マイクロパターンエラストマーを使用したシングルセル収縮性の簡素化されたハイスループット分析

この研究は、蛍光タンパク質マイクロパターンの可視化された変位に基づいて単一細胞収縮力の単純化されたハンズオフ定量化のために、マイクロウェルフォーマットで蛍光標識エラストマー収縮性表面(FLECS)技術を利用するための柔軟なプロトコルを提示する。

細胞が生成する機械的な力は、体全体のさまざまな臓器で適切に機能するために不可欠です。さらに、腸の膀胱、心臓など。これらの器官は、細胞収縮および弛緩の安定したパターンを生成しなければならず、内部止血状態を維持する。

異常な平滑筋細胞収縮は、筋肉収縮を伴う腸の異常なパターンを特徴付ける腸運動障害、ならびに過活動または低活動膀胱のような状態を含む様々な障害の発症をもたらし得る。そして気道では、不規則なパターンを収縮させるいくつかの筋肉細胞は、喘息の過敏症を引き起こす可能性があります。明らかに、細胞および組織内の収縮メカニズムは、治療の選択肢を必要とする疾患につながる可能性がある。

そして、これらの状態は細胞の機能不全の収縮挙動から直接生じる可能性があるため、潜在的な薬物候補をスクリーニングする際には、細胞の収縮機能自体を測定することが論理的かつ必要になります。マイクロ技術の最近の進歩に続いて、単一細胞収縮の定量的測定を可能にするユーザーフレンドリーなマイクロプレートベースのアッセイを開発しました。フレックスと呼ばれる数十万の細胞において、蛍光標識エラストマー収縮可能な表面としても知られている。

このアプローチでは、蛍光タンパク質のマイクロパターンを埋め込むため、細胞が牽引力を加えると変形して収縮する柔らかい膜が埋め込まれます。重要なことに、タンパク質のマイクロパターンは、細胞の位置、形状および広がり領域を制約する。均一な試験条件により、それらの寸法変化のみに基づいて簡単な測定が可能になる。

全体として、ブラウザベースの画像解析モジュールを含むこのプラットフォームは、繊細な取り扱い手順や受託者マーカーの登録を必要とせずに、契約可能な細胞力の簡単な分析を可能にし、基本的な細胞培養と低倍率の簡単な蛍光顕微鏡で任意の研究者が操作できます。この技術は、エンドユーザーを念頭に置いて設計されており、細胞力生物学を研究するための実験室の科学者の参入障壁を減らすことを目指しています まず、20ミリリットルの培地を慢性チューブに追加し、細胞収縮性をアッセイするように設計された24ウェルプレートを取得します。ピペットを500マイクロリットルに設定し、細胞病原体用のセルストレーナーを入手してください。

24ウェルプレートの蓋を外し、プレートをそのように保持してから、プレートの上にあるプラスチックの層を静かに取り除きます。プレートを慎重に下ろします。こぼれを防ぐために、各井戸から最上層PBSだけを吸引します。

次に、一度に1列ずつ、残りのPBSをウェルから取り出し、500マイクロリットルの細胞培地で迅速に充填する。プレートを優しく振って、その側面をタップして、ウェルの底全体が溶液で覆われていることを確認します。すべてのウェルがメディアで満たされたら、プレートを横に置きます。

この時点で、インキュベーターから細胞培養物を取得します。我々は、強固なアソシエーションプロトコルを実施します。このプロトコルの目的は、1ミリリットルあたり50,000個の細胞の懸濁液を作成することである。

細胞を播種する前に、細胞の塊を単一の細胞に分解するために、ストレーナーを通して一度細胞にこすりを加えるようにしてください、慎重に500マイクロリットルの細胞溶液を各ウェルに入れてください。細胞播種後、細胞がパターンに直接定着できるように、プレートを1時間放置することが重要です。1時間が経過した後、プレートを一晩インキュベーターに入れます。

