フローサイトメトリーを用いて細胞外小胞の分析のための技術

この手順の全体的な目的は、2つの異なる手法を用いて血液中の細胞外小胞の循環を単離し、分析することです。個別の細胞外小胞検出法では、まず血液サンプルから血小板減少血漿（PPP）を単離します。

次に、PPPを目的の蛍光色素標識抗体で染色します。ビーズベースの検出法では、細胞外小胞をビーズと共にインキュベートし、その後、ビーズに結合した小胞を適切な蛍光色素標識抗体で染色します。最終的に、フローサイトメトリーによるサンプルの解析によって、血中細胞外小胞の内容を決定できます。

電子顕微鏡や磁気ビーズ分離などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、所要時間が大幅に短縮され、特定のサブポピュレーションに限定されることなく、細胞外エキソソーム（extracellular vesicle）の全集団を評価できる点にあります。一般的に、本手法に不慣れな方は、操作の習得に苦労することがあります。なぜなら、本手法を成功させるには、実演された操作手順とサイトメーターの設定パラメータを厳格に遵守する必要があるためです。日々の変動を最小限に抑え、高品質なデータを得るためには、まず全血サンプルを遠心分離し、血漿をバフィーコートおよび赤血球から分離させます。次に、血漿上清を1.2 mLずつ1.5 mL遠心チューブに分注します。この際、バフィーコートと赤血球を含む底層を乱さないよう注意してください。その後、上清を再度遠心分離し、血小板および大きな細胞断片を除去します。

遠心分離後、ペレットを乱さないように注意しながら、PPPサンプルの最後の200 µLを除くすべてを新しいチューブに慎重に移します。次に、血漿を数回ピペッティングして混合し、各サンプル320 µLを96ウェルプレートの上段に移します。サンプルを染色するため、3つのパネルそれぞれについて目的の抗体を個別の0.22 µm遠心フィルターチューブにまとめ、固定角単一速度遠心機を用いて抗体を遠心分離します。

抗体がすべてフィルターを通過したら、図に示すように、混合物を適切な量ずつ96ウェルプレートの各ウェルに分注します。次に、マルチチャンネルピペットを用いてPPPサンプルを混合し、各サンプルの100 µLを2行目の抗体が分注されたウェルに移します。その後、サンプルを再度混合し、チップを交換して、必要に応じて次の2行の各抗体ウェルにサンプルの100 µLを移します。

実験の手順は以下の通りです。バイオセーフティキャビネット内で、各ウェルに220 µLのPBSを添加し、6行目から8行目までを22°Cで30分間静置した後、4°Cでインキュベートします。次に、幅調整可能なマルチチャンネルピペットを用い、チップを交換せずに、各ウェルの内容物を対応する遠心フィルターチューブに移します。

洗浄用行のいずれかから200 µLのPBSを使用し、サンプルを回収した直後のウェルをすすぎます。次に、このすすぎ液を、以前にPPPサンプルを加えたのと同じフィルターに移し、遠心フィルターを閉じます。染色したすべてのPPPサンプルとそのすすぎ液の移送が完了したら、固定ローター遠心機でサンプルを遠心分離します。

遠心分離後、フィルターの上に液体が残っていないことを確認します。次に、フィルターの上部を 300 µL の PBS で再懸濁し、再懸濁した内容物をあらかじめラベルを貼ったチューブに移して、直ちにフローサイトメトリー分析に供します。遠心フィルターを用いて染色サンプルを洗浄することで、バックグラウンドと陽性マーカー信号との分離が向上します。

ただし、エクソソームを含む一部の小さな細胞外小胞は、フィルターの孔を通り抜けて失われる可能性があることに注意してください。サンプルを解析するには、まず、前方散乱光および側方散乱光の電圧パラメータを対数スケールに設定し、各パラメータについてサイトメーターで許容される最低しきい値を選択します。次に、0.22 µmでろ過したPBSのチューブを流しながら、バックグラウンドノイズの大部分を除去できる最大値になるように、これらの電圧を調整します。続いて、1 µm以下のビーズ混合液を含むチューブを流し、前方散乱光対側方散乱光プロットにおいてビーズ集団を囲むゲートを設定し、1 µmビーズ以下のすべてのイベントをキャプチャします。

