無菌実験技術：めっき法

[ナレーター] このプロトコルは、細菌やファージなどの微生物を単離、増殖、または計数するために使用されるプレーティング方法に無菌技術を組み込んでいます。手順には、単一コロニーを単離するためのストリークプレーティング細菌培養が含まれます。メッキを注いで細菌の濃度を測定します。そして、生存可能な細菌コロニーを列挙するためにプレーティングを広げます。ソフト寒天オーバーレイは、ファージを単離し、プラークを列挙するために使用されますが、同一の空間パターンで細胞をあるプレートから別のプレートに転移させます。最終的に、微生物を培養するためのこれらの技術の実用化は、環境中の細菌の同定から、分子遺伝学やハイスループットバイオアッセイの技術的進歩まで多岐にわたります。

- 一般に、これらのめっき方法を初めて使用する人は、操作が非滅菌表面との接触を避けて慎重かつ協調的な動きを必要とするため、苦労するかもしれません。これらの日常的な手順を学ぶには、トレーニングと練習が必要です。手順のデモンストレーションは、私の研究室コーディネーターであるクリス・レディ博士です。

- [ナレーター] バイオハザードの分類、廃棄物の除染、処分などの実験室の規則と安全上の注意事項を知って、微生物を扱う作業を開始します。プレーティング手順用のすべての器具、溶液、および培地が無菌であることを確認します。また、明確なワークスペースを確立します。消毒液で洗浄してください。ガスラインにチューブを取り付けたブンゼンバーナーをセットアップし、適切なラベルが貼られた材料で必要な消耗品を配置します。消毒石鹸とぬるま湯で手をよく洗ってください。まず、温かい流水で手を濡らし、石鹸を塗布して完全に分配します。親指、指の甲、手の甲、爪の下など、あらゆる表面に摩擦を発生させる手を激しくこすります。次に、よくすすぎ、残留石鹸を取り除き、ホルダーから取り出したペーパータオルを使用して乾かします。最後に、新しいペーパータオルで蛇口を閉めます。ストリークプレート手順は、単純な機械的分離によって、細菌またはコロニーの純粋な培養物を混合集団から分離するように設計されています。摂氏4度のコールドボックスから寒天プレートを取り出し、室温に予熱します。プレートをストリークするための器具の配列からツールを選択します。蓋に結露がなく、プレートが乾いていることを確認してください。寒天プレートの底の端にラベルを付けます。習熟したら、複数のサンプルに1つのプレートを使用します。次に、ブンゼンバーナーに火をつけて金属ループに火をつけます。ブンゼンバーナーの炎の最も熱い部分である青い円錐の先端にワイヤーを挿入して、金属ループから3〜4インチから始めます。金属が赤熱になったら、炎がループに近づくようにワイヤーを動かします。ループを冷却するには、寒天培地の端に触れてジュージューという音を立てます。ループ上の接種物を拾い続けます。プレートの下半分を持ち上げます。ループをプレートの第1象限のリムから中央まで前後に動かします。逆さまのプレートを蓋に戻します。金属ループを再燃焼します。シャーレを90度回転させます。前後のパターンを使用して最後のストリークの終わり近くのループをタッチし、第 1 象限のストリークの後半を交差させてから、空の第 2 象限に移動します。第2象限がいっぱいになったら、プレートを置きます。第 1 象限との接触を避けながら、第 3 象限と第 4 象限のストリーキング手順を繰り返します。滅菌された平らなつまようじで縞模様を描く場合は、親指と薬指の間で狭い端を培地に対して10〜20度の角度でそっと持ち、幅の広い端を使用して象限に縞模様を描きます。プレートを象限の間の蓋に戻し、つまようじを適切に廃棄します。縞模様のプレートを逆さまにインキュベートします。注ぎ口の手順は、単一のプレートの表面および寒天内のコロニー形成ユニットの総数を列挙します。タイマーを10分間設定し、18ミリリットルの溶融寒天培地を摂氏55度のウォーターバスから摂氏48度のヒートブロックに移し、10分間平衡化します。滅菌シャーレの底にラベルを付けます。該当する場合は、希釈係数を含めます。次に、1ミリリットルのサンプルをシャーレの中央に分配します。ふたを閉めます。溶かした寒天のチューブからキャップを外し、開いたチューブの縁を炎に通します。寒天をシャーレに慎重に注ぎます。