実験の第2の部分は、24ウェルプレートに薬物を添加し、プレートの蛍光イメージングからなる。プロトコルのこの部分には、堅牢な細胞生存率と応答を保証するための2つの重要な要件があります。1つ目は、細胞を含むウェル内のDMSOの最終濃度が1%以下であることを意味し、薬物ストックから100個の完全希釈を行う必要があります。

2つ目は、DMSOを井戸に直接加えることができないのは、DMSOがその混合の底に衝突し、高濃度で細胞に害を及ぼすからです。代わりに、DMS0薬物と培地の中間溶液を作成し、細胞への高い局所DSSO曝露を避けるために徹底的に混合する必要があります。このプロトコールでは、40マイクロモルから1ナノモルまでの範囲をカバーする6段階8倍希釈を行います 30マイクロリットルの原薬液を連続した210マイクロリットル容量のDMSOに移し、各転写工程間で徹底的に混合することにより、6段階8倍希釈シリーズを作成します実験では、 ブレビスタチンの効果を評価します。

筋肉細胞を通るヒトの膀胱上。両方の要件を満たすために、まず中間薬DMSOと培地溶液を作成します。これにより、DMSOの16.7倍希釈が得られる。

次に、この中間薬液を細胞に追加し、さらに6倍の希釈をもたらす割合を使用して、合計100個の完全希釈および1%DMSOの最終濃度をもたらすこれを達成するために、各ストック薬物溶液について、30マイクロリットルの薬物を470マイクロリットルの細胞培養培地に混合し、次いで、この中間溶液の200マイクロリットルを24ウェルプレート上の適切なウェルに移す。 各ウェルに1000マイクロリットルが含まれています。これは、集合的に、適切な量の時間にわたって1%終濃度のDMSOインキュベートを生じる。私たちの実験では、30分間インキュベートし、画像化する準備ができたら、ウェルズ全体に生きた核染色剤を加え、ストックから1〜10,000希釈を加えます。

さらに15分間インキュベートさせます。イメージングの準備ができたら、標識された細胞核と蛍光色素の両方の蛍光チャネルをイメージングするための蛍光顕微鏡が必要になります。マイクロパターンにはラベルが付けられており、この例ではtri Cチャネルです。

さて、単一細胞を同定するためにブレビスタチン核を蛍光イメージングし、分析中に整列できるようにマイクロパターンを見るのとまったく同じ位置に染色細胞核を画像化してください。取得した画像をコンピュータにアップロードし、パターンチャンネルがアンダースコアPTで終わるように、画像に適切なラベルが付けられていることを確認します。そして、核チャンネルの画像は、ダピを強調することで終わります。次に、画像Jを使用して、tif画像をPNG画像に変換します画像Jが開いたら、一度に1つのチャンネルにロードします。

最初にパターンチャンネルをロードし、コントラストを調整して、信号を最大化し、背景を最小限に抑えます。さらに、画像を平滑化します。画像が好みに合わせて変更されたら、画像タイプを8ビットに変更します。

次に、画像をPNGタイプとしてエクスポートします。次に、チェックボックスをオンにして、スライスラベルをファイル名として使用します。PNG という名前の新しいフォルダーを作成します。

次に、そこにPNGファイルを保存し、画像を分析するには、BiodockドットAIに移動し、アカウントを作成し、分析モジュールへの無料アクセスを得るために著者に連絡します。アカウントが作成されたらログインします。ここでは、新しい画像をアップロードすることができます。

この新しいバッチを Web 実験データJoVEと呼びます。これで、画像をドラッグしてからドロップしてインポートし、こ OK.At ポイントを押してデータを選択します。次に、解析をクリックし、収縮性解析というラベルの付いたモジュールまでスクロールダウンし、selectを押します。

イメージングに使用したのと同じ値に倍率を設定します データが完了したら、それをクリックしてから、データのダウンロードを選択できます。データがダウンロードされると、入力されたすべての画像のオーバーレイされた画像ペアを確認できます。また、各セルセットの平均収縮を示す要約統計量にもアクセスできます。

収縮の測定単位はピクセル単位です。ここでデータを見ると、DMSOのみで処理したウェルでは、ブレビスタチンで処理した細胞と比較して細胞の収縮がはるかに高かったことがわかります。また、どの画像でも検出されたすべてのパターンのデータにもアクセスできます。