次に、サイトメーターのフローレートを「low」に設定し、ビーズを用いてフローレートダイヤルを調整し、目的のイベントレートに設定します。その後、PBSで希釈したレインボー蛍光粒子が入ったチューブを使用し、5,000イベントを計測して、前方散乱光（forward scatter）、側方散乱光（side scatter）、および各カラーチャンネルの平均輝度値を記録します。すべてのパラメータが設定されたら、各サンプルを正確に1分または2分間計測します。各チューブの1回目の計測が完了した後、10% MP 40を20 µLずつ各サンプルに混ぜ、同時間分だけ再度計測し、溶出したサンプルにおいて同時間内に検出された陽性イベントを差し引けるようにします。

ビーズベースのキャプチャーにより細胞外小胞を検出するには、まずコーティングされていない6 µmポリスチレンビーズをRPMI培地で2回洗浄し、続いて同培地2 mLで再懸濁します。次に、新しいファラックスチューブにそれぞれ6,000個のビーズを加え、陰性対照チューブには400 µLの培地を、その他のチューブには200 µLのPPPまたは適宜超遠心分離した細胞外小胞と200 µLの培地を加えます。各チューブの最終容量を400 µLに調整します。

さらに培地を加えます。チューブをシェーカーに入れ、4 °Cで一晩インキュベートします。翌朝、ビーズを2 mLの培地で洗浄します。

上清を吸引し、400 µLの5%牛血清アルブミンを用いて非特異的結合をブロックした後、シェーカーを用いて4 °Cで3時間静置します。3時間後、ビーズをさらに2 mLの培地で洗浄し、ペレットを100 µLの新鮮な培地に再懸濁します。次に、抗体をろ過し、ろ過した抗体カクテルを適切な量ずつ各チューブに加えます。その後、4 °Cで30分間静置し、ビーズをさらに2 mLの培地で洗浄します。

今回、ペレットを400 µLの培地で再懸濁し、直ちにフローサイトメトリーでサンプルを分析します。その際、前方散乱光および側方散乱光のパラメータを、先ほど実演したように、フローサイトメーターで設定可能な最低しきい値に調整してください。最後に、シングレットビーズ集団をゲートし、1サンプルあたり2000イベントを収集します。これらのドットプロットに示されているように、個別の検出法とビーズを用いた検出法の両方で、PPPサンプル中の細胞外小胞の存在を検出できます。個別検出アッセイでは、溶出コントロールを用いて、対応する非リストサンプルのゲートを設定します。

ほとんどのイベントが細胞外小胞（extracellular vesicle）ゲート内に収まるはずです。例えば、この図のバイパラメータープロットでは、細胞上に共存することが知られている2つの赤血球マーカー、CD 1 0 8 AおよびCD 2 35 Aの検出が示されています。予想通り、細胞外小胞における陽性イベントの半数以上が両方のマーカーに対して陽性となっています。一方で、これらのバイパラメータープロットにおいて、細胞上で共存しないことが知られている2つのマーカーの細胞外小胞における発現は、ビーズベースの検出法を用いることで、明確に分離した陽性集団として示されています。

陽性集団と陰性集団の間に分離は見られず、イベントはダブルポジティブの領域に現れます。これは、2種類の細胞外小胞の両方が単一のビーズに結合するためであり、通常は同じ細胞型に共存しないものであっても同様です。したがって、この手法によるデータは、陰性コントロールのデータを重ね合わせたヒストグラムを用いて解析するのが最適であり、習得すれば、コントロールと比較してビーズを用いたサンプルでマーカー発現の明らかなシフトが観察されます。この技術を適切に実施すれば、個別の検出法では3〜4時間で、ビーズ法では1.5日で、3つの抗体パネルを用いて12検体の血液サンプルを解析することが可能です。

この手順を行う際は、各サンプルの取り扱いを統一することが重要です。特に、複数日にわたって多数のサンプルを測定する場合、各実験の開始時にサイトメーターのフローレートと蛍光強度が前日の実験設定と一致するように正しく調整されているかを確認してください。