関するチーム間の標準化が求められる。
- まぶたの固定、眼表面用カップリングジェル、および異なる蛍光リポーターに応じた励起波長の調整など、モデルシステム間での適応上の検討事項がある。
- ソース資料に基づいた実用上の制限：不十分または過剰な圧力は画質を低下させるため、眼球を損傷させずに適度な圧力で固定することが極めて重要である。
