内皮増殖、バリアー機能、運動性の定量のための電気細胞 - 基質インピーダンスセンシング

次の実験の全体的な目標は、eisとして知られる電気セル基板インピーダンスセンシングを使用して、細胞の挙動を特徴付けることです。これは、アレイ内の電極上で細胞を増殖させ、さまざまなモードで測定して内皮バリアの形成、成熟、電気創傷などの機能操作を定量化することで達成され、その後、細胞の運動性とバリア機能をテストするために覚醒剤が追加されます。細胞の接着、増殖、遊走、内皮透過性の検出、およびesisに基づく細胞、細胞、および細胞基質の接触の評価を説明する結果が得られます。

この方法は、定量データのオンライン生成の提供、標準的な細胞培養条件での自然なコンフルエンス状態の細胞の特性評価など、細胞生物学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。一般に、この方法に不慣れな人は、基礎となる理論が複雑に見え、実験を開始する前にいくつかの基本的な考慮事項を認識する必要があるため、苦労します。まず、アレイを洗浄して安定化させることで、電極のドリフトを防ぎ、再現性を向上させ、信号強度比を高める必要があります。

したがって、15分後に8ウェルアレイの各ウェルに200マイクロリットルの10ミリモルELインを追加します室温で、リン酸緩衝液ではなく、2つの超純水洗浄でELシスチンを除去します。また、コーティング前に電極を血清含有溶液にさらさないでください。次に、200マイクロリットルの温めた1%ゼラチンを各ウェルに加え、アレイを摂氏37度で30分間インキュベートします。

ゼラチンの除去には、超純水を使用し、電極表面を乾燥させないでください。次に、ウェルに400マイクロリットルの完全培地を充填し、血清を格納できるようになりました。アレイをホルダーにロードします。

9つの金の正方形を確認してください。彼らはPOGOピンに連絡する必要があります。アレイを手で慎重に固定し、コンピュータの調整ネジを締めます。

測定ソフトウェアを開きます。セットアップを押してから、データ収集セクションの下で確認し、デフォルトの周波数である 4 、 000 ヘルツで各ウェルの迅速なインピーダンス測定を実行します。値はコメントセクションに保存されます。

チェックで、アレイ図のウェル構成セクションで使用されているEISアレイのタイプが正確に選択されていることを確認してください。赤と緑は、接続の機能を示します。クリーニングとコーディングが成功した場合、8 つの W one E sys アレイで約 5 つから 6 つの NANOFARAD アレイと 8 つの W 10 E アレイが登録されます。

したがって、細胞播種前の50〜60ナノファラッドのベースライン抵抗は約2000オームです。RB alpha と cm を使用してデータをモデル化するには、中程度の故障配列で MFT 記録を開始します。15分間の無細胞データを取得し、実験を終了して細胞を追加します。

次に、アレイを取り外し、400マイクロリットルの単一細胞懸濁液を各ウェルに播種します。細胞増殖種子を研究するには、1平方センチメートルあたり10, 000細胞/平方センチメートルで、ほぼコンフルエントな集団シード、60, 000細胞/平方センチメートルから始めます。アレイをホルダーにロードした後、ウェル構成セクションで、測定するウェルを選択します。

次に、データ収集オプションに移動し、固定周波数での時系列の測定モードを選択し、SFTを選択し、電極カバレッジを測定するための測定周波数を選択し、モデルRBとアルファMFTを選択すると、デバイスは利用可能なすべての周波数で自動的に測定を行います。可能な限り、多周波モードで測定を実行してください。これには、利用可能なすべての周波数のデータが必要であり、したがってほとんどの洞察が得られます。

マイクロモーション解析の場合は、RTCを選択し、サンプリング周波数を調整します。標準的な時間分解能は 1 ヘルツですが、インピーダンスの急速な変化を追跡するために増やすことができます。この値は、z θ で 25 ヘルツまで増やすことができます。

多数のウェルからマイクロモーションを連続して測定するには、ヘルプメニューを選択します。次に、エキスパートツールバーのメニュー項目を表示を選択し、マルチウェルRTCを取得します。[データの収集] セクションで、制限時間を時間単位で指定してください。

この設定を使用すると、データ集録開始後のサイクル数の入力を求められます。SFTまたはMFTを使用してデータを収集する場合は、秒単位で指定した測定間の時間間隔を選択します。最大限のデータ取得を行うには、このオプションをオフのままにします。

