Name: 携帯収縮機能を評価するために、マイクロスケールのシリコンカンチレバーの活用体外 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 学ぶマイクロスケールシリコンカンチレバーを用いた筋細胞の収縮機能評価法。レーザーと光検出器でカンチレバーのたわみを測定し、電気・化学刺激への応答をリアルタイムで解析する非侵襲的アプローチです。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は健康の認可番号R01NS050452とR01EB009429総合研究所によって資金を供給された。カンチレバーチップの製造は、コーネル大学にあるナノ加工施設での共同研究者により外部で行われた。カンチレバーの製造工程で使用されるすべての機器はこの施設に位置していた。カンチレバー微細化と彼らの支援のためのマンディエッシュとジャン=マチューProtのに感謝します。カンチレバーの機能のビデオのアニメーションは、UCFでの合成リアリティ·ラボからチャールズ·ヒューズ、アレックスZeleninとエリック·インペリアーによって生成されました。

1カンチレバーチップ製造説明した製造工程を図示した細部は、 図1に示す。 <ol><li>オーブンでシリコン·オン·インシュレータ（SOI）ウェーハを配置し、それらを脱水し、20分間125℃で焼く。 </li><li>プラズマを用いて脱水したSOIウェハのハンドル層上に酸化ケイ素の1.5μmの厚さの層を堆積させる化学気相成長法（PECVD）ツールを強化。 </li><li>デバイス層を上に向けてスピンコーターチャック上のウエハを配置します。 、ウエハがセンタリングされていることを確認し1000回転/秒の加速度で60秒間、3000rpmでウェハの中心、そしてスピンでP20プライマーの2ミリリットルを分注する。 P20プライマーは、デバイス層にフォトレジストの接着を促進する。 </li><li>ウェハをスピンコータチャック上にある間に、ウェーハの中心にS1818フォトレジストを2mlを分配、およびo ​​1,000回転/秒の加速度で60秒間3,000 rpmでスピンフォトレジストの厚さ1.5μmの層をbtain。 </li><li>ホットプレート上でウェーハを置き、1分間115℃でソフトベークを行う。 </li><li>デバイス層上のフォトレジストにカンチレバーマスクからパターンを転写するためにフォトリソグラフィーコンタクトマスクアライナを使用してハードコンタクトUV露光を行う。 125 MJ / S1818フォトレジスト用cm 2の露光エネルギー値に基づいて露光時間を算出する。 </li><li>優しく前後にウェハを振りながら、1分間726 MIFフォトレジスト現像液にウェハを浸漬することにより、フォトレジストを開発する。 </li><li>脱イオン（DI）水を用いてウェーハをリンスし、それを乾燥、好ましくは、スピンリンス乾燥（SRD）ツールを使用して。 </li><li>アセトンに浸した綿棒を使用して（端から5mmまで）ウェーハのエッジからフォトレジストを除去します。 </li><li>フォトレジスト側を上にして、ディープ反応性イオンエッチング（DRIE）ツールで、ウェーハをロードし、デビを通じてパターニングされたシリコン層をエッチングするレシピを実行CE層。エッチストップとしての埋め込み酸化物層の機能なので、完全なエッチングを確実にするために必要であると予想されるよりも50％〜100％以上のサイクルでエッチングを行う。 </li><li>フォトレジストを除去するために20分間のホットフォトレジスト浴溶液にウェハを配置します。 DI水でウェーハを洗浄するためにクイックダンプリンサ（QDR）にウエハを転送します。フォトレジスト剥離後、ウェーハを洗浄し、乾燥さSRDツールでウェーハをロードします。期待どおりカンチレバーパターンが表示されていることを確認するために、顕微鏡下でウェハを検査します。 </li><li> PECVDツールを使用して、ウエハのデバイス層の上に非ドープ酸化シリコンの厚さ1μmの層を堆積。さらなる処理ステップ中にカンチレバーの保護層としてこの酸化物層は機能する。 </li><li>ウェハの裏面の処理を開始するために上に向け、ハンドル層をスピンコータチャックにウェハを配置します。 、ウエハがセンタリングされていることを確認し、ウェハの中央にP20プライマーの2ミリリットルを分配し、3000 rpmでスピン1,000回転/秒の加速度で60秒間。 </li><li>ウェハはスピンコーターチャックに入れたまま、ウエハの中心にSPR220-4.5フォトレジストの2ミリリットルを分配し、1000回転/秒の加速度で45秒間、2000rpmでスピンの6.5ミクロンの厚さの層を得るためフォトレジスト。 </li><li> 2分間115℃でソフトベークを実行するために近接ホットプレート上にウエハを配置します。 </li><li>前面/背面の位置合わせが可能なフォトリソグラフィコンタクトアライナーを使用して、前側カンチレバーパターンに裏面ウィンドウマスクを位置合わせし、ハンドル層上のフォトレジストに裏面ウィンドウマスクのパターンを転写するために、ハードコンタクトUV露光を行う。 SPR220-4.5フォトレジスト480 MJ / cm 2の露光エネルギー値に基づいて算出された露光時間を使用する。 </li><li> UV露光の後、ウェハは、次の処理ステップの前に30分間、暗い領域に残るう。 </li><li>ウエハを浸漬することによりフォトレジストを現像2分間726 MIFのフォトレジスト現像液を穏やかに前後にウェーハを振とうしながら。 </li><li>脱イオン（DI）水を用いてウェーハをリンスし、それを乾燥、好ましくは、スピンリンス乾燥（SRD）ツールを使用して。 </li><li> 12時間90℃のオーブンでウェーハを配置します。 </li><li>フッ素化ガスによるRIEシステムおよび酸化物をエッチングするためのレシピを用いてウエハの裏面に酸化シリコン層をエッチングする。ウェハの裏面上のパターン化された酸化物は、さらなる処理のためのエッチングマスクとして機能する。露出したウィンドウ内の酸化シリコンが完全にエッチングされることを保証するために、顕微鏡下でウェハを検査します。 </li><li>アセトン中に浸し、クリーンルーム綿棒を使用して（端から5mmまで）ウェーハのエッジ上にフォトレジストを除去します。 </li><li>とDRIEツールでウエハをロードし、エッチストップとしての埋め込み酸化膜の機能化を500μmの深さにパターン化されたハンドル層をエッチングするためにレシピを実行します。の過熱を防止するために、複数の実行中に、このエッチを分割シリコンの一貫性のないエッチングを引き起こすウェーハ。このエッチング工程は、完全にカンチレバー下のシリコンを除去します。 </li><li>カンチレバー下記の埋め込み酸化物層とカンチレバーの上に保護酸化物層を除去するために、25％希釈HFエッチング液を用いたウェットエッチング工程を行う。 注：この手順は、シリコンカンチレバーの底面を解放し、また、レーザーでカンチレバーをプローブするためのアクセスを提供するために下にあるウィンドウが開きます。 </li><li> DI水浴場のシリーズと窒素で丁寧に乾燥を用いてウェハを洗浄します。カンチレバーは、その拠点でのみサポートされているので、直接カンチレバーにDI水または不活性ガスの強制スプレーを使用しないでください。 </li><li>ハンドル層エッチング工程中に生成劈開ラインに沿ってウェハから各チップを切断する。 </li></ol> 2細胞培養<ol><li>以前に公開されている方法17に従って13Fカバースリップを準備します。 注：もし13F入り江rslipsが利用できない、95°以上の接触角を有する任意の疎水性表面を使用することができる。 </li><li>カンチレバーチップ、70％エタノール溶液中の13Fカバースリップを滅菌し、フローフード中で空気乾燥させ。 </li><li>標準12ウェルプレートの内側13Fカバースリップの上に個別のカンチレバーのチップを置きます。 </li><li>コー​​ト細胞型について最適化されたバイオポリマーまたは表面修飾を有するカンチレバーは、標準的な細胞培養プロトコルに従って使用されている。 </li><li>所望の濃度へのそれらの特異的な増殖培地中で細胞を再懸濁する。 注：このプロトコルは、カンチレバー窓から落下し、所望のカンチレバー表面に付着していない細胞のかなりの数になります。細胞調製は、したがって、標準的なカバースリップの準備のためよりも濃縮3~4なされるべきである。例えば、ラット骨格筋衛星細胞の播種は、典型的には500〜セル/平方ミリメートル15,16の播種密度を使用して行われる、および/平方mm 2000個の細胞でカンチレバー基板で使用されます。最適化実験は、適切な播種密度を確認するために、新しい細胞源を用いて実施されるべきである。 </li><li>媒体の気泡が完全にカンチレバー窓を覆う確保カンチレバーチップ表面上に細胞懸濁液200μlをピペット。媒体が窓から発散し、カンチレバーの上に静的な泡を形成しない場合は13Fのカバーガラスを交換し、メッキを再試行してください。 </li><li>インキュベーターにチップを含むプレートを移し、細胞が少なくとも1時間（好ましくは2〜3時間）のために接着させる。 </li><li>このメッキ期間の後、増殖培地1mlの文化を13Fカバースリップすることなく、きれいなだけでなく、チップを転送し、トップアップするために滅菌ピンセットを使用しています。 </li><li>インキュベーターにプレートを返します。 </li><li>カバーガラス上のインビトロ維持のための彼らの標準的なプロトコルに従って細胞を維持する。骨格筋細胞のために、細胞がコンフルエントになったら、筋管形成を誘導する培地組成のスイッチが必要になります。 </li></ol>カンチレバーのたわみ解析のためのハードウェアおよびソフトウェアのセットアップ3。 <ol><li>直立電気生理学顕微鏡のステージに加熱された培養皿を置きます。 </li><li>加熱された顕微鏡ステージに細胞が現在（+ 10mMのHEPES）中に懸濁さ給餌培地3mlを加える。 </li><li> 15mmの離間距離で加熱された培養皿の内側のステンレス鋼電極をマウントし、パルス発生器に接続し、変化する強度、周波数、及び波形の電界刺激パルスを生成することができる、システムは電場刺激を生成できるようにする細胞の適切なとき。 </li><li>ボルトヘリウムネオンレーザーは、顕微鏡台の下面に、XY並進ステージ上に取り付けられ、レーザビームは30°の角度で加熱した培養皿の底を通って導かれるように調整relativカンチレバーの面に電子。 </li><li>ボルト象限光検出器モジュール、顕微鏡ステージの下側に、XY並進ステージ上に取り付けられ、4象限の中央になるように反射されたレーザ光 ​​の土地の位置を調整してください。 図2は、設定されたハードウェアの概要を説明します記載されたプロトコルを実装するために必要な。 </li><li>カンチレバーを横切って走査するリニアアクチュエータを制御するためのソフトウェアプログラムを記述します。 図3に設けフローチャートを参照して、ソフトウェアプログラムを書くこのシステムで使用するためにプログラムされたグラフィカルインターフェイスは、 図4に設けられている。 </li></ol> 4。録音カンチレバーたわみデータ<ol><li>カンチレバー分析ハードウェアと関連ソフトウェアをオンにします。 </li><li>媒体への加熱されたステージのサーミスタを挿入し、それが37℃を読むことを待つ。 </li><li> cantileveと段階にカンチレバーチップを挿入ステージの右手側に向けrsは。 </li><li>顕微鏡の光源をオンにしてください。 </li><li>視野にカンチレバーのエッジをもたらし、カンチレバー1 NOTEの先端にレーザビームを位置決めするレーザー/光検出器制御ソフトウェアを使用するために顕微鏡の焦点を合わせる：カンチレバーがステージの右に向いていると仮定すると、カンチレバー1配列の左上に配置された1つであり、数字は左下に16にダウンを実行。カンチレバー17は、右上の位置にあり、右下の（ 図5A）で32に実行されます。 </li><li>を押して、録音ソフトウェア上で「再生」。 </li><li>位置の光検出器信号は光検出器を制御するステッピングモータを調整することにより、xとyの両方のフレームに「0」を読み出すようになっている。 </li><li>レーザー/光検出器制御ソフトウェアで設定カンチレバー1の位置（ 図4）。 </li><li>ステップ4.7を繰り返して、カンチレバー16の先端にレーザーを移動させ、cantilevを設定えー、レーザー/光検出器制御ソフトウェアの16ポジション。 </li><li>カンチレバー32は、手順4.7の先端にレーザーを移動させ、レーザー/光検出器制御ソフトウェアのカンチレバー32の位置を設定します。 </li><li>カンチレバー17は、手順4.7の先端にレーザーを移動させ、レーザー/光検出器制御ソフトウェアのカンチレバー17の位置を設定します。 </li><li>顕微鏡光源と実験室でのオーバーヘッドライトをオフにします。 </li><li>録音ソフトウェアを押して「記録」。 </li><li> 1Hzの周波数で40ミリ秒、5 Vのパルスに対するパルス発生器のハードウェアを設定し、マシンの電源を入れます。 注：必要に応じて、この時点では、特定の細胞ソースの最適化された刺激プロトコルを採用して、述べ設定は、ヒトとげっ歯類の細胞源12,13,15,16を使用して収集されたデータに基づくガイドラインである。 </li><li>レーザー/光検出器制御ソフトウェアを使用して、32カンチレバーアレイを横切って走査するためのハードウェアを設定し、それぞれの上に5秒間停止メール。 </li><li> 32カンチレバーのスキャンが完了すると、次に録音ソフトを停止し、データファイルを起動し、刺激装置をオフにしてください。 </li><li>収縮活動の証拠について、それぞれのカンチレバーから記録されたトレースを調べます。陽性反応をそれぞれのカンチレバーをメモしておきます。偏向は、ベースラインよりも少なくとも0.1 Vである場合に収縮がピークと定義される。 </li><li>レーザー/光検出器制御ソフトウェア上のスキャンプロトコルから任意の非応答性のカンチレバーを取り外します。 </li><li>アクティブカンチレバーは、細胞の自発収縮活動の測定値を得るために刺激することなく、再スキャンすることができる。 </li><li>培養された細胞の機能的出力への影響を観察するために、媒体への治療用化合物を添加した後、電気刺激または幅広い分野ずにスキャンを実行します。 </li><li>電気的に延長された期間とCONTRのスキャンレベルのために細胞を刺激することにより、疲労評価を実施 actilityは、それが特定のしきい値以下に低下するピーク力のためにかかる時間を測定した。 </li><li>運動ニューロンは筋肉との共培養で維持されている実験では、またはシナプス阻害剤（ 例えば 、D-ツボクラリン）と走査（グルタミン酸など）、神経刺激薬と運動ニューロン、筋管カンチレバー共培養の処理により、神経筋接合部の形成を測定自発的活動の増加と減少はそれぞれ16。 </li><li>計画された実験の必要性によって指示されるように、特定のスキャンを実行します。 </li></ol>カンチレバーたわみデータの解析5。 <ol><li>使用して、ストーニーの方程式は15細胞層または筋管（パスカル）、および（ナノニュートン）は、細胞の収縮力を直接測定における応力の読み出しに（ボルト）で生カンチレバー偏向データを変換する（詳細は下記）更新日： 広告/ 51866 / 51866eq1.jpg "/&gt;式（1） <img alt="式2" fo:content-width="2in" width="300" src="/files/ftp_upload/51866/51866eq2.jpg">式2 </li><li>ここで、δ=筋管によって生成カンチレバー先端のたわみや応力、筋管によって生成σC =ストレス、写真上のレーザー位置に電圧を関連するカンチレバー、C型検出器 =システム固有の係数の均一な厚膜と仮定すると全幅-detector、θ=カンチレバーの面に対するレーザおよび検出器の角度、E Siはシリコンの弾性率=、tのSiはSiの毒=ポアソン比V、T fは筋の厚さ 、カンチレバーの厚さ=シリコンカンチレバー先端から検出器へのレーザのL =片持ち梁の長さ、P =経路長、およびw 図6に提供される。 </li><li>ストレスとストーニーのの適用のために使用されたと仮定し、セルの断面積からの力の計算を等しくすることで、筋管が均一な膜である、筋管の力が式3につながる、フィルムの力に等しいと仮定すると方程式。 <img alt="式3" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51866/51866eq3.jpg">式3 </li><li>機能的なデータ収集に続いて、免疫細胞化学分析のためにカンチレバーチップを修正するか、標準的な技術を使用してタンパク質またはDNA分析のために細胞を利用する。 </li><li>必要に応じて、代わりに、後の時点で機能的性能を再評価するために、分子解析のための準備のインキュベーターにセルを返します。 </li></ol>

