Name: フローサイトメトリーを用いて細胞外小胞の分析のための技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶ細胞外小胞のフローサイトメトリー分析法。個別検出法とビーズベース法を用いて血漿中EVを分離・測定し、細胞間情報伝達の理解に貢献する高速定量的アプローチを習得する。

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著者は、機器の設定、フローサイトメーターとの彼の助けのための血液システム開発センターからデイルHirschkornに感謝したいと思います。この作品は、NIHの助成金HL095470とU01 HL072268と国防総省の契約W81XWH-10-1-0023とW81XWH-2から0028によってサポートされていました。

注：以下のプロトコルが人間の福祉のためにすべての、制度的、国内および国際的なガイドラインを遵守して行われてきた。すべてのヒト被験サンプルは、治験審査委員会（IRB）承認のプロトコルの下で被験者のインフォームドコンセントを用いて試験した。 1.方法A：個々の検出方法 EVの血液サンプル/単離の1.1）処理<ol><li>以下の2段階の分画遠心プロトコルを使用して（30分以内に最大）直ちにACD-A液1.5 mlまたは他の適当な抗凝固剤及びプロセスを含む2つの10 mlのガラスチューブ中にドナー/患者から血液を引き込む。 注：このプロトコルは、採取した血液の組み合わせ〜17ミリリットルから約10ミリリットル乏血小板血漿（PPP）のが得られます。多かれ少なかれPPPが必要な場合には、採血管の数は、それに応じて調整することができる。 </li><li> RTで10分間1500×gでサンプルを遠心軟膜と赤血球から血漿を分離する。軟膜と赤の細胞を含む下層を乱さないように注意しながら、1.5ミリリットル遠心管にプラズマ上清1.2mlのアリコートを転送します。 </li><li>血小板および大型細胞片を除去し、室温で10分間、13000×gでスピン。慎重にペレットを乱さないよう、新しいチューブにPPPを追加するために、200μlの後ろに残して、PPPを転送する。 </li><li>この時点で、後の分析のために、最大2つの年（概要については、 図1Aを参照）のために、-80℃で分析したり、新しい1.5ミリリットル遠心管に1.0ミリリットル分量で転送して保存のためにすぐにPPPを使用しています。 </li><li>精製された電気自動車は、機能的実験のために必要な場合、超遠心管にPPPの転送6ミリリットルし、0.2μm濾過したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）28mlを追加します。スイングバケットローターを備えた超遠心機を使用してRT 100,000×gで60分間スピン。上清を吸引し再懸濁EVペル1.5ミリリットルのメディアでみましょう。 注：最高の再現性のために、血液サンプルをドナーにドナーからのように一貫して可能な限り処理されるべきである。 EV分離法における任意の変動が大きく、検出EVの数と種類に影響を与える可能性がある。 </li></ol> 1.2）分析のためのサンプルを調製注：この時点から、ステップは3つのパネルで14マーカーの12個のサンプルを分析するためのハイスループットプロトコルを説明する。しかし、抗体の他の組み合わせは、ここで使用することができる。プロトコルは、関心のあるそれらのために提案マーカーを置換することによって、他のEV集団を研究するために適合させることができる。 <ol><li> （-80℃で保存した場合）冷凍庫から12のサンプルを取り出し、37℃で解凍。 </li><li>ピペットの内容を上下に数回混合する。各サンプルから320μlのを削除し、96ウェルプレートの一番上の行に追加します。 注：幅調節可能なマルチウェルピペットは、このとお尻の多くの他のステップのために非常に便利です一度に複数のサンプルを分析する場合は特に、AY。 </li></ol> 1.3）染色EVのサンプル<ol><li>染色前に、陽性シグナルが発生する可能性があり、凝集体を除去するためにすべての抗体（ABS）をフィルタリングする。 <ol><li> 2分間、室温で固定角度シングルスピード遠心分離機（〜750×gで）を使用して別個の0.22μmの遠心フィルターチューブと遠心分離機に3パネルの各々に使用される抗体を結合、または抗体の混合物のすべてがフィルターを通過するまでと全く抗体液がフィルターの表面上に残っていない。ストアのAb 2週間まで冷蔵庫でカクテルが、再フィルタ使用前に毎回。 </li></ol></li><li>よく行2の各フィルタのAb混合物の適切な量を追加します（ 例えば 、私はそれぞれのAbの2μLで染色されているパネルのサンプルは、そのようにフィルタリングのAbカクテル12μlの合計は、2行するウェルに添加されている）。提案のプレートマップの概要については、図1（b）を参照してください。これらの追加を繰り返します以上のパネルが実行された場合の下の行へのS（ここでは、ウェル4を行にパネルIIIカクテルの3及び11μL/行する8μL/ウェルパネルIIカクテルの追加、特定のパネル情報のための材料リストを参照してください）​​。 </li><li>マルチチャンネルピペットを用いて、上下の行1にPPPのサンプルを混合し、2ミックス上下の行のウェルに、行1のウェルから100μlを移す。ヒントを変更して、繰り返して、30分間の行4℃で3と4のインキュベートに行1から100μLを転送する。 </li></ol> 1.4）洗浄MVサンプル<ol><li> 4℃から96ウェルプレートを取り外し、生物学的安全キャビネットに移す。マルチチャンネルピペットを用いて、6-8（ステンドPPPを含むウェルを洗浄/すすぎのために使用される）の行に/ウェルのPBS 220μlを添加する。 </li><li>抗体の3つのパネル、12×3 = 36フィルターチューブで、12サンプルについて幅が調整可能なマルチチャンネルピペットを（使用して予め標識遠心フィルターチューブに、各ウェルの内容を転送します）が必要とされる。同じヒントを使用して、洗浄行から200μlのPBSを除去し、PPPがちょうど除去された対応するウェルに追加します。 </li><li>アップミックスダウン井戸をすすぎ、PPPが以前に添加した同じフィルタにリンス液を転送する。遠心分離フィルターのクローズトップス。変更のヒント。 </li><li>すべての染色のPPP試料は遠心分離フィルターへのリンスソリューションと一緒に転送されるまで、残りの染色したサンプルで、このプロセスを繰り返します。 </li><li> RTで3分間850×gで固定されたロータの遠心機とスピンに遠心分離フィルターを転送します。 注：液体がフィルターのトップスに残っていないことを確認してください。遠心分離した後、フィルターを上に残っている目に見える流体層と「ドライ」であることが表示されます。そうしながら、特定のPPPサンプルが効果的にフィルターを介して移動するために、より長い遠心分離時間が必要な場合があります。 </li><li>遠心フィルターチューブを外し、生物学的安全キャビネットに戻る。マルチチャンネルピペットを用いて、PBS300μlのフィルターのトップを懸濁します。再懸濁内容が即時のFCM解析のためのチューブを標識事前に転送します。 注：これは、サンプル間の変動を避けるために、サンプル間で一貫ピペットプランジャ窪みの力と数を維持することが非常に重要である。これは、理想的にピペッティングし、各サンプルのために特定のボリューム（ 例えば 、280μl）を正確な回数（ 例えば 、8回）上下するようにプログラムされた電子ピペットを用いて行われるべきである。 </li></ol> 1.5）サイトメーターのセットアップ<ol><li> FCMソフトウェアを開きます。 （製造者の指示に従って）機器のセットアップビーズを使用して毎日の機器較正およびセットアップを実行し、セットアップを実験の前に。 </li><li> EVサンプルは、複数の抗体で染色されており、複数の蛍光色素を一度に測定する場合、次のように、補正値を算出する。 <ol><li>事前に補償ビーズの2滴を追加します。チューブ（各蛍光標識抗体のための1管）標識抗体の、推奨量を追加します。染色していない補償制御として使用する別のチューブに負の補償ビーズの2滴を追加します。 </li><li> PBS400μlのPBSに再懸濁で洗浄し、30分間4℃でインキュベートする。 </li><li>楽器に付属のソフトウェアフローサイトメーターを用いて、各補償チューブを実行し、5-十年のログスケールで約10 4で各ピークを配置するために、蛍光電圧を調整します。