ヌクレオソームの沈着において、静電結合が重要であるのはなぜですか？

負に帯電したDNAと正に帯電したAPS機能化マイカの間の静電結合により、イメージング中のヌクレオソームの安定した付着が保証されます。この相互作用によりサンプルの変位が防止され、一貫した地形データの取得が可能になります。再現性のあるヌクレオソームの可視化には、適切な電荷相互作用が不可欠です。

APS濃度はマイカ表面の調整にどのように影響しますか？

APS濃度はマイカ表面のアミン基の密度を決定し、表面の正電荷とヌクレオソームの結合能に影響を与えます。プロトコルでは、表面機能化を最適化するために、50 mM APSストック溶液を脱イオン水で希釈した作業溶液を使用することを指定しています。これに反すると、過密状態になるか、あるいはヌクレオソームの接着不良を招く可能性があります。

AFMスキャニングにおいて、カンチレバーのたわみを一定に保つことで何が可能になりますか？

フィードバックループを介してカンチレバーのたわみを一定に維持することで、垂直スキャナーの位置をリアルタイムで調整し、ヌクレオソーム表面の正確なトポグラフィーマッピングが可能になります。これにより、スキャン領域全体でチップとサンプルの間の相互作用力が一定に保たれます。得られた信号は、ヌクレオソームコアが明るい塊として現れ、その両側にDNAアームが伸びている高解像度画像を生成します。

ヌクレオソームの沈殿後、なぜ脱イオン水での洗浄が必要なのですか？

洗浄により、AFMイメージングを妨害したり結晶性のアーティファクトを引き起こしたりする可能性のある、HEPESや塩化マグネシウムなどの未結合のバッファー成分が除去されます。この工程によりバックグラウンドノイズが低減し、トポグラフィーデータの信号対雑音比（S/N比）が向上します。マイカ表面から結合したヌクレオソームが脱離するのを防ぐため、この操作は緩やかに行います。

スキャンサイズの調整は、ヌクレオソームイメージングの解像度にどのように影響しますか？

スキャンサイズを100x100 nmから1x1 μmに拡大することで、512x512ピクセルの解像度を維持したまま、複数のヌクレオソームを含むより広い視野を可視化できます。この調整により、より広いサンプル領域におけるヌクレオソームの分布と形態の統計的解析が可能になります。この移行は、画像の鮮明さを確保するため、初期のチップの接触と振幅の最適化を行った後に行います。

アセンブルされたヌクレオソームを可視化し、特性評価するための静的原子間力顕微鏡

JoVE Encyclopedia of Experiments

生物学的技法

0 閲覧数 • 5:09 分 • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

真核生物のクロマチンの基本的な繰り返し単位であるヌクレオソームは、ヒストンタンパク質のコアに巻き付けられたDNAターンで構成されています。

静的原子間力顕微鏡(AFM)によって組み立てられたヌクレオソームを視覚化するには、表面を正に帯電するように機能化した薄い雲母ストリップから始めます。ストリップを小さな正方形に切ります。組み立てられたヌクレオソーム懸濁液をピペットで移動させます。

ヌクレオソーム内の負に帯電したDNAは、静電相互作用を通じて官能化マイカストリップの正に帯電した基に結合します。ヌクレオソームの過密状態を防ぐために、バッファーで洗浄します。

マイカストリップを試料サポートディスクに固定します。AFM装置ステージに取り付けます。

プローブホルダーを機器の光学ヘッドに取り付けます。ホルダーには、先端が頂点にあるAFMカンチレバーがあらかじめ取り付けられています。

レーザービームをカンチレバーの背面に合わせて、正確なたわみ測定を行います。チップをヌクレオソーム含有表面に直接接触させる位置に配置します。

接触モードイメージング中、カンチレバー先端がヌクレオソーム表面をスキャンすると、先端の原子とサンプル間の相互作用に続いて反発力が発生します。これにより、カンチレバーが曲がります。レーザービームは異なる方法で反射され、位置に敏感な光検出器に向けられます。

フィードバックループは、スキャン中のスキャナーの垂直方向の動きによって、一定のカンチレバーたわみを維持します。このフィードバック信号は、トポグラフィーヌクレオソーム画像を生成するためにさらに使用されます。ヌクレオソームコアは明るい塊として現れ、細い腕が隣接するDNAを表しています。

静的AFMイメージング用のマイカ表面を準備します。これを行うには、まず脱イオン水に50ミリモルのAPS原液を調製します。必要になるまで、溶液の1ミリリットルのアリコートを摂氏4度で保管します。

原液から、50ミリモルのAPS原液50マイクロリットルを15ミリリットルの蒸留脱イオン水に溶解することにより、マイカ修飾用の作業APS溶液を調製します。溶液を混合し、キュベットに溶液を入れます。

次に、高品質のマイカシートから1×3センチメートルのマイカストリップを切り取ります。キュベットに斜めに置いたときにピースが収まることを確認してください。次に、両面が新たに切断され、ピースが0.1ミリメートルほど薄くなるまで、雲母の層を切断します。

すぐに雲母片をAPS充填キュベットに入れ、マイカを30分間インキュベートします。マイカ片を蒸留脱イオン水で満たされたキュベットに移し、30秒間浸します。次に、アルゴンを使用してAPS-マイカストリップの両面を完全に乾燥させます。

いくつかの磁気パックに両面粘着テープを貼り、横に置きます。次に、APS-マイカ基板を1センチメートル×1センチメートル四方にカットし、きれいなペトリ皿で覆います。次に、pH7.5で10ミリモルのHEPESと4ミリモルの塩化マグネシウムを含む0.22ミクロンのろ過バッファーを使用して、組み立てたヌクレオソームの3つの希釈液を調製します。

低い最終濃度でのヌクレオソームの損失を制限するには、APS-雲母への堆積の直前に、希釈を一度に1つずつ行う必要があります。

APS-雲母片の中心に各ヌクレオソームサンプルを5〜10マイクロリットル沈着させ、2分間インキュベートします。次に、サンプルを2〜3ミリリットルの蒸留脱イオン水で優しくすすぎ、緩衝成分を除去し、堆積したサンプルをアルゴンの軽い流れで乾燥させます。

まず、AFMセットアップのチップホルダーにチップを取り付けます。次に、サンプル表面に接触しないように注意しながら、最初のサンプルをAFMステージに取り付けます。合計が最大になるまでカンチレバーの上にレーザーを置き、垂直方向と横方向のたわみの値を 0 近くに調整します。次に、AFMプローブを調整して共振周波数を見つけます。ドライブの振幅を調整し、画像サイズを100 x 100ナノメートルに設定します。設定が完了したら、[エンゲージ] ボタンをクリックしてアプローチを開始します。

アプローチが完了したら、サンプルの表面がはっきりと見えるまで振幅設定値を徐々に最適化します。次に、スキャンサイズを 1 ミクロン x 1 ミクロンに増やし、解像度を 512 x 512 ピクセルに増やします。最後に、 キャプチャ ボタンをクリックして画像取得を開始します。