<ol><li>Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+liberation+of+myogenic+cells+from+adult+rat+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Enzymatic liberation of myogenic cells from adult rat muscle.</a> Anat. Rec. 180, 645-661 (1974).</li>
<li>Yasin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+technique+for+growing+human+adult+skeletal+muscle+in+culture+starting+from+mononucleated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">A quantitative technique for growing human adult skeletal muscle in culture starting from mononucleated cells.</a> J. Neurol. Sci. 32, 347-360 (1977).</li>
<li>Dennis, R. G., Kosnik, P. E., 2nd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitability+and+isometric+contractile+properties+of+mammalian+skeletal+muscle+constructs+engineered+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Excitability and isometric contractile properties of mammalian skeletal muscle constructs engineered in vitro.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 327-335 (2000).</li>
<li>Khodabukus, A., Baar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+electrical+stimulation+emphasizing+excitability+for+the+development+and+testing+of+engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle.</a> Tissue Eng Part C Methods. 18, 349-357 (2012).</li>
<li>Langelaan, M. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+maturation+by+electrical+stimulation%3A+Differences+in+response+between+C2C12+and+primary+muscle+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells.</a> Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5, 529-539 (2011).</li>
<li>Stephenson, G. M., O'Callaghan, A., Stephenson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-fiber+study+of+contractile+and+biochemical+properties+of+skeletal+muscles+in+streptozotocin-induced+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Single-fiber study of contractile and biochemical properties of skeletal muscles in streptozotocin-induced diabetic rats.</a> Diabetes. 43, 622-628 (1994).</li>
<li>Harber, M., Trappe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+muscle+fiber+contractile+properties+of+young+competitive+distance+runners%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology+%28Bethesda%2C+Md%3A+1985%29%22%5BJournal%5D)">Single muscle fiber contractile properties of young competitive distance runners.</a> Journal of applied physiology (Bethesda, Md: 1985). 105, 629-636 (2008).</li>
<li>Hvid, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+days+of+muscle+disuse+impairs+single+fiber+contractile+function+in+young+and+old+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">Four days of muscle disuse impairs single fiber contractile function in young and old healthy men.</a> Experimental gerontology. 48, 154-161 (2013).</li>
<li>Edman, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+performance+of+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Contractile performance of striated muscle.</a> Advances in experimental medicine and biology. 682, 7-40 (2010).</li>
<li>Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+muscle+fiber+contractile+properties+in+adults+with+muscular+dystrophy+treated+with+MYO-029%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029.</a> Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).</li>
<li>Sung, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+mammalian+organ+systems+and+their+integration+into+models+of+whole+animals+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Microfabricated mammalian organ systems and their integration into models of whole animals and humans.</a> Lab on a chip. 13, 1201-1212 (2013).</li>
<li>Wilson, K., Molnar, P., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+functional+myotubes+with+a+Bio-MEMS+device+for+non-invasive+interrogation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Integration of functional myotubes with a Bio-MEMS device for non-invasive interrogation.</a> Lab on a chip. 7, 920-922 (2007).</li>
<li>Wilson, K., Das, M., Wahl, K. J., Colton, R. J., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+contractile+stress+generated+by+cultured+rat+muscle+on+silicon+cantilevers+for+toxin+detection+and+muscle+performance+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Measurement of contractile stress generated by cultured rat muscle on silicon cantilevers for toxin detection and muscle performance enhancement.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li>
<li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Pirozzi, K. L., Long, C. J., McAleer, C. W., Smith, A. S., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+embryonic+skeletal+muscle+myotube+physical+characteristics+with+contractile+force+generation+on+an+atomic+force+microscope-based+bio-microelectromechanical+systems+device%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+physics+letters%22%5BJournal%5D)">Correlation of embryonic skeletal muscle myotube physical characteristics with contractile force generation on an atomic force microscope-based bio-microelectromechanical systems device.</a> Applied physics letters. 103, 83108(2013).</li>
<li>Smith, A., Long, C., Pirozzi, K., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+system+for+high-content+screening+of+neuromuscular+junctions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">A functional system for high-content screening of neuromuscular junctions in vitro.</a> Technology. 1, 37-48 (2013).</li>
<li>Stenger, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coplanar+molecular+assemblies+of+amino-+and+perfluorinated+alkylsilanes%3A+characterization+and+geometric+definition+of+mammalian+cell+adhesion+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Coplanar molecular assemblies of amino- and perfluorinated alkylsilanes: characterization and geometric definition of mammalian cell adhesion and growth.</a> Journal of the American Chemical Society. 114, 8435-8442 (1992).</li>
<li>Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+long-term+in+vitro+tissue+engineered+model+of+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A defined long-term in vitro tissue engineered model of neuromuscular junctions.</a> Biomaterials. 31, 4880-4888 (2010).</li>
<li>Rumsey, J. W., Das, M., Bhalkikar, A., Stancescu, M., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+the+mechanosensory+circuit+of+the+stretch+reflex+arc%3A+Sensory+neuron+innervation+of+intrafusal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering the mechanosensory circuit of the stretch reflex arc: Sensory neuron innervation of intrafusal muscle fibers.</a> Biomaterials. 31, 8218-8227 (2010).</li>
<li>Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+tissue+engineering%3A+A+maturation+model+promoting+long-term+survival+of+myotubes%2C+structural+development+of+the+excitation-contraction+coupling+apparatus+and+neonatal+myosin+heavy+chain+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle tissue engineering: A maturation model promoting long-term survival of myotubes, structural development of the excitation-contraction coupling apparatus and neonatal myosin heavy chain expression.</a> Biomaterials. 30, 5392-5402 (2009).</li>
<li>Das, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+novel+serum-free+cell+culture+model+of+skeletal+muscle+differentiation+by+systematically+studying+the+role+of+different+growth+factors+in+myotube+formation%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 378-387 (2009).</li>
<li>Stenger, D. A., Pike, C. J., Hickman, J. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+determinants+of+neuronal+survival+and+growth+on+self-assembled+monolayers+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Surface determinants of neuronal survival and growth on self-assembled monolayers in culture.</a> Brain research. 630, 136-147 (1993).</li>
<li>Hickman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+pattern+design+for+in+vitro+cellular+networks+using+surface+photochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vacuum+Scienc.%2C+%26+Technology+A%3A+Vacuum%2C+Surfaces%2C+and+Films%22%5BJournal%5D)">Rational pattern design for in vitro cellular networks using surface photochemistry.</a> Journal of Vacuum Scienc., & Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films. 12, 607-616 (1994).</li>
<li>Das, M., Molnar, P., Devaraj, H., Poeta, M., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+and+morphological+characterization+of+rat+embryonic+motor+neurons+in+a+defined+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+progress%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system.</a> Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).</li>
<li>Rumsey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Node+of+Ranvier+formation+on+motor+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro.</a> Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).</li>
<li>Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial+Surface+patterning+of+self+assembled+monolayers+for+controlling+neuronal+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+biomedical+engineering+and+technology%22%5BJournal%5D)">Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior.</a> International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).</li>
<li>Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+human+fetal+spinal+cord+stem+cell+line%2C+NSI-566RSC%2C+and+its+induction+to+functional+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).</li>
<li>Varghese, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+target+for+amyloid+beta+toxicity+validated+by+standard+and+high-throughput+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology.</a> PLoS ONE. 5, e8643(2010).</li>
<li>Natarajan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+cardiomyocytes+on+microelectrode+arrays+as+a+functional%2C+high+information+content+drug+screening+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform.</a> Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).</li>
<li>Davis, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+Cortical+Oligodendrocyte-Embryonic+Motoneuron+Co-Culture%3A+An+Axon-Oligodendrocyte+Interaction+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomaterials+and+tissue%22%5BJournal%5D)">Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model.</a> Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).</li>
<li>Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+In+Vitro+Feed-Forward+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol+Biomater%22%5BJournal%5D)">Engineered In Vitro Feed-Forward Networks.</a> J Biotechnol Biomater. 3, 2(2013).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

