ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

当研究室では、長年にわたりワイヤーミオグラフ法を用いて血管平滑筋の収縮性を測定してきました。この手法を用いて、平滑筋の収縮のメカニズムを研究しています。この手法を用いて、高血圧治療のための新薬を探索しています。

この技術の主な利点は、血管セグメントが取り付け後少なくとも4時間生存し、高カリウムによって誘発される収縮性を何度も維持することです。マルチチャンネルシステムは、新薬の高度な治療スクリーニングの機会を提供します。安楽死させたマウスの体を腹部を上に向けて固定し、腹部を70%エタノールで湿らせます。

次に、ハサミを使用して鼠径部から腹側正中線に沿って皮膚を切った後、最初の切開の開始点から各脚に切開を行います。皮膚を両側で引き戻し、同様の切開を行って腹膜を開きます。次に、はさみを使用して食道、結腸、その他の結合組織を切断し、栄養血管系で胃腸管を体から完全に分離します。

消化管から血液をHEPES-TyrodeまたはH-T溶液で洗い流した後、分離されたセグメントをコーティングされたペトリ皿に移し、室温で腸間膜動脈解剖を行います。胃、空腸、回腸、盲腸を時計回りに滑らかにし、胃と盲腸をそれぞれ左側と右側に固定します。実体顕微鏡の透過型光源をONにし、腸をピンで固定して、解離した腸間膜動脈を露出させます。

次に、鉗子で動脈の周りの脂肪組織を固定し、解剖ハサミですべての結合組織を切り取って動脈を慎重に分離します。鉗子で余分な動脈をつかみ、腸間膜動脈の木を冷たいカルシウムイオンフリーH-T溶液に移して浸します。腸間膜アーケードの腸壁に近位の動脈の1.4ミリメートル部分を切り取り、2つの鉗子を使用してこの動脈セグメントの両側を慎重に開きます。

長さ2.5センチメートルのステンレス鋼線の2つのセグメントを準備し、それらを同じ皿に置きます。鉗子を使用して、動脈の一方の端を優しく固定します。次に、別の鉗子を使用して、2本のワイヤーを動脈の内腔に1本ずつ慎重に挿入します。

ワイヤーがまっすぐに保たれ、内皮に触れないようにしてください。2つの鉗子を使用して、ねじ付き容器の外側に両方のワイヤーを同時にクランプし、容器をペトリ皿からH-T溶液で満たされたミオグラフチャンバーに慎重に移します。チャンバーのジョーをねじ込んで取り付け用のスペースを確保し、挿入された2本のワイヤーの両側を2本の鉗子でつかみ、容器をジョーの隙間に置きます。

クランプされたワイヤーの両側を、マイクロメータに接続されたジョーのネジに巻き付けます。左側のネジを時計回りにひねって固定します。次に、鉗子を使用してワイヤーをまっすぐにします。

次に、右側のネジを時計回りにひねって固定します。血管が常に顎の隙間の内側にあることを確認してくださいが、損傷を避けるために顎に触れないでください。マイクロメータを使用して2つのジョーを閉じます。

2つのジョーが十分に接近しているが、互いに接触していないこと、および固定されていないワイヤーが固定ワイヤーの上にあることを確認してください。右側の鉗子を使用して、フォーストランスデューサーに接続されたジョーの角でネジを緩めたワイヤーを慎重に折り、右側のネジに時計回りに巻き付けます。次に、ネジを固定します。

ワイヤーの左側を広げて巻き付け、左側のネジを固定します。次に、マイクロメーターを慎重に回転させて、2つのジョーの間のギャップが2本のワイヤーにちょうど収まるように、血管を伸ばさずにジョーを少し離します。次に、鉗子を使用して、マイクロメートル側のワイヤーをトランスデューサー側のワイヤーの水平面に移動します。

他のチャンバーに動脈を取り付けた後、すべてのチャンバーを機器に接続し、チャンバーを覆います。100%酸素供給と温度プローブを取り付け、摂氏37度まで加熱を開始します。チャート作成ソフトウェアを開きます。

スタート」ボタンを押して録音を開始します。[DMT] メニューから目的のチャネルを選択して、対応するチャネルの DMT 正規化ウィンドウを開きます。ウィンドウに次の定数値を入力します:組織エンドポイントa1、0.1;組織エンドポイントa2、4;ワイヤー直径、40。

ウィンドウには、計算された容器の長さが 1.40 ミリメートルとして表示されます。適切な組織チャンバーのマイクロメーターを読み取ります。マイクロメーターの読み取りボックスに値を入力し、[ポイントの追加]ボタンをクリックします。

この値は X の初期値で、60 秒の遅延の後、このマイクロメートル値に対応する力と有効圧力がウィンドウに表示されます。同時に、マイクロメーター読み取りボックスがアクティブになります。マイクロメータを反時計回りに回して、正規化されている血管を伸ばします。

マイクロメータの値をマイクロメータの読み取りボックスに入力し、[ポイントの追加]ボタンをクリックします。再度 60 秒の遅延時間待ちます。容器をIC-oneに伸ばすために必要な計算されたマイクロメータ設定であるマイクロメータX-oneの値がウィンドウに表示されるまで、容器を伸ばし、マイクロメータ値を追加し続けます。

マイクロメータをX-one値に設定します。正常化後、チャンバー内で血管を15〜20分間平衡化します。平衡化したら、H-T溶液を5ミリリットルの高カリウム溶液に置き換えて、10分間収縮を誘発することにより、高カリウム溶液で血管に挑戦します。

新鮮な高カリウム溶液で10分間のインキュベーションを繰り返した後、5ミリリットルのH-T溶液で3〜4回洗浄します。再度、収縮を誘発するために5ミリリットルの高カリウム溶液で容器に挑戦します。5分後、0.5マイクロリットルのネオリエンシニンストック溶液をチャンバーに加え、最終濃度の1マイクロモルのネオリエンシニンで血管をリラックスさせます。.

数分後に力が安定したら、さらに0.5マイクロリットルのネオリエンシニン原液を加えて、濃度を2マイクロモルに増やします。毎回1マイクロリットルのストック溶液を添加して、濃度を4、6、8、10マイクロモルに増やし、用量反応曲線を生成します。正規化手順では、IC-100の値に達するまで血管を数回引き伸ばし、各伸ばしたサイクルには、60秒での強力な収縮、急速な緩和、および力の維持が含まれていました。

高カリウム溶液によって誘発される血管平滑筋の収縮は、通常、堅牢な段階と持続的な段階の2つの段階を示しました。我々は、マルチワイヤー筋グラフシステムを用いてマウス腸間膜動脈の等尺性収縮性を測定する方法について説明した。この方法は、血管平滑筋の機能を評価し、平滑筋の弛緩薬をスクリーニングするために使用できます。

この方法と他の方法の主な違いは、取り付け手順にあります。ここで使用するこの手順は簡単に実行でき、組織やデバイスに損傷を与えることはありません。この手順に続いて、EPやアンジオテンシンIIなどの他の刺激装置を使用して平滑筋の収縮を刺激し、このアゴニストに敏感な新薬を見つけることができます。