蓋を閉め、プレートをそっと回転させてサンプルを寒天と混合します。寒天が固まるまで30分間待ちます。寒天が固まったら、プレートを裏返して暖かい部屋に置きます。スプレッドプレーティングは、少量のサンプルに含まれる微生物を分離し、得られたコロニーを寒天表面全体に均一に分散させることを目的としています。プレートを室温に平衡化し、適切にラベルを付けます。プレートをターンテーブルに置きます。0.1ミリリットルのサンプルを寒天の中央にピペットで入れ、蓋を閉めます。チップを廃棄物容器に排出します。金属棒をスプレッダーの底部全体と茎の最初のインチを覆う70%エタノールのビーカーに浸し、水気を切ります。ブンゼンバーナーの炎を通して余分なエタノールに点火します。次に、寒天プレートの蓋を開け、縁近くの端に沿って寒天に触れてスプレッダーを冷却します。ターンテーブルをゆっくりと回転させます。スプレッダーを寒天の表面にそっと持ち、ターンテーブルが回転している間、前後に動かしながらサンプルをプレート全体に徐々に均等に広げます。蓋を閉め、サンプルが少なくとも5分間完全に吸収されるまで待ちます。次に、逆さまのプレートをインキュベートします。まず、寒天プレートに適切にラベルを付けます。寒天プレートの蓋を開けます。次に、滅菌済みのガラスビーズの容器を開き、縁を炎上させます。寒天プレートに10〜12個の滅菌ガラスビーズを慎重に分注します。キャップを元に戻す前に、プレートの蓋を閉め、ガラスビーズ容器の縁を炎上させます。次に、サンプルを寒天の中心にピペットで移します。水平方向に、寒天の表面を横切ってビーズを7回そっと振ってください。適切に行えば、手順はマラカスを振るような音になります。プレートを60度回転させ、もう一度水平に7回振る。もう一度、プレートを60度回転させ、振ることを繰り返します。サンプルが吸収されていることを確認します。次に、汚染されたビーズを、10%塩素系漂白剤を含むマークされたコレクションビーカーに注ぎます。逆さまのプレートをインキュベートします。プラークアッセイは、細菌ファージの検出と定量に一般的に使用されます。指標菌を指数関数的に培養し、氷上に保管します。次に、2本の滅菌微量遠心チューブのファージとコントロールに標識し、それぞれ50マイクロリットルのファージサンプルまたはバッファーをそれぞれ添加します。次に、フラスコ内で細菌培養物を旋回させ、細菌のアリコートを滅菌チューブに移し、指示細菌を穏やかに渦にさらし、各吸収チューブに500マイクロリットルの細菌を加えます。チューブをそっとフリックして混ぜます。ファージサンプルをボルテックスしたり、激しくピペットしたりしないでください。ファージ細菌混合物を指示薬株に適した温度で20分間インキュベートします。その間、2本の柔らかい寒天チューブを摂氏55度のウォーターバスから摂氏48度の加熱ブロックに移します。10分間平衡化します。室温に事前に平衡化された2つの結露のない栄養硬寒天プレートにラベルを付けます。ヒートブロックから柔らかい寒天チューブを取り外し、内容物が熱すぎて触れられないことを確認します。次に、混合物をファージ吸収チューブから軟寒天チューブに無菌的に移します。次に、手のひらをすばやく回転させて内容物を混ぜます。チューブを片手に持って、もう一方の手で硬い寒天プレートの蓋を開けます。すぐにチューブの内容物全体を硬い寒天プレートの表面に注ぎます。プレートを素早く優しく揺らします。蓋を閉め、柔らかい寒天が固まるまでプレートを水平に30分間置きます。次に、対照混合物を柔らかい寒天チューブに移すことにより、対照吸収チューブの手順を繰り返します。それを混ぜ合わせ、中身を硬い寒天プレートに注ぎ、それを揺らし、柔らかい寒天を30分間固めます。プレートにプラークが形成されていないか検査します。不均一な混合物からプラークを分離するには、滅菌つまようじで中心を慎重に打ち抜き、接種物を100マイクロリットルのファージバッファーを含む滅菌微量遠心チューブに移します。必要に応じて、連続希釈でプラークアッセイを3〜6回繰り返すことにより、このライセートの精製を続けます。レプリカプレーティングは、一次プレート上の細胞増殖と二次プレートの比較を可能にすることにより、選択可能な表現型を利用します。プレートの底面にグリッドをマークし、プライマリプレートにラベルを付けて、結果の正方形に番号を付けます。