細胞収縮の証拠マイクロカンチレバーを分析する重要なステップは、顕微鏡ステージ内のカンチレバーチップの配置、配列内のコーナーカンチレバーの先端がレーザーと光検出器のその後のアラインメントである。これが正確に行われない場合、ソフトウェアは、潜在的にデータ収集中に偽陰性の蓄積につながる、アレイ内の残りのカンチレバーの位置を推定することができません。オペレータは、カンチレバーチップは、レーザー位置を校正する前に、培養皿の底と面一に嘘をついていることを確認するために注意する必要があります。チップは皿に角度で座っている場合には、偏向されたレーザビームの経路を変更し、データ収集を混乱させるであろう。 機能的な空気の表は、データ収集の間、バックグラウンドの振動を相殺するために使用されなければならない。本研究で用いたカンチレバーの厚さが薄い（約4ミクロン）広報収縮活動に対して高い感度をovidesが、振動に対する感度の増加の副作用を有する。オペレータは、バックグラウンドの測定値を減らすために、データの記録中はできるだけハードウェアを中心に移動するように注意する必要があります。段階でのカンチレバーチッ...

ヒトとげっ歯類の両方の供給源からの筋肉細胞のin vitro培養は、何十年も前から可能でした1,2。しかし、標準的なカバースリップ製剤は生化学的評価には有用ですが、細胞の主要な機能出力(収縮性)の分析には役立たないため、細胞の成熟度や性能を評価する手段としての価値はやや限られています。このようなin vitro培養から得られるデータ量を最大化するためには、その機能性能をリアルタイムに評価できる構成で細胞を収容できるシステムの開発を進める必要があります。多数の3次元筋モデルの確立は、このニーズを満たすためにいくらかの進歩を遂げており、そのようなシステムは、in vitroで培養された筋肉細胞の収縮能力を評価する手段として多くの出版物で使用されています3-5。このようなシステムは、組織モデリングや再構築の研究には非常に貴重ですが、シングルセル応答の研究への適用性は限られています。このような場合、単一繊維研究が必要な場合、複雑で労働集約的なex vivo方法論が唯一の選択肢として残っています6-10。さらに、医薬品開発およびスクリーニングプロトコルのための複雑な多臓器プラットフォームの開発に向けた現在の動きは、非侵襲的で、容易に拡張可能で、支持細胞および組織モデルと容易に統合できるシステムの確立を必要としている11。
マイクロスケールのカンチレバーは、単一細胞/細胞の小さな集団12,13の機能的収縮能力を評価するための簡単な方法を提供します。この技術は、改良型原子間力顕微鏡(AFM)技術14に基づいており、レーザーと光検出器システムを使用して、培養筋管収縮活動に応答するマイクロスケールのカンチレバーのたわみを測定します。次に、修正ストーニーの方程式を使用して、筋管内の応力と、観察された基板のたわみ15を生成するために筋管によって加えられる力を計算します。多重化されたカンチレバーアレイの同時評価を可能にするスキャンプログラムが書かれており、薬物毒性/有効性研究15,16のための中程度から高いスループットアプリケーションの可能性を提供しています。このような技術は、in vivoで薬効を予測するための機能的な前臨床アッセイの開発において非常に貴重であることが証明される可能性があります。さらに、シリコンでカンチレバーチップを作製しても、免疫染色、ウェスタンブロッティング、PCRなどの標準的な生体分子アッセイのための細胞の解析後処理が妨げられません。
この原稿は、マイクロスケールのシリコンカンチレバーの製造と調製、ハードウェアとソフトウェアのセットアップ、およびこれらのチップで培養された収縮性細胞の機能を評価するための操作ガイドラインに関する詳細な指示を提供します。標準的な細胞培養技術は、これらの表面上の細胞のプレーティングとメンテナンスに実装できるため、信頼性の高い培養パラメータが存在する収縮性細胞タイプであれば、このデバイスと簡単に統合できるはずです。このシステムで使用される比較的単純な2D培養パラメータは、他の細胞モデルの統合や、筋肉と相互作用できる細胞タイプ(神経支配ニューロンなど)の追加を容易にし、より複雑な機能的なin vitroアッセイや哺乳類システムの多臓器モデルの開発におけるこのモデルの適用性を大幅に向上させます。

