微小血管血栓形成を研究するための生体内蛍光顕微鏡

生体内蛍光顕微鏡は、微小血管損傷部位での血栓(血栓)の形成の光毒性誘導を研究するのに役立ちます。

まず、麻酔をかけた無毛マウスに光毒性蛍光色素標識多糖類を注射します。マウスを加熱台の上に腹臥位に置き、適切な血液循環のために生理学的温度を維持します。

耳の頂端部分を生体内蛍光顕微鏡下に置きます。光で励起されると、蛍光色素は蛍光を発し、微小血管の血流を監視できます。光の強度を上げて血栓形成を誘発します。

蛍光色素は高強度の光を吸収し、酸素分子と反応して活性酸素種を生成します。これらの分子は内皮細胞に酸化ストレスを引き起こし、細胞の損傷と内皮下マトリックスの露出を引き起こします。

損傷した細胞は、内皮下マトリックスと循環血小板の露出したコラーゲンを橋渡しする血栓性メディエーターを放出し、特定の受容体を介してメディエーターに結合します。

結合により血小板が活性化され、他の循環血小板を活性化して損傷部位に動員するエフェクター分子が放出されます。循環フィブリノーゲンタンパク質は、活性化された血小板のフィブリノーゲン受容体に結合し、それらを結合して血小板プラグを形成します。

制限された血流を視覚化して、血栓形成の主要なステップである血小板栓を確認します。

動物を実体顕微鏡下のプラットフォームに置きます。10倍の倍率を使用します。右耳の顕微鏡検査では、最初に首の皮膚に頭尾方向に5ミリメートルの切開を行って、左頸静脈を準備します。次に、マイクロ鉗子とマイクロハサミを使用して皮下組織を解剖します。次に、血管に触れずに静脈を外膜から解放します。

次に、蛍光色素の注射に事前に準備したインスリン注射器を使用します。静脈に穴を開けずに、マイクロ鉗子で血管壁を慎重につかみます。注射器の針で膨張した血管壁を貫通し、FITC-デキストランを静脈内注射します。針を抜き、綿棒で出血を止めます。耳の血液や染料の汚染を避けてください。

加熱プレート上の動物を、加熱プレート用のスロットと耳を配置するための高さ0.5センチメートルの平面を備えた先端ガラス構造に移します。絆創膏を使用して、動物を加熱プレートの上で腹臥位に固定します。凸軟骨を耳の平面の横の耳の付け根に置き、耳の頂端部分を平面上に平らに配置できるようにします。先端ガラス板に室温のアクアを1滴加えます。綿棒を使用して、アクアの滴を吸収し、毛細管現象の力で耳面を先端ガラスに取り付けます。

骨が耳介に凸状の形状を与えているにもかかわらず、耳介はできるだけ平らに配置する必要があります。したがって、耳介のより柔軟な遠位部分のみを先端ガラス板に配置する必要があります。凍結染料の組織損傷や血管外漏出を避けるために、鉗子で耳にできるだけ触れないようにしてください。

次に、耳の凸状の背側にアクアを1滴加えます。耳に入る基底血管を圧迫せずに、カバーガラスを1つ慎重に耳に置きます。綿棒を使用してカバーガラスの下からできるだけ多くのアクアを取り除き、カバーガラスと耳のターゲット血管の間の距離を最小限に抑えます。

FITC-デキストランの視覚化のために生体内蛍光顕微鏡を調整することから始めます。準備した動物を生体内蛍光顕微鏡の机に移します。5倍、10倍、20倍の倍率と20%の光強度を使用して、直径50〜60ミクロンで順行性血流のある静脈血管を探します。

カバーガラスに室温の水を1滴加え、63倍の対物レンズを水に浸します。水滴を適用した直後に、直径と血流のベースライン評価のために血管を 20 秒間記録し始めます。FITC-デキストランの注射の5分後に血栓導入を開始します。この目的のために、光の強度を100%に上げます。

光毒性血栓誘導中は、30秒以内に顕微鏡の開口部を2秒間閉じて、血流の閉塞を確認します。血流が続く場合は、再度開口部を開けてください。血管は、流れが30秒以上静止している場合、または血流が逆行している場合、閉塞していると分類されます。FITC-デキストランの注射後 1 時間以内に耳あたり 5 つの血管を選択して閉塞します。