Why does baseline measurement matter in BLI?

Establishing a stable baseline interferometric response before ligand loading ensures accurate detection of subsequent wavelength shifts during binding events, which is critical for reliable kinetic analysis and target validation decisions.

How does ligand immobilization affect analyte binding detection?

Immobilizing histidine-tagged ligands via Ni-NTA chemistry creates a stable binding surface, allowing analyte binding to be detected as increases in optical thickness and wavelength shift, enabling quantitative interaction measurement.

What does wavelength shift indicate during association and dissociation?

Wavelength shifts during association reflect ligand-analyte binding, while shifts during dissociation reveal complex stability; together, they provide kinetic data essential for assessing target engagement and lead quality.

Why are defined incubation times important in BLI workflows?

Using minimum durations (e.g., 30 seconds for baseline, 120 seconds for association/dissociation) ensures sufficient time for binding equilibrium and dissociation monitoring, improving data reproducibility and cross-team comparability.

What software capabilities are needed to analyze BLI data?

The associated software must record real-time interference patterns, calculate wavelength shifts over time, and generate sensorgrams for kinetic analysis (kon, koff, KD), enabling data-driven decisions in lead identification and target validation.

リガンドと分析物間の相互作用を検出するためのバイオレイヤー干渉法技術

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

0 views • 5:13 min • July 8th, 2025

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バイオ層干渉法(BLI)を使用してリガンドと分析物の相互作用を検出するには、まず、BLI機器マウントに固定された水和光ファイバーバイオセンサーを目的のプログラムに設定することから始めます。

バイオセンサーの先端は、ニッケル-ニトリロ三酢酸、Ni-NTA、基で固定化された生体適合性層でコーティングされています。バイオセンサーの先端をバッファーに沈

めます。

この装置はバイオセンサーに向かって白色光を放射し、内部基準層または光学層と生体適合性層の 2 つの界面から反射されます。反射ビームは、異なる光の波長で建設的または破壊的に干渉します。光検出器は、結果として生じる干渉パターンを検出します。

ベースライン干渉応答測定に続いて、ヒスチジンタグ付きリガンド溶液を追加します。ヒスチジンタグはバイオセンサー上のニッケルカチオンに結合し、先端のリガンドを固定化します。

会合後、放出された白色光は光学層から反射され、生体適合性層は先端で光学的厚さが増加したリガンドで固定化されます。これにより、反射層間の距離が長くなり、干渉パターンシフトと波長シフトが発生します。

チップを洗浄し、結合していないリガンドを取り除きます。ターゲット分析種溶液と一緒にインキュベートします。分析種はリガンドに結合し、先端の光学的厚さをさらに増加させ、波長シフトの増加を引き起こします。

バイオセンサーの先端をバッファーに配置します。チップに固定化されたリガンドからの分析種の解離中の波長シフトを記録します。

時間の経過に伴う波長シフトの変化をモニタリングすることで、リガンドと分析種の間の分子相互作用の研究が容易になります。

BLItzマシンの電源を入れます。本機が本機背面のUSBデータ出力ポートを介してコンピュータに接続されていることを確認します。

コンピュータで、関連するソフトウェアを開き、画面左側の「Advanced Kinetics」をクリックします。ソフトウェアで、それぞれの見出しの下に実験に関するすべての適切な情報を入力します。「バイオセンサータイプ」をクリックし、ドロップダウンメニューから「Ni-NTA」を選択します。各ステップの期間は、必要に応じて [デフォルト] から変更できます。最適な結果を得るには、初期ベースラインとベースラインに最低 30 秒、関連と解離に 120 秒を使用します。

水和したニッケル-NTA-バイオセンサーをPCRチューブから取り外し、バイオセンサーの広い部分をマウントにスライドさせて、マシンのバイオセンサーマウントに取り付けます。

0.5ミリリットルの黒色微量遠心チューブを機械のチューブホルダーに入れ、400マイクロリットルのBLIバッファーをピペットで入れます。バイオセンサーの先端が微量遠心チューブのバッファーに沈むように、機械のカバーを閉じます。ソフトウェアの「次へ」をクリックして、初期ベースラインの記録を開始します。

最初のベースラインステップの記録が終了したら、マシンのカバーを開きます。スライダーを右に移動します。4マイクロリットルの透析されたHisタグ付きリガンドをドロップホルダーにピペットでかけ、機械のカバーを閉じると、自動的にローディングステップの記録が開始されます。

ローディングステップの記録が終了したら、マシンのカバーを開けます。スライダーを左に動かして、チューブホルダーが再び黒い矢印の前に配置されるようにします。機械の蓋を閉め、バイオセンサーの先端がチューブホルダー内のチューブのBLIバッファーに浸されていることを確認します。マシンとソフトウェアは、ベースラインステップの記録を自動的に開始します。

ベースラインステップの記録が終了したら、マシンのカバーを開きます。ドロップホルダーを取り外し、タンパク質をピペッティングし、二重脱イオン水で合計5回すすいで洗浄します。最後の洗浄後、ティッシュワイプを使用してドロップホルダーの表面をきれいにします。ドロップホルダーをマシンに元に戻します。マシンのスライダーを右に動かし、ドロップホルダーが再び黒い矢印の前に配置されるようにします。

4マイクロリットルの透析分析種をドロップホルダーにピペットで入れ、マシンのカバーを閉じると、アソシエーションステップの記録が自動的に開始されます。関連付け手順の記録が終了したら、本機のカバーを開けます。チューブホルダーが再び黒い矢印の前に来るように機械のスライダーを右に動かし、機械のカバーを閉じると、解離ステップの記録が自動的に開始されます。