<table><tbody><tr><td>初代ラット筋成長培地</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニューロベースル培地</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>1x</td></tr><tr><td>グルタマックス (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>1x</td></tr><tr><td>G5 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17503-012</td><td>1x</td></tr><tr><td>Glial-Derived神経栄養因子</td><td>細胞科学</td><td>CRG400B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>脳由来神経栄養因子</td><td>細胞科学</td><td>CRB600B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>毛様体神経栄養因子</td><td>細胞科学</td><td>CRC400A</td><td>40 ng/ml</td></tr><tr><td>ニューロトロフィン-3</td><td>細胞科学</td><td>CRN500B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>ニューロトロフィン-4</td><td>細胞科学</td><td>CRN501B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>酸性線維芽細胞成長因子</td><td>Life Technologies</td><td>13241-013&nbsp;</td><td>25 ng/ml</td></tr><tr><td>Cardiotrophin-1</td><td>Cell sciences</td><td>CRC700B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>ヘパリン硫酸ヘパリン</td><td>Sigma</td><td>D9809&nbsp;</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>白血病抑制因子</td><td>Sigma</td><td>L5158&nbsp;</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>ビトロネクチン</td><td>Sigma</td><td>V0132</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>一次ラット 筋肉分化培地</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NB Activ 4</td><td>Brain Bits LLC</td><td>NB4-500</td><td></td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クラス 2 赤色ダイオード レーザー</td><td>ニューポート</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光検出器</td><td>ノア インダストリー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ モデル 2100 パルス刺激装置</td><td>A-Mシステム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マルチクランプ 700B デジタイザ</td><td>アクソンインスツルメンツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パッチクランプ顕微鏡とステージ</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デルタ T4 培養皿コントローラ</td><td>バイオテックス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アクソスコープソフトウェア</td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabVIEWソフトウェア</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37oC、5% CO2インキュベーター</td><td>NAPCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Class 2 microbiological flow hood</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes and tips</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

携帯収縮機能を評価するために、マイクロスケールのシリコンカンチレバーの活用体外

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

インビトロアッセイにおける複数の予測と生物学的に関連の開発は、播種した細胞の機能評価を容易にする多目的な細胞培養系の進歩に基づく。そのため、マイクロカンチレバー技術は、曲げ収縮誘発性基板の評価を通じて、骨格筋、心筋、および平滑筋細胞などの細胞型の範囲の収縮機能を測定するためにどのプラットフォームを提供する。多重化されたカンチレバーアレイのアプリケーションは、薬物の有効性および毒性、疾患表現型および進行、ならびに神経筋および他の細胞 - 細胞相互作用を評価するためのハイスループットプロトコルに適度な開発する手段を提供する。この原稿は、この目的のために信頼性の高いカンチレバーアレイを製造するための詳細、およびこれらの表面上に成功裏に培養細胞に必要なメソッドを提供する。さらなる説明は、機能的肛門を実行するのに必要なステップに設けられている新規なレーザーおよび光検出器システムを使用してそのようなアレイ上で維持収縮性細胞型のysis。ハイライトの精度と、このシステム、ならびにこのような技術を適用することができる研究の広い範囲を使用して可能な収縮機能の分析の再現可能な性質を提供した代表的なデータ。このシステムの成功広く採用は、組織のパフォーマンス、疾患の発症および新規治療的処置に対する応答のより正確な予測をもたらす、インビトロで迅速、低コストで機能的研究を実行するための手段を研究者に提供することができる。

カンチレバー上の収縮性細胞の成功した文化は、標準的な細胞培養技術（ 図5）を利用して、比較的簡単な手順です。収縮する細胞を支持するカンチレバーの割合は、細胞型を調べ、特定の培養技術が採用さに依存して変化する。ラット後肢由来の初代胚細胞を使用して、収縮活動を調べカンチレバーの12％で検出された（n = 4）であった。記載レーザーと光検出器システムを使用して収縮機能の分析は、播種された細胞の機能的成熟に関連する正確なリアルタイムデータを提供する。 図7に示すように、標準的な電気生理学的なソフトウェアの使用は、その後、そのようなピーク力、力のピークまでの時間、および半弛緩までの時間などの関連する機能的特性の計算を容易にする、生データを分析するために使用することができる。処理した培養物からのその後のデータ収集治療用化合物とを可能にしと、薬剤を添加しない機能特性の比較をすることにより、化合物の活性及びin vivoでの応答のその後の予測の評価を可能にする。また、拡張された刺激プロトコルは、このように、このシステム（ 図8）から得...

このプロトコルは、 インビトロで筋細胞の収縮性を測定するための柔軟な培養表面としてマイクロスケールのシリコンカンチレバーの使用を記載している。細胞収縮を測定記録し、 インビトロで収縮機能を測定するための非侵襲的かつスケーラブルなシステムを提供し、力の読み取り値に変換することができるカンチレバー屈曲を引き起こす。