次に、無菌技術を使用して、事前に滅菌されたつまようじをビーカーから取り出し、各正方形の中心に細胞サンプルを軽くたたき、つまようじを適切な廃棄物容器に廃棄します。プライマリプレートをインキュベートします。プライマリ プレートとすべてのセカンダリ プレートを積み重ねます。プレートの下半分の側面に方向マークを付けます。次に、滅菌した別珍の布を包装紙から取り出し、円筒形のブロックの上に置きます。次に、ホルダーのマークをブロックのマークに合わせてホルダーを置きます。ブロックとホルダーの向きマークに注意してください。次に、プライマリープレートから蓋を外します。プレートとブロックの向きマークを揃えます。寒天の表面が別珍布に接触するようにプレートを下げます。指先を使用して、プライマリプレートの背面を軽く均等に押し下げ、慎重にブロックから持ち上げます。ベルベットに細胞の痕跡が見えることを確認します。プレートの蓋を元に戻します。次に、各二次プレートで別珍の布でプロトコルを順番に繰り返します。一次プレートからの細胞のベルベット印象を使用して、最も好ましくない基質から最も好ましい基質の順に最大8つの二次プレートを接種します。最後に、ポジティブコントロールとして、シリーズの最後のプレートには、テストされたすべての菌株が成長する必要がある寒天培地を使用します。逆さまのプレートをテープで貼り付けてインキュベートします。二次プレートの成長を検査します。ブンゼンバーナーの電源を切り、すべての消耗品を片付けます。汚染されたラボウェア、ガラス製品、有害廃棄物を適切な廃棄容器に入れます。消毒剤で作業エリアを清掃します。最後に、消毒石鹸とぬるま湯で手をよく洗います。Serratia Marcescensは、プロディギオシンと呼ばれる赤みがかった色素を生成するグラム陰性の棒状のプロテオバクテリウムです。バスルームやシャワーカーテンによく生えています。この例では、ストリークプレート技術は、第4象限に単一のコロニーを生成します。公共の水飲み場から採取した水サンプルに含まれる細菌のこの分析では、Pour Plate 技術が使用されています。コロニーの外観の違いに注目してください。表面コロニーは大きく円形ですが、一部の表面コロニーは非常に小さく、不規則な形状です。スプレッドプレート技術は、濃縮、選択、およびスクリーニング実験において重要な要素です。たとえば、コパカバーナ法は、組換え DNA 技術における古典的な青白画面における差別化ツールです。ファージ T4 は、宿主を大腸菌として感染させて子孫ファージを溶解して放出する、毒性のある二本鎖 DNA ファージです。EHA寒天培地でのこのプラークアッセイは、直径約1ミリメートルのクリアリングゾーンにファージを示します。ファージ粒子に感染しない場合、細菌の増殖により、個別のコロニーが見えない軟寒天に細胞が濁ります。軟寒天オーバーレイ技術では、プラークの形態は異なります。たとえば、ここでは、同じマイコバクテリウム宿主株が、微生物ファージ破壊者とマイコバクテリアファージMSSSの存在下で異なるプラーク形態を生成します。レプリカめっきの力は、多数の微生物を同時にスクリーニングすることにあります。この場合、4つのシュードモナス株が3つの異なる炭素源での増殖について2回にテストされました。アセトアミド、乳糖、グリシン。ここで、一次プレートは、示されているように4つの株を接種した完全なYTA培地です。これらの菌株は、単一の炭素源アセトアミド、ラクトース、またはグリシンを添加した最小MSA培地のレプリカプレート上でさまざまな増殖パターンを示します。すべての株は最後のポジティブコントロールプレートで増殖し、細胞がこのシリーズのすべての二次プレートに移されたことを確認します。これらのレプリカプレート結果の表には、特徴的な成長要件について、さまざまな野生型株の同時スクリーニングが詳細に記載されています。

- このビデオを見た後、培地や培養物を汚染することなくプレーティング手順を実行する方法と、実験室での特定の実験タスクに適切なプレーティング方法を使用する方法をよく理解できるはずです。これらのテクニックに習熟するには練習が必要です。ただし、適切なトレーニングを行えば、このビデオで説明されているめっき手順は、実験台で作業するときに自然に習得されます。