フローサイトメトリーを用いて細胞外小胞の分析のための技術

この手順の全体的な目標は、2つの異なる方法で血液中の細胞外小胞循環を分離および分析することです。個々の細胞外小胞検出法に。血小板の乏しい血漿またはPPPは、最初に血液サンプルから単離されます。

次に、PPPを目的の蛍光色素標識抗体で染色します。ビーズベースの検出法では、細胞外小胞をビーズとインキュベートし、次にビーズ結合小胞を関連する蛍光色素標識抗体で染色します。最終的に、循環する細胞外小胞含有量は、フローサイトメトリーによるサンプルの分析によって決定できます。

電子顕微鏡法や磁気ビーズ分離法などの既存の方法と比較した場合、この手法の主な利点は、はるかに高速で、特定の亜集団に限定されるのではなく、細胞外エスカル集団全体の評価を可能にすることです。一般的に、この方法に不慣れな個人は、この方法の成功は、実証された操作とサイトメーターのセットアップパラメータに厳密な遵守を必要とするため、日々の変動を最小限に抑えて高品質のデータを生成するために、全血サンプルを遠心分離して血漿をバフィーコートと赤血球から分離することから始めます。次に、1.2ミリリットルの血漿上清を1.5ミリリットルの遠心チューブに移し、バフィーコートと赤血球を含む下層を乱さないように注意し、再び上清を遠心分離して血小板と大きな細胞片を取り除きます。

スピンの最後に、ペレットを乱さないように注意しながら、PPPサンプルの最後の200マイクロリットルを除くすべてのものを新しいチューブに慎重に移します。次に、プラズマを数回上下に混合し、各サンプルの320マイクロリットルを96ウェルプレートの最上列に移します。サンプルを染色するには、3つのパネルのそれぞれについて目的の抗体を個々のゼロポイント22マイクロメートルの遠心フィルターチューブに組み合わせ、固定角度の単一速度遠心分離機を使用して抗体をスピンダウンします。

すべての抗体がフィルターを通過したら、図に示すように、96ウェルプレートの各ウェルに適切な量の混合物を加えます。次に、マルチチャンネルピペットを使用してPPPサンプルを混合し、各サンプルの100マイクロリットルを2列目の抗体に移します。次に、サンプルを再度混合し、チップを交換し、必要に応じて100マイクロリットルのサンプルを次の2列の抗体のそれぞれに移します。

実験用。30分後、ウェルあたり220マイクロリットルのPBSでプレートを摂氏4度でインキュベートし、生物学的安全キャビネット内で6列から8列に並べます。次に、幅調整可能なマルチチャンネルピペットを使用して、チップを変更せずに各ウェルの内容物を対応する遠心フィルターチューブに移します。

洗浄列の1つから200マイクロリットルのPBSを使用して、サンプルが除去されたばかりのウェルをすすぎます。次に、リンス溶液を以前にPPPサンプルを添加したのと同じフィルターに移し、遠心フィルターを閉じます。染色したPPPサンプルをすべてリンス液とともに移送したら、固定ローター遠心分離機でサンプルをスピンダウンします。

スピン後、フィルターの上に液体が残っていないことを確認してください。次に、フィルターの上部を300マイクロリットルのPBSに再懸濁し、再懸濁内容物を事前に標識したチューブに移して、すぐにフローサイトメトリー分析を行います。遠心フィルターを使用して染色されたサンプルを洗浄すると、バックグラウンドシグナルとポジティブマーカーシグナルの間の分離が向上します。

ただし、エキソソームを含む小さな細胞外小胞の一部は、フィルターのドアを通じて失われる可能性があることに注意することが重要ですサンプルを分析するには、まず、順方向および側方散乱電圧パラメータを対数スケールに設定し、各パラメータに対してサイトメーターが許可する最低のしきい値を選択します。次に、ゼロポイント22マイクロメートルのチューブを運転しながら、フィルタリングされたPBSはこれらの電圧をバックグラウンドノイズの大部分を除外する最大値に調整します。次に、1マイクロメートル以下のビーズの混合物を含むチューブを走らせ、前方の横方向の散布図でビーズ集団の周りにゲートを描き、1マイクロメートルのビーズの下のすべてのイベントをキャプチャします。