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

次の実験の目的は、制御されたin vitro環境で刺激に応答した培養筋線維の収縮活性を測定することです。これは、解離した筋細胞をマイクロスケールのシリコンカンチレバーに播種し、これらの単核細胞の融合を誘導して、ミオチューブと呼ばれる繊維を形成することによって達成されます。分化した筋細胞を支えるこれらのカンチレバーチップは、レーザーと光検出器をサポートするように改造された電気生理顕微鏡に移され、チップをリグに配置した後の筋肉の収縮に応じたカンチレバーのたわみを測定するために使用されます。レーザーは、カンチレバーの先端に焦点を合わせるように配置され、光検出器は、偏向ビームを捕らえるように同様に整列され、電気的または化学的処理に応答した筋肉の収縮によって引き起こされるカンチレバーの偏向の程度を示す結果が得られ、播種された細胞の収縮プロファイルをリアルタイムで直接測定することができる。最終的に、カンチレバー変位を処理して力を読み取ることができます。このシステムは、薬物治療、疾患、状態、または運動プロトコルに応じた収縮機能の変化を評価するための潜在的なハイスループットテストベッドを提供するためにマルチプレックス化されています。パッチクランプ電気生理学などの既存の方法と比較したこの手法の主な利点は、機能分析のためのこの方法が非侵襲的であり、ハイスループット研究に容易に適応できることです。この方法は、臨床評価に先立って適切な用量反応濃度を特定するなど、医薬品開発分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の意味は、さまざまな病理学的表現型からの細胞の機能的パフォーマンスをリアルタイムで調査する手段を提供するため、複数の筋肉疾患の治療にまで及びますが、この方法は骨格筋の病状に関する洞察を提供できます。また、心臓や平滑筋などの他の組織システムにも使用することができます 滅菌済み、事前に準備されたカンチレバーチップ、70%エタノール溶液中の13 Fカバースリップで、フローフード内で風乾させることができます。次に、個々のカンチレバーチップを13Fカバースリップの上に置きます。標準的な12ウェルプレートの内部で、使用する細胞の種類に最適化された生体高分子または表面修飾でカンチレバーをコーティングします 標準的な細胞培養プロトコルによると、表面コーティングは当社の調製方法を使用して30分かかりますが、研究者の特定の培養プロトコルに応じて変更される場合があります。リースは、特定の増殖培地で所望の濃度までの細胞であり、その後、カンチレバーチップ表面に細胞懸濁液の百マイクロリットルを充填し、培地の泡がカンチレバーの窓を完全に覆うことを保証します。チップを含むプレートをインキュベーターに移し、このプレーティング期間後少なくとも1時間細胞を接着させます。滅菌鉗子を使用して、13 Fカバースリップなしでチップを清潔なウェルに移し、それぞれに1ミリリットルの成長培地を追加します。プレートをインキュベーターに戻し、in vitro維持のための標準プロトコルに従って細胞を維持します。カバースリップに、加熱した培養皿を直立した電気生理学顕微鏡のステージに置きます。現在の細胞供給培地の3ミリリットルを加熱顕微鏡に加えます。加熱された培養皿の内側に15mmの分離距離でステンレス製電極をステージマウントします。それらを、フィールド刺激、さまざまな強度、周波数、波形のパルスを生成できるパルス発生器に接続して、システムが必要に応じて細胞のフィールド刺激を生成できるようにします。XY並進ステージに取り付けられたヘリウムネオンレーザーを顕微鏡テーブルの下側にボルトで固定します。次に、レーザービームがカンチレバーの平面に対して30度の角度で加熱された培養皿の底部に向けられるようにレーザーを調整します。次に、XY並進ステージに取り付けられた象限光検出器モジュールが顕微鏡ステージの下側に取り付けられます。反射されたレーザービームが4つの象限の中央に着地するように、その位置を調整します。テキストプロトコルで提供されるフローチャートを参照して、カンチレバーを横切ってスキャンするリニアアクチュエータを制御するソフトウェアプログラムを作成します。カンチレバー解析ハードウェアと関連ソフトウェアの電源を入れます。加熱されたステージを挿入しますtage mrtaを媒体に、摂氏37度を示すのを待ちます。次に、カンチレバーをステージの右側に向けて、カンチレバーチップをステージに挿入します。顕微鏡の光源をオンにします。顕微鏡の焦点を合わせてカンチレバーの端を視野に入れ、レーザー光検出器制御ソフトウェアを使用して、カンチレバーがステージカンチレバーの右側に向けられていると仮定して、レーザービームをカンチレバーの先端に配置します。1 つは配列の左上に配置されているもので、番号は 16 まで続きます。左下にあります。カンチレバー17は右上の位置にあり、32まで走っています。右下の録音ソフトウェアの再生を押します。光検出器を制御するステッピングモーターを調整して、信号がxフレームとyフレームの両方でゼロを読み取るように光検出器を配置します。次に、レーザー光検出器制御ソフトウェアでカンチレバーを1つの位置に設定します。次に、レーザーをカンチレバー16の先端に移動します。光検出器の位置決めを繰り返し、レーザー光検出器制御ソフトウェアでカンチレバー16の位置を設定します。次に、レーザーをカンチレバー32の先端に移動します。光検出器の位置決めを繰り返し、レーザー光検出器制御ソフトウェアでカンチレバー32の位置を設定します。最後に、レーザーをカンチレバー17の先端に移動します。光検出器の位置決めを繰り返し、レーザー光検出器制御ソフトウェアでカンチレバー17の位置を設定します。顕微鏡の光源をオフにしてから、実験室のオーバーヘッドライトをオフにします。録音ソフトウェアの録音を押します。パルス発生器のハードウェアを 40 ミリ秒と 5 ボルトのパルス (周波数は 1 ヘルツ) に設定します。次に、レーザー光検出器制御ソフトウェアを使用して、32カンチレバーアレイ全体をスキャンするようにハードウェアを設定します。それぞれで5秒間停止します。32個のカンチレバーのスキャンが完了したら、刺激装置の電源を切ります。次に、録音ソフトウェアを停止し、データファイルを起動します。各カンチレバーから記録されたトレースを調べます。収縮活動の証拠。収縮はピークとして定義されます。たわみがベースラインより少なくとも0.1ボルト高い場合は、肯定的な応答を持つ各カンチレバーをメモします。レーザー光検出器制御ソフトウェアのスキャンプロトコルから応答しないカンチレバーをすべて取り外します。その後、アクティブカンチレバーを刺激なしで再スキャンして、細胞の自発的な収縮活動を読み取ることができます。次に、培地に治療用化合物を添加して、培養細胞の機能出力に対するその影響を観察します。広視野電気刺激の有無にかかわらず、コンパウンドランスキャンの追加に続いて、細胞を長時間電気的に刺激することで疲労評価を行い、続いて収縮性のスキャンレベルを測定して、ピーク力が特定の閾値を下回るのにかかる時間を測定します。運動ニューロンが筋肉との共培養で維持される実験では、ニューロン刺激剤またはシナプス阻害剤による運動神経筋チューブカンチレバー共培養の治療と、自発的活動の増減をスキャンすることにより、神経筋接合部形成を測定し、テキストプロトコルに詳述されているように、カンチレバーの偏向データの分析に進みます。カンチレバーでの収縮性細胞の培養を成功させるには、標準的な細胞培養技術を使用した比較的簡単な手順です。標準的な電気生理学的ソフトウェアを使用して生データを分析できるため、ピーク力のピーク力までの時間、半緩和までの時間など、関連する機能特性の計算が容易になります。拡張刺激プロトコルは、培養細胞の疲労速度を評価する手段を提供し、したがって、このシステムから得られる生理学的データのレベルを広げます。カンチレバー培養システムは、骨格筋筋管を用いた培養システムに運動ニューロンを含めるように変更することができ、これにより、in vitroでの神経筋シナプス形成の評価が可能になります。このような培養では、自発的な収縮活動の速度が、グルタミン酸などのニューロン特異的刺激剤による治療に応答した収縮の速度と比較されます。観察されたグルタミン酸誘発性収縮率の増加は、アセチルコリン放出につながる培養ニューロンの活性化とその後の筋管活性化を示唆しています アセチルコリン受容体遮断薬、dtu rineなどのシナプス阻害剤による治療 グルタミン酸誘発活性の停止につながる これらの培養物における機能的な神経筋シナプスの存在のさらなる証拠を提供します。このビデオを見れば、マイクロスケールのシリコンカンチレバーを使用して培養骨格筋の機能特性を評価する方法について十分に理解できるはずです。