これにより、画像の位置、画像の原点、位置タイプ、細胞数、ゼロ1つまたは1つ以上、マイクロパターンのサイズ、および計算された細胞の収縮に関する詳細情報が得られます。このレイは、マイクロプレート内の識別されたすべてのパターンで構成されています。このリストからの単一セルパターンを平均化し、他のファイル内のPNG画像に対する平均収縮を計算した。

実験の必要に応じて、単一セル データを並べ替えて分析できます。ビデオのこの部分では、2つの異なる薬物で処理した膀胱平滑筋細胞からの応答データを示す24ウェルプレートから収集可能な代表的なデータを表示します。これらは、それぞれDMSOおよびブレビスタチンで処理したウェルの画像である。

ここで、DMSOのみで処理した細胞は、多数の収縮マイクロパターンを表示するが、ブレビスタチンで処理した細胞は大きく、収縮が少ないことに注意する。このヒストグラムのデータは、細胞に対する異なる処理の結果としての細胞収縮性の変動を表示します。ブレビスタチンで処理した細胞の分布の中心は、DMSOで処理した細胞の分布の中心よりも低い。

これは、前の画像に表示された情報と一致しています。ブレビスタチンで処理された細胞ははるかに小さい収縮を示したからである。これは、ブレビスタチンによる治療が細胞を有意に弛緩させることを意味する。

これらのデータセットのそれぞれは、ビデオに示されているプロトコルに従って、単一の24ウェルプレートから収集可能な用量反応曲線上のポイントに寄与する。ここで、サイトカラシンDは、薬物の濃度が高いほど収縮の値が低いことからわかるように、ブレビスタンよりも強力であることがわかります。実験を大幅にスケーリングしたい場合は、384ウェルプレートバージョンが利用可能で、これを自動化とともに使用して実験を劇的にスケーリングすることができます。

このデータは384ウェルプレートから収集可能であり、24ウェルプレート上の各薬物に対して6つの希釈ステップを有するのではなく、384ウェルプレートは複数の反復で各薬物に対して20の希釈ステップを実施することを可能にする。スノーフレーク技術はユニークです。これまで不可能であった顕微鏡による単一細胞収縮の可視化を可能にします。

したがって、技術は、蛍光標識されたタンパク質でパターン化されたメトリックの形式に依存しています。系統的パターンは、細胞収縮のために形成され、任意の所与の薬物による表現型の収縮の調節の正確な測定を可能にする。もちろん、この技術は、喘息、心血管疾患、炎症免疫腫瘍学、そしてもちろん、異常な細胞収縮が疾患の進行に重要な役割を果たす疾患適応症など、多くの異なる疾患領域への応用および多くの異なる疾患領域のためにまだ積極的に開発されている。

細胞の収縮性を測定するためのこのマイクロパターニングベースの技術は、従来の牽引力顕微鏡に代わるシンプルな代替手段を提供し、直感的な分析を提供し、パターンの縮小を監視し、大規模な細胞集団で単一細胞分解能を提供します。いくつかの考慮事項は、この方法は、T細胞および好中球などの小さすぎる細胞、または接着しない細胞型のいずれかの使用に課題を提起する可能性がある。さらに毎週結合する細胞は、主に互いに結合するか、または完全には広がらない細胞は、測定可能な収縮シグナルを産生しないであろう。

この技術のユーザーは、特定の細胞タイプに対して異なる可能な細胞培養培地製剤を慎重に評価する必要があります。異なる成分として、成長因子、血清レベルおよびpH感受性は、可変的な行動を促進する可能性がある。プロトコルの最適化は、実験的なワークフローのスケーリングを進める必要があります。

最終的に、単一細胞分解能が必要ない場合、または標的細胞型が最小の拡散能力を有する場合、そのような実験には従来の吸引力顕微鏡法を採用することができる。さもなければ、このツールが細胞生物学者が細胞収縮を研究し、彼らの研究を実行するための追加の道を提供することを願っています。