蛍光ピークは、他のすべてのチャネルと比較して、独自の蛍光チャネルにおいて（最も明るい）が最も高く、かつ必要に応じて再度蛍光パラメータの電圧を調整すること。確実に各個別に染色されたCOMPチューブを実行し、チューブあたり少なくとも5000のイベントをキャプチャします。 </li><li>その後選択して &quot;、実験」タブを選択し、「報酬」を、すべてのサンプルに補正値を適用するために「計算補正」を選択します。 </li></ol></li><li&gt;スケールをログに記録し、それぞれのサイトメーター（FSC = 200およびSSC = 200）で許可されている最低のしきい値を選択するための前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）は、電圧パラメータを設定します。 </li><li> 0.22μmのフィルターPBSのチューブの実行中に、（ すなわち 、単にイベント発生率が5イベント/秒を上回るなる電圧閾値より下）バックグラウンドノイズの大部分を排除し、最も高い値にFSC＆SSC電圧を調整します。 </li><li>必要に応じて、PBSで希釈した1.0μmのビーズ、 - 次に、0.2ミクロンを含むチューブを実行します。 SSCプロット対FCSでは、0.2〜1.0μmの間でイベントをキャプチャするためにビーズ集団の周りにゲートを描きます。また、SSC-Hヒストグラムで、1.0μmのビーズよりも小さいすべてのイベントが含まれるようにゲートを描く。 </li><li> 「LO」（約8〜12μL/分）にサイトメーターの流量を設定します。ビーズチューブ（またはビーズの既知の濃度を含有する他のチューブ）を使用する直前まで、フローサイトメーター上での流量調整ツマミntの速度は約200イベント/秒に達する。同じ流速で、すべてのサンプル管を読み、その流速が実行間の一貫性を維持確保するために将来の実験で同じビーズ濃度を使用しています。 </li><li> PBSで希釈した虹の蛍光粒子のチューブを実行します。 5000のイベントを取得します。 FSC、SSC、および各カラーチャンネルの平均強度値を記録します。蛍光強度は、実験間の整合性を保つことを保証するために将来の実験で電圧を調整するために、これらの値を使用してください。 </li></ol> 1.6）サンプル読書<ol><li> 「LO」（約8〜12μL/分）にサイトメーターの流量を設定し、正確に1または2分間、各サンプルを実行します。 </li><li>最初の読み取りの後、各サンプルに10％のNP-40の20μlを添加、ピペット上下、及びで検出された陽性事象の減算を可能にするために同じ時間（1または2分）再読み込み同じ時間枠で溶解サンプル。 注：それは非常にIMPですサンプルはピペットのではなく、ボルテックスを用いて混合することがortant。我々の経験では、ボルテ​​ックスはEV-模倣陽性事象につながる、いくつかの抗体の自己凝集を引き起こす可能性があります。 </li><li>一旦全てのサンプルが読み取られてからFCM解析ソフトウェアを使用してさらに分析するために使用される別のファイルにすべて.fcsファイルを書き出す。 </li></ol> 1.7）データ解析<ol><li> FCM解析ソフトウェアを開きます。新しい実験ファイルに.fcsファイルをすべてインポートします。 </li><li>ビーズのみのチューブを開きます。 SSC-プロット対FSC-Aには、0.2μm程度と1.0μmの間で大きさのすべてのビーズをゲートを描く。これは、EVゲートである。すべてのサンプルに追加するドラッグします。 </li><li>陰性対照として、溶解したサンプルを使用して、使用する各蛍光チャネルにおけるバックグラウンド蛍光の端にゲートを描く。各対応する非溶解サンプルのEVゲートへの蛍光ゲートをドラッグします。 注：この時点で、それはまた、デュアル蛍光双方向パラメータプロットを検討することは有用である。ロケットの形で二重陽性象限凝集または他の小胞模倣事象からアーチファクトを示すことができる、マーカーは無関係の細胞型上に存在することが知られている場合は特に、（ 図8参照）。 </li><li>各蛍光マーカーの場合は、非溶解サンプル内のイベント数から溶解サンプル中のイベントの数を引く。必要に応じて、％正の値を取得するために非溶解されたEVゲート内EVの総数でこの数を割る。 </li></ol> 2.