次に、サイトメーターの流量を低く設定し、ビーズを使用してサイトメーターの流量ダイヤルを目的のイベントレートに調整します。次に、PBSで希釈した虹色蛍光粒子のチューブを使用して、前方散乱側散乱、および各カラーチャネルの値の平均強度を記録し、5, 000イベントを取得します。すべてのパラメータを設定したら、各サンプルを正確に1〜2分間実行します 各チューブの最初の読み取りが完了した後、各サンプルに20マイクロリットルの10%MP 40を混合し、チューブを同じ時間再読み取りして、溶解したサンプルで検出された陽性のイベントを同じ時間で減算できるようにします。

ビーズベースのキャプチャーによって細胞外小胞を検出するには、まずコーティングされていない6マイクロメートルのポリスチレンビーズをRPMI培地で2回洗浄し、続いてResusを2ミリリットルで洗浄します。次に、必要に応じて200マイクロリットルのPPPまたは超遠心分離機の細胞外小胞、および200マイクロリットルのメディア、および200マイクロリットルのメディアで、メディアの400マイクロリットルでネガティブコントロールチューブの各新しいファックスチューブに6, 000ビーズを追加します。各チューブの最終容量を400マイクロリットルに調整します。

より多くのメディアで。チューブをシェーカーで摂氏4度で一晩インキュベートします。翌朝、ビーズを2ミリリットルのメディアで洗います。

上清を吸引し、摂氏4度のシェーカーに400マイクロリットルの5%ウシ血清アルブミンを配置して、非特異的結合をブロックします。3時間後、ビーズをさらに2ミリリットルの培地で洗浄し、ペレットを100マイクロリットルの新鮮な培地に再懸濁します。次に、抗体をろ過し、適切な量のろ過された抗体カクテルを各チューブに加え、摂氏4度で30分後にビーズをさらに2ミリリットルの培地で洗浄します。

今回は、ペレットを400マイクロリットルの培地に再懸濁し、フローサイトメトリーでサンプルを直ちに分析し、フォワードインサイドスキャッターパラメータを、先ほど示したようにフローサイトメーターが許容する最低閾値に調整します。最後に、シングレットビーズの母集団をゲートし、サンプルごとに2000のイベントを取得します。個々の検出アッセイでは、溶解したコントロールを使用して、対応する非上場サンプルのゲートを設定するために、これらのドットプロットで示されるように、PPPサンプル中の細胞外小胞の存在を検出するために、個別およびビーズベースの検出方法の両方を使用できます。

イベントの大部分は、細胞外小胞ゲート内に収まる必要があります。たとえば、この図では、これらの bi パラメーター プロットは、細胞上に共存することが知られている 2 つの赤血球マーカーであるマーカー CD 1 0 8 A と CD 2 35 A の検出を示しています。予想通り、細胞外小胞上の陽性イベントの半分以上は両方のマーカーに対して陽性ですが、これらのパラメータ別プロットでは、細胞上に共存しないことが知られている2つのマーカーの細胞外小胞発現は、ビーズベースの検出法を使用して異なる別々の陽性集団を示します。

ポジティブ集団とネガティブ集団の間に分離は存在せず、イベントはダブルポジティブ象限に現れますが、両方のタイプの細胞外小胞が単一のビーズに結合するという事実により、通常は同じ細胞タイプには見られません。したがって、この方法からのデータは、ネガティブコントロールデータを重ね合わせたヒストグラムを用いて最もよく分析され、ビーズサンプルにおいて観察されるマーカー発現の明らかなシフトは、マスターされたコントロールと比較される。この手法は、個々の検出法で3〜4時間、またはビーズ法で適切に実行されれば1日半で、3つの抗体パネルを含む12の血液サンプルを分析するために使用できます。

この手順を試行する際は、各サンプルの処理に一貫性を持たせること、特に複数のサンプルを複数日にわたって分析する場合は、各実験の開始時にサイトメーターの流量と蛍光強度が前日の実験設定と一致するように正しく調整されていることを確認することが重要です。