アセンブルされたヌクレオソームを可視化し、特性評価するための静的原子間力顕微鏡

真核生物のクロマチンの基本的な繰り返し単位であるヌクレオソームは、ヒストンタンパク質のコアに巻き付けられたDNAターンで構成されています。

静的原子間力顕微鏡(AFM)によって組み立てられたヌクレオソームを視覚化するには、表面を正に帯電するように機能化した薄い雲母ストリップから始めます。ストリップを小さな正方形に切ります。組み立てられたヌクレオソーム懸濁液をピペットで移動させます。

ヌクレオソーム内の負に帯電したDNAは、静電相互作用を通じて官能化マイカストリップの正に帯電した基に結合します。ヌクレオソームの過密状態を防ぐために、バッファーで洗浄します。

マイカストリップを試料サポートディスクに固定します。AFM装置ステージに取り付けます。

プローブホルダーを機器の光学ヘッドに取り付けます。ホルダーには、先端が頂点にあるAFMカンチレバーがあらかじめ取り付けられています。

レーザービームをカンチレバーの背面に合わせて、正確なたわみ測定を行います。チップをヌクレオソーム含有表面に直接接触させる位置に配置します。

接触モードイメージング中、カンチレバー先端がヌクレオソーム表面をスキャンすると、先端の原子とサンプル間の相互作用に続いて反発力が発生します。これにより、カンチレバーが曲がります。レーザービームは異なる方法で反射され、位置に敏感な光検出器に向けられます。

フィードバックループは、スキャン中のスキャナーの垂直方向の動きによって、一定のカンチレバーたわみを維持します。このフィードバック信号は、トポグラフィーヌクレオソーム画像を生成するためにさらに使用されます。ヌクレオソームコアは明るい塊として現れ、細い腕が隣接するDNAを表しています。

静的AFMイメージング用のマイカ表面を準備します。これを行うには、まず脱イオン水に50ミリモルのAPS原液を調製します。必要になるまで、溶液の1ミリリットルのアリコートを摂氏4度で保管します。

原液から、50ミリモルのAPS原液50マイクロリットルを15ミリリットルの蒸留脱イオン水に溶解することにより、マイカ修飾用の作業APS溶液を調製します。溶液を混合し、キュベットに溶液を入れます。

次に、高品質のマイカシートから1×3センチメートルのマイカストリップを切り取ります。キュベットに斜めに置いたときにピースが収まることを確認してください。次に、両面が新たに切断され、ピースが0.1ミリメートルほど薄くなるまで、雲母の層を切断します。

すぐに雲母片をAPS充填キュベットに入れ、マイカを30分間インキュベートします。マイカ片を蒸留脱イオン水で満たされたキュベットに移し、30秒間浸します。次に、アルゴンを使用してAPS-マイカストリップの両面を完全に乾燥させます。

いくつかの磁気パックに両面粘着テープを貼り、横に置きます。次に、APS