方法B：ビーズ法 EVの血液サンプル/単離の2.1）処理<ol><li>方法A（1.1節）に記載の血液処理方法を参照してください。 </li></ol> 2.2）分析のためのサンプルを調製<ol><li>必要に応じて、エキソソームと微小胞にPPPまたは超遠心のEVを分画。 0.22μmの遠心フィルターにPPPまたは超遠心EVの250μlを添加して、750 xで固定されたロータの遠心機とスピンに移転RTで2分間グラム。 注：液体がフィルターのトップスに残っていないことを確認してください。遠心分離した後、フィルターを上に残っている目に見える流体層と「ドライ」であることが表示されます。そうしながら、特定のサンプルが効果的にフィルターを介して移動する流体のためにわずかに長い遠心分離時間が必要な場合があります。 </li><li> 2ミリリットルでコーティングされていない6μmのポリスチレンビーズ（ 例えば 、負のABCビーズ）RPMI培地で2回、再懸濁を洗ってください。各FACSチューブに6000ビーズを追加します。ネガティブコントロール管に、ビーズに一人でRPMI培地400μlのを追加します。他のすべてのチューブに、PPPまたは超遠心のEV（またはその留分）を200μlとRPMI培地200μlを加える。 </li><li>メディア400μlに全てのチューブの最終容量を調整し、シェーカー上、4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>翌朝は、メディアの2ミリリットルでビーズを洗浄する。上清を吸引除去する。 </li><li> 4＆で3時間培地（400μl）を、5％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックし＃176; Cシェーカー上。 </li><li>メディアの2ミリリットルでビーズを洗ってください。 100μlの培地で吸引し、ペレットを再懸濁し。 </li></ol> 2.3）染色EVのサンプル<ol><li>すべての抗体をフィルタリングします。方法Aで使用したのと同じ抗体のパネルを使用し、又は所望の場合に限り、それらの蛍光色素が互いに互換性があるように、抗体の異なる組み合わせを作成する。 </li><li> 0.22μmの遠心フィルターチューブに単一のパネルで使用されるすべての抗体を組み合わせる。 2分間、または抗体の混合物のすべてがフィルターを通過してない抗体液がフィルタの表面に残っていないまで、固定角シングルスピード遠心分離機を用いて遠心機。 </li><li>すべてのチューブに濾過抗体カクテルの適切なボリュームを追加し、4℃で30分間インキュベートする。 </li><li>フローサイトメーター上でメディア400μlのメディア、再懸濁の2ミリリットルでビーズを洗浄し、すぐに実行（または同じ日以内）。 </li></ol> 2.4）セットアップとサンプル読書サイトメーター<ol><li> FCMソフトウェアを開きます。 （製造者の指示に従って）機器のセットアップビーズを使用して毎日の機器較正およびセットアップを実行し、セットアップを実験の前に。 </li><li> EVサンプルは、複数の抗体で染色されており、複数の蛍光色素を一度に測定する場合、次のように、補正値を算出する。 <ol><li>予め標識するための補償ビーズの2滴のチューブ（各蛍光標識抗体のための1チューブ）を追加し、抗体の推奨される量を追加します。染色していない補償制御として使用する別のチューブに負の補償ビーズの2滴を追加します。 PBS400μlのPBSに再懸濁で洗浄し、30分間4℃でインキュベートする。 </li><li> FCMソフトウェアを使用して、各補償チューブを実行し、5年間の対数スケールで約10 4における各ピークを配置する蛍光の電圧を調整する。蛍光ピークが他のすべてのチャネルに比べて、独自の蛍光チャネルで（最も明るい）最高であることを確認し、必要に応じて再び蛍光パラメータの電圧を調整します。各個別に染色されたCOMPチューブを実行し、チューブあたり少なくとも5000のイベントをキャプチャします。 </li><li>すべてのサンプルに補正値を適用するには、タブ「実験、 &quot;その後&quot;の報酬、「その後」の計算補正」を選択します。 </li></ol></li><li>規模を記録し、それぞれのサイトメーター（FSC = 200およびSSC = 200）で許可されている最低のしきい値を選択するためのFSCとSSC電圧パラメータを変更します。 </li><li>実行したサンプル、一重ビーズ集団に対するゲートと、このゲートで2000のイベントを取得する。エクスポート.fcsファイル。 </li><li>ファイルを.fcs分析するFCM解析ソフトウェアを使用してください。一重ビーズ上のゲート。各蛍光色素のための幾何平均蛍光強度（MFI）を計算し、ネガティブコントロールのMFIと比較。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは利害関係のない。