次に、スタートを押して、データを保存する場所を指定します。実行は、終了を押すことによって停止されます。一時停止を押すと、データ集録は停止しますが、実験クロックは動作し続けます。

次に、アレイを取り外し、層流フードの下でウェルを操作します。アレイをホルダーに戻した後、[接続の確認]をクリックして電気接続を確認し、実験を再開してデータの収集を続行します。操作後に細胞を無菌にする必要がない場合は、データ取得中にトロンビンなどの刺激をウェルに直接追加できます。

このような導入されたバリエーションは、markを押してコメントを追加することで、実験クロックにマークを付けることができます。別のオプションは、細胞を電気的に巻くことです。このための設定は、傷つける時間を短くするために微調整が必要で、長すぎると効果がなく、電極を損傷する可能性があります。

ソフトウェアが提供するデフォルト設定から始めて、そこから開始します。The wound electro parade setup sectionに移動し、woundを有効にします。次に、ウェル構成で巻くウェルを選択します。

チェックされた井戸だけが負傷します。「activate」をクリックすると、負傷を促すポップアップウィンドウが表示されます。巻線後、信号がほぼ細胞のない電極の値に低下することを確認します。

一般的にデータを操作するために負傷を繰り返さなかった場合は、データのエクスポートオプションを使用してExcelに選択します。ただし、RB と alpha のモデリングは、ソフトウェア内から行うことができます。MFT データから、モデリングは合流セル レイヤーでのみ有効であることに注意してください。

また、セルフリー参照を追加することを忘れないでください。まず、周波数スキャンのモデリングと分析セクションにあるfind機能を使用して、セルフリー参照を自動的に選択します。set で値を受け入れます。

次に、モデルを押して計算を開始します。これには数分かかっても心配しないでください。一般的な実験では、細胞は成長期からプラトー期に移行します。

それらが合流点に達すると、このプロセス中に電極から直接画像が取得されます。次の段階は、ECバリアの形成と成熟です。次に、電気創傷を使用して細胞遊走を研究します。

ベースラインへの信号の特徴的な低下に続いて、合流状態が再確立されます。最後に、刺激に対する反応がリアルタイムで追跡されます。ここでは、血管作用薬トロンビンを塗布した。

これにより、細胞の収縮が引き起こされ、それによってバリアの小さなギャップが一時的に開き、インピーダンス抵抗の低下を引き起こし、静電容量の測定により、最も感度の高い測定で細胞接着と成長抵抗に関する補完的な情報が得られます。周波数は、細胞バリアの品質と機能を表し、細胞傍および細胞横断電流の流れに対する抵抗を考慮に入れています。セルが電極に付着すると、電流の流れが制限され、静電容量は比例して低下します。

このフェーズは、電極カバレッジの全体的な測定を提供し、40キロヘルツを超える周波数で静電容量を記録するときに最もよく定量化されます。抵抗は、優れたセルが電流の流れをどのようにブロックできるか、したがってセルバリアの品質について明確なアイデアを提供します。したがって、異なる継代および異なる種類の細胞は、異なる抵抗を有する。

当社のRBとαは、細胞細胞と細胞マトリックスの接着を区別するのに役立ちます。RBは、電流の流れに対するセルセルの接触の抵抗率、または透過性の逆測定です。アルファは、セル電極接合からのインピーダンス寄与の尺度です。

RB 値とアルファ値の両方は、ISIS ソフトウェア内から計算できます。抵抗信号のわずかな変動は、コンフルエンスセル層の微妙な動きまたは微小な動きが原因である可能性があります。これらは、最も感度の高い周波数で1つのEアレイで測定でき、EIS内の高速フーリエ変換によって分析でき、細胞の挙動に関する洞察を提供するソフトウェア操作を正確に行うことができます。

例えば、細胞の移動を研究するために、数時間以内に閉じる250ミクロンの電気創傷を作ることが可能です。インピーダンス分光法は、添加された物質の影響を分析するのにも適しています。前述のように、トロンビンはAROキナーゼ阻害剤で基底細胞の張力を下げることにより、細胞バリアを過透過性にし、トロンビンの効果が低下する可能性がありますこの手順を試みる間、ESISは温度、pH、中程度の枯渇などの細胞環境の変化に非常に敏感であることを覚えておくことが重要です。

それが開発後。この技術は、学分野の研究者がコンフルエンス細胞培養に対する血管作用剤の傾向と効果をリアルタイムで研究する道を開きました。