utilization-microscale-silicon-cantilevers-to-assess-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

ここでは、セルの剛性を測定するために迅速かつ簡単な方法を説明します。このアプローチの一般的な原則は、細胞表面にマイクロピペットを介して適用、明確に定義された負圧に応答して膜の変形を測定することです。この方法は、基板に接続された細胞の生体力学的特性を研究するための強力なツールを提供します。...

セルの剛性を推定するために基板に接続された細胞のマイクロピペット吸引

このビデオでは、ECIS(Electrical Cell-Substrate Impedance...

In VitroでのSMC収縮の測定:電気細胞-基板インピーダンスセンシングを使用して平滑筋細胞の収縮を評価するための非侵襲的方法

新しいイメージングプロトコルは、カスタムモーター駆動の機械式アクチュエータを使用して開発され、生細胞の機械的ひずみに対するリアルタイムの応答の測定を可能にしました。メカノバイオロジーに関連して、このシステムは最大20%のひずみを適用でき、共焦点顕微鏡または原子間力顕微鏡によるほぼリアルタイムのイメージングを可能にします。...

メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング

ここでは、上皮間葉転換を経験した間葉系細胞の収縮機能を評価するためのゲル収縮アッセイの開発と応用について説明します。...

開発<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイは、間葉細胞受けた上皮間葉移行の収縮機能を評価します

機械的な力は、細胞の移動を制御するために重要です。このプロトコルは、ガラスマイクロピペットとマイクロマニピュレータを使用して変形できる弾性ヒドロゲルの使用を示し、細胞構造および移行の変化を引き起こすために局所的な剛性勾配を持つ細胞を刺激する。...

細胞運動と関連するシグナル伝達事象の機械的制御を評価するための単細胞デュロタシスアッセイ

このプロトコルは、皮をむいた心筋細胞を用いた心機能の抽出および評価の技術を段階的に記述することを目的とする。この方法論は、マウスから男性まで、異なる心臓の場所から収集することができる小さな凍結生検を使用して、myofilament機能の測定および急性調節を可能にする。...

皮膚心筋細胞を用いた心機能のインビトロ評価

ここで提示されるプロトコルは、ナノニュートン分解能を有する線条筋筋筋線維の収縮特性を評価する。このプロトコルは、干渉法ベースの光学力プローブを用いたセットアップを採用しています。この設定は、高い信号対雑音比を持つデータを生成し、myofibrilsの収縮運動の評価を可能にします。...

骨格筋生検からミオフィブリルを分離し、ナノニュートン分解力トランスデューサーによる収縮機能を決定する

本稿では、初代患者特異的なヒト大動脈平滑筋細胞および皮膚線維芽細胞を単離および培養するための外植培養ベースの方法について説明する。さらに、細胞収縮の測定およびその後の分析のための新規な方法が提示され、これはこれらの細胞における患者特異的な差異を研究するために使用することができる。...

原発性患者特異的大動脈平滑筋細胞の単離とインビトロでの半定量的リアルタイム収縮測定

この研究は、蛍光タンパク質マイクロパターンの可視化された変位に基づいて単一細胞収縮力の単純化されたハンズオフ定量化のために、マイクロウェルフォーマットで蛍光標識エラストマー収縮性表面(FLECS)技術を利用するための柔軟なプロトコルを提示する。...

マイクロパターンエラストマーを使用したシングルセル収縮性の簡素化されたハイスループット分析

骨格筋機能は、孤立した筋線維の収縮性を定量化することによって評価することができ、従来は面倒で低スループットのアプローチを使用していました。ここでは、ヒドロゲル包埋筋線維の収縮性を定量化するための光学ベースのハイスループット法について説明します。このアプローチは、薬物スクリーニングや治療薬開発に応用されています。...

光学系を用いたヒドロゲル包埋無傷マウス筋線維のハイスループット収縮測定(英語)

ここでは、細胞に対して等方的および一軸のひずみ波形を適用しつつ、基質上で培養を支持し、剛性を調整可能かつタンパク質行列をカスタマイズ可能な新しい装置として紹介します。このシンプルで経済的なプラットフォームにより、研究者は基礎研究から疾患関連の文脈において、機械的な手がかりがどのように細胞機能を調節するかを調査できます。...

in vitro 細胞の伸縮および画像診断のための新しいプラットフォーム

学ぶマイクロスケールシリコンカンチレバーを用いた筋細胞の収縮機能評価法。レーザーと光検出器でカンチレバーのたわみを測定し、電気・化学刺激への応答をリアルタイムで解析する非侵襲的アプローチです。

携帯収縮機能を評価するために、マイクロスケールのシリコンカンチレバーの活用体外

さらに動画を探す