携帯収縮機能を評価するために、マイクロスケールのシリコンカンチレバーの活用体外

次の実験の目的は、制御されたin vitro環境で刺激に応答した培養筋線維の収縮活性を測定することです。これは、解離した筋細胞をマイクロスケールのシリコンカンチレバーに播種し、これらの単核細胞の融合を誘導して、ミオチューブと呼ばれる繊維を形成することによって達成されます。分化した筋細胞を支えるこれらのカンチレバーチップは、レーザーと光検出器をサポートするように改造された電気生理顕微鏡に移され、チップをリグに配置した後の筋肉の収縮に応じたカンチレバーのたわみを測定するために使用されます。

レーザーは、カンチレバーの先端に焦点を合わせるように配置され、光検出器は、偏向ビームを捕らえるように同様に整列され、電気的または化学的処理に応答した筋肉の収縮によって引き起こされるカンチレバーの偏向の程度を示す結果が得られ、播種された細胞の収縮プロファイルをリアルタイムで直接測定することができる。最終的に、カンチレバー変位を処理して力を読み取ることができます。このシステムは、薬物治療、疾患、状態、または運動プロトコルに応じた収縮機能の変化を評価するための潜在的なハイスループットテストベッドを提供するためにマルチプレックス化されています。

パッチクランプ電気生理学などの既存の方法と比較したこの手法の主な利点は、機能分析のためのこの方法が非侵襲的であり、ハイスループット研究に容易に適応できることです。この方法は、臨床評価に先立って適切な用量反応濃度を特定するなど、医薬品開発分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の意味は、さまざまな病理学的表現型からの細胞の機能的パフォーマンスをリアルタイムで調査する手段を提供するため、複数の筋肉疾患の治療にまで及びますが、この方法は骨格筋の病状に関する洞察を提供できます。

また、心臓や平滑筋などの他の組織システムにも使用することができます 滅菌済み、事前に準備されたカンチレバーチップ、70%エタノール溶液中の13 Fカバースリップで、フローフード内で風乾させることができます。次に、個々のカンチレバーチップを13Fカバースリップの上に置きます。標準的な12ウェルプレートの内部で、使用する細胞の種類に最適化された生体高分子または表面修飾でカンチレバーをコーティングします 標準的な細胞培養プロトコルによると、表面コーティングは当社の調製方法を使用して30分かかりますが、研究者の特定の培養プロトコルに応じて変更される場合があります。

リースは、特定の増殖培地で所望の濃度までの細胞であり、その後、カンチレバーチップ表面に細胞懸濁液の百マイクロリットルを充填し、培地の泡がカンチレバーの窓を完全に覆うことを保証します。チップを含むプレートをインキュベーターに移し、このプレーティング期間後少なくとも1時間細胞を接着させます。滅菌鉗子を使用して、13 Fカバースリップなしでチップを清潔なウェルに移し、それぞれに1ミリリットルの成長培地を追加します。

プレートをインキュベーターに戻し、in vitro維持のための標準プロトコルに従って細胞を維持します。カバースリップに、加熱した培養皿を直立した電気生理学顕微鏡のステージに置きます。現在の細胞供給培地の3ミリリットルを加熱顕微鏡に加えます。

加熱された培養皿の内側に15mmの分離距離でステンレス製電極をステージマウントします。それらを、フィールド刺激、さまざまな強度、周波数、波形のパルスを生成できるパルス発生器に接続して、システムが必要に応じて細胞のフィールド刺激を生成できるようにします。XY並進ステージに取り付けられたヘリウムネオンレーザーを顕微鏡テーブルの下側にボルトで固定します。

次に、レーザービームがカンチレバーの平面に対して30度の角度で加熱された培養皿の底部に向けられるようにレーザーを調整します。次に、XY並進ステージに取り付けられた象限光検出器モジュールが顕微鏡ステージの下側に取り付けられます。反射されたレーザービームが4つの象限の中央に着地するように、その位置を調整します。

テキストプロトコルで提供されるフローチャートを参照して、カンチレバーを横切ってスキャンするリニアアクチュエータを制御するソフトウェアプログラムを作成します。カンチレバー解析ハードウェアと関連ソフトウェアの電源を入れます。加熱されたステージを挿入しますtage mrtaを媒体に、摂氏37度を示すのを待ちます。

