ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における微小電極アレイおよびパッチクランプ記録の技術的応用

心臓の安全性評価は、医薬品開発プロセスにおける重要な要素です。ヒトiPS細胞由来の心筋細胞は、前臨床心臓安全性評価のための信頼性が高く、効率的なヒトベースのモデルであることが証明されています。ヒトiPS細胞由来心筋細胞の機能特性を網羅的に解明するための方法論を確立しており、疾患モデリング、薬剤性心毒性スクリーニング、精密医療に極めて重要です。

ヒトiPS細胞由来の心筋細胞を標準的な前臨床安全性評価プロセスに組み込むことが増えていることから、候補化合物の毒性予測の精度が向上する可能性があります。まず、ヒトiPS細胞由来心筋細胞を少なくとも10日間培養してから測定を行います。温度コントローラーの電源を入れ、摂氏37度に設定します。

顕微鏡、カメラ、二酸化炭素の供給をオンにします。プレートホルダーのウォータージャケットに適量の滅菌脱イオン水を入れます。96ウェルプレートをプレートホルダーに置き、細胞を少なくとも5分間インキュベートします。

表示ソフトウェアを開き、カメラのフレームレートを 75 フレーム/秒に設定し、ビデオまたは画像の解像度を 1024 x 1024 ピクセルに設定します。オートフォーカスとオートブライトネス機能を適用し、ヒトiPS細胞由来心筋細胞のビデオと画像を記録します。8マイクロリットルの余分な気泡マトリックスコーティング溶液の液滴を、48ウェル微小電極アレイプレートの各ウェルの記録電極領域に注意深く配置します。

次に、コーティング溶液の蒸発を防ぐために、ウェルの周囲に3ミリリットルの滅菌脱イオン水を追加します。200マイクロリットルのピペットチップを使用して、電極に触れることなく、同じ単一列または列内のウェル表面から余分な細胞マトリックス培地のほとんどを除去します。1ウェルあたり50, 000個の細胞を8マイクロリットルの液滴に播種培地の記録電極領域に播種する。

すべてのウェルに細胞が播種されるまで繰り返します。次いで、微小電極アレイプレートを加湿した細胞培養インキュベーター内でインキュベートする。微小電極アレイプレートの各ウェルに150マイクロリットルの播種培地をゆっくりと加える。

めっき後10日目に、自発拍動ヒトiPSC CM単分子膜の密度を顕微鏡で確認した。48穴微小電極アレイプレートを記録装置に入れる。温度が摂氏37度、二酸化炭素が5%であることを確認してくださいナビゲーターソフトウェアを開きます。

実験セットアップウィンドウで、心臓のリアルタイム構成とフィールド電位の記録を選択します。自発的または貼り付けのビート構成を適用します。ビート検出パラメータで、検出しきい値を300マイクロボルト、最小ビート期間を250ミリ秒、最大ビート期間を5秒に設定します。

フィールドポテンシャル期間の計算に多項式回帰を選択します。ベースラインの電気的活動信号が成熟して安定しているかどうかを確認し、ベースラインの心臓活動を1〜3分間取得します。メッキの10日後に記録を行います。

ヒトiPSC CM維持培地をタイロード液に交換し、細胞を15分間順応させます。チャンバーに温度センサーを挿入し、35ミリメートルの皿を中に入れます。温度を摂氏37度に調整します。

マイクロピペットプーラーを使用して、ホウケイ酸ガラスキャピラリーからマイクロピペットを引き出します。マイクロピペットに細胞内溶液を充填し、パッチクランプアンプのヘッドステージに接続されたホルダーに挿入します。集録ソフトウェアを開き、活動電位記録プロトコルをロードして、電圧クランプ構成を選択します。

マイクロピペットを入浴液に挿入し、適切な単一のヒトiPSC CMを選択します。 マイクロマニピュレーターを使用して、選択したセルの横にあるマイクロピペットの位置を調整および下げます。ピペットチップをバス溶液に挿入したら、オシロスコープモニターでピペット抵抗を確認します。

ピペットをセルの近くに配置すると、電流パルスがわずかに減少し、シール抵抗の増加を反映します。負圧で穏やかな吸引を適用して、抵抗を増やします。これはギガシールを形成します。

次に、シール機能を適用します。追加の吸引を適用してメンブレンを破壊し、セル全体の記録構成を取得します。この時点で、電圧クランプモードから電流クランプモードに切り替えるか、アンプダイアログを使用して電流注入なしに切り替えます。

録音ボタンを押して、アクションポテンシャルレコーディングファイルを生成して保存します。めっき後少なくとも10日以内にカルシウム過渡測定を実施してください。新鮮なタイロード溶液とFura-2 AMローディング溶液を準備します。

ヒトiPSC CM維持培地を吸引し、タイロード液でチャンバーを2回洗浄する。100マイクロリットルのFura-2 AMローディング溶液を塗布し、室温で10分間インキュベートします。Fura-2 AMローディング溶液をタイロード溶液と交換し、少なくとも5分間インキュベートして、Fura-2 AMを完全に脱エステル化します。倒立落射蛍光顕微鏡の40倍油浸対物レンズに液浸油を一滴加えます。

セルチャンバーを顕微鏡のステージアダプターに配置します。温度調節器のワイヤーを槽に取り付け、摂氏37度に設定します。電界刺激電極を取り付け、パルスを0.5ミリ秒の持続時間で20ヘルツに設定します。

超高速波長スイッチング光源をオンにし、340ナノメートルおよび380ナノメートルの高速スイッチングモードに設定します。両方の波長で20ミリ秒の露光時間を適用し、記録時間を20秒にします。カルシウム過渡現象のリアルタイム変化を反映したビデオを録画し、分析のためにデータをスプレッドシートにエクスポートします。

ヒトiPS細胞由来心筋細胞単層を収縮運動測定に用いた。アナライザーソフトウェアを用いて収縮緩和運動の痕跡を解析し、収縮開始、収縮ピーク、収縮終了、緩和ピーク、緩和終了を検出した。ヒトiPS細胞由来心筋細胞単層の完全な被覆率が、微小電極アレイプレート内の全ての電極上で観察された。

各電極によって記録された成熟波形は、識別可能な特性を持つ心電界電位を反映しています。解析後、拍動周期、電界電位持続時間、およびスパイク振幅が得られた。電流クランプモードでの全細胞パッチクランプ記録は、単一の心筋細胞の自発的な活動電位を記録しました。

分析後、振幅、最大拡張期電位、および活動電位持続時間を含むいくつかのパラメータが得られた。カルシウムイメージングの分析後、経時的なF340とF380の比率が得られ、刺激されたカルシウム過渡現象の生の痕跡がプロットされました。さらに、振幅、拡張期カルシウム、カルシウム崩壊タウなどのパラメータが得られた。

ヒトiPS細胞由来心筋細胞は、拍動状態の良いものを使用することと、ヒトiPS細胞由来心筋細胞の高純度を確保することが重要です。このプロトコルには、ヒトiPS細胞由来心筋細胞の機能を研究するための4つの特定の技術、他の構成、または心臓で重要な役割を果たす心臓イオン電流を研究するかどうかを自動的に研究するための4つの技術が含まれています。