In VitroでのSMC収縮の測定:電気細胞-基板インピーダンスセンシングを使用して平滑筋細胞の収縮を評価するための非侵襲的方法

大動脈壁には主に平滑筋細胞 (SMC) があり、大動脈血流を調節するために収縮および弛緩する収縮性タンパク質機構が含まれています。

動脈SMCの収縮応答をin vitroで測定するには、電気細胞基板インピーダンスセンシング(ECIS)センサーアレイを含むマルチウェルプレートを入手します。各アレイには、絶縁フィルムで描かれたウェル底部に金膜電極が含まれています。井戸をゼラチンでコーティングします。

初代ヒトSMC懸濁液をウェルに播種します。ECISを含むウェルプレートを、ホルダーとの電極接触を確保しながら、アンプおよびデータ収集システムに接続されたプレートホルダーに移します。電極間に小さな定交流電流を印加して、電極の電位を測定します。

インキュベーション中、SMCはゼラチンコーティングに付着して広がります。セルは絶縁体として機能し、電極間の電流の流れを制限します。より多くのセルが表面に付着すると、電流の流れはさらに減少します。その結果、インピーダンス、つまり電流の流れに対する反対、および電位が増加します。最終的に、細胞は電極上で増殖し、単層を形成します。

SMCをカルシウムイオノフォアで処理して、細胞膜を横切るカルシウムイオン輸送を促進します。細胞外カルシウムイオンの流入は収縮装置を活性化し、収縮を誘発します。

刺激されたSMCは収縮し、電極上の細胞間接触を失います。その結果、電極表面被覆率が減少するとインピーダンスが減少し、SMC 収縮のリアルタイム定量化が容易になります。

自動セルカウンターを使用して細胞をカウントし、ゼラチンでコーティングされたECISプレート内の200マイクロリットルのSMC培地に、ウェルあたり30,000細胞の播種密度でSMCを3回播種します。SMCを含むプレートを細胞培養インキュベーターのECIS 96ウェルホルダーに入れます。

「ECIS Applied Biophysics ソフトウェア」をダブルクリックしてプログラムを開き、「セットアップ」ボタンを押します。すべての電極がホルダーに接触しているかどうか、左下のパネルで「ウェル構成」と書かれていることを確認してください。電極が正しく接続されていない場合は、測定を開始する前にホルダー内のプレートを調整してください。

次に、同じパネルで「アレイタイプ」をクリックしてプレートタイプを選択します。次に、2マイクロリットルと150マイクロリットルの容量に設定された2つのピペットを準備します。刺激を開始する前に、ソフトウェアの「マーク」を押して、コメントを配置します。

細胞を刺激するには、蓋を取り外し、インキュベーター内の無菌面に置きます。次に、2マイクロリットルのイオノマイシン作業溶液を各ウェルにできるだけ早くピペッティングすることにより、SMC収縮を誘導します。

すべての細胞が刺激されたら、2番目のピペットを使用してウェル内の培地を混合します。