次に、カンチレバーをステージの右側に向けて、カンチレバーチップをステージに挿入します。顕微鏡の光源をオンにします。顕微鏡の焦点を合わせてカンチレバーの端を視野に入れ、レーザー光検出器制御ソフトウェアを使用して、カンチレバーがステージカンチレバーの右側に向けられていると仮定して、レーザービームをカンチレバーの先端に配置します。

1 つは配列の左上に配置されているもので、番号は 16 まで続きます。左下にあります。カンチレバー17は右上の位置にあり、32まで走っています。

右下の録音ソフトウェアの再生を押します。光検出器を制御するステッピングモーターを調整して、信号がxフレームとyフレームの両方でゼロを読み取るように光検出器を配置します。次に、レーザー光検出器制御ソフトウェアでカンチレバーを1つの位置に設定します。

次に、レーザーをカンチレバー16の先端に移動します。光検出器の位置決めを繰り返し、レーザー光検出器制御ソフトウェアでカンチレバー16の位置を設定します。次に、レーザーをカンチレバー32の先端に移動します。

光検出器の位置決めを繰り返し、レーザー光検出器制御ソフトウェアでカンチレバー32の位置を設定します。最後に、レーザーをカンチレバー17の先端に移動します。光検出器の位置決めを繰り返し、レーザー光検出器制御ソフトウェアでカンチレバー17の位置を設定します。

顕微鏡の光源をオフにしてから、実験室のオーバーヘッドライトをオフにします。録音ソフトウェアの録音を押します。パルス発生器のハードウェアを 40 ミリ秒と 5 ボルトのパルス (周波数は 1 ヘルツ) に設定します。

次に、レーザー光検出器制御ソフトウェアを使用して、32カンチレバーアレイ全体をスキャンするようにハードウェアを設定します。それぞれで5秒間停止します。32個のカンチレバーのスキャンが完了したら、刺激装置の電源を切ります。

次に、録音ソフトウェアを停止し、データファイルを起動します。各カンチレバーから記録されたトレースを調べます。収縮活動の証拠。

収縮はピークとして定義されます。たわみがベースラインより少なくとも0.1ボルト高い場合は、肯定的な応答を持つ各カンチレバーをメモします。レーザー光検出器制御ソフトウェアのスキャンプロトコルから応答しないカンチレバーをすべて取り外します。

その後、アクティブカンチレバーを刺激なしで再スキャンして、細胞の自発的な収縮活動を読み取ることができます。次に、培地に治療用化合物を添加して、培養細胞の機能出力に対するその影響を観察します。広視野電気刺激の有無にかかわらず、コンパウンドランスキャンの追加に続いて、細胞を長時間電気的に刺激することで疲労評価を行い、続いて収縮性のスキャンレベルを測定して、ピーク力が特定の閾値を下回るのにかかる時間を測定します。

運動ニューロンが筋肉との共培養で維持される実験では、ニューロン刺激剤またはシナプス阻害剤による運動神経筋チューブカンチレバー共培養の治療と、自発的活動の増減をスキャンすることにより、神経筋接合部形成を測定し、テキストプロトコルに詳述されているように、カンチレバーの偏向データの分析に進みます。カンチレバーでの収縮性細胞の培養を成功させるには、標準的な細胞培養技術を使用した比較的簡単な手順です。標準的な電気生理学的ソフトウェアを使用して生データを分析できるため、ピーク力のピーク力までの時間、半緩和までの時間など、関連する機能特性の計算が容易になります。

拡張刺激プロトコルは、培養細胞の疲労速度を評価する手段を提供し、したがって、このシステムから得られる生理学的データのレベルを広げます。カンチレバー培養システムは、骨格筋筋管を用いた培養システムに運動ニューロンを含めるように変更することができ、これにより、in vitroでの神経筋シナプス形成の評価が可能になります。このような培養では、自発的な収縮活動の速度が、グルタミン酸などのニューロン特異的刺激剤による治療に応答した収縮の速度と比較されます。

観察されたグルタミン酸誘発性収縮率の増加は、アセチルコリン放出につながる培養ニューロンの活性化とその後の筋管活性化を示唆しています アセチルコリン受容体遮断薬、dtu rineなどのシナプス阻害剤による治療 グルタミン酸誘発活性の停止につながる これらの培養物における機能的な神経筋シナプスの存在のさらなる証拠を提供します。このビデオを見れば、マイクロスケールのシリコンカンチレバーを使用して培養骨格筋の機能特性を評価する方法について十分に理解できるはずです。