EVの単離、処置および分析のための2つの異なるプロトコルは、個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して、提示された。使用する最も適切な方法を選択することは必ずしも容易ではなく、興味のある個々の亜集団と同様にテストされているサンプルを理解する必要があります。最も適切な方法を選択する際にさらに、取得のために使用されるサイトメーターの感度を考慮しなければならない。多くの場合ではなく、メソッドの組み合わせは単独のいずれかの方法よりサンプルに関する詳細な情報を提供し、使用するための単一の最良のプロトコルがありません。理想的には、いくつかの異なる単離および検出技術は、特定のEV集団が研究されてに関してパフォーマンスサイトメーター考慮個体にかかるテーラードプロトコルを開発するために最初に評価されるべきである。代替分離技術は、超遠心分離、ショ糖密度分画、免疫磁気Bを含むEAD分離、クロマトグラフィー、およびアフィニティー精製12、代替の検出方法は、走査型電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡、原子間力顕微鏡法、動的光散乱、及びウェスタンブロッティング8を含んでいる。異なる技術を組み合わせることで、こ...

細胞外小胞（電気自動車）は、高度に細胞間コミュニケーションに関与し、生物学的プロセスの多様な範囲を規制する助けている体液で見つかった小さな、膜由来小胞である。フローサイトメトリー（FCM）を使用して、電気自動車の分析は、その小さなサイズと、目的のマーカーに陽性の別個の集団の不足のために悪名高く困難であった。かなり過去10年間に改善し、EV分析のための方法は、まだ進行中の作業である。残念ながら、そこにはフリーサイズのプロトコルではなく、使用するのが最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮しなければなりません。ここで提示個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して電気自動車を分析するためにEVやつのプロトコルを処理するための幾つかの異なる技術である。ここに記載される方法は、一般に市販の調製物に見られる抗体の凝集体を排除する信号対雑音比を増加させる、および合理的なfのでゲートを設定して支援するバックグラウンド蛍光の検出を最小にashion。第二のプロトコルをキャプチャ小さいEVやエキソソームを検出するために、ビーズベースのアプローチを使用しながら、第一のプロトコルは、臨床サンプルの高容量を分析するために特によく適している個々の検出方法を使用する。 また、微粒子としても知られている電気自動車は、細胞間コミュニケーションに関与し、生物学的プロセス1の多様な調節を助けている体液中に見出される小さな膜由来の小胞である。 4 -様々な表面マーカーおよび/ ​​または生物学的物質の直接転写の発現を介して、電気自動車は、細胞間コミュニケーションに2を活性化または抑制の役割のいずれかを再生するためにレシピエント細胞の機能を変化させることができる。他の腫瘍metastaを促進するから、広範な条件に寄与することが示されているが、臨床的に、血小板由来電気自動車は、強力な抗凝固活性5を有することが知られている病気7からの保護にSIS 6。電気自動車は、発電8のサイズやメカニズムに応じて、そのようなエキソソームと微小胞（MVの）などの細胞由来の小胞の小さいカテゴリーに分類することができる。細胞由来の小胞の集団の命名法は、MVSは1,000百大きいながらしかし、エキソソームは、一般的に、形質膜とエンドソームの融合に由来し、小さな、40から100ナノメートルの粒子として記載されている、現在進行中の議論8,9の話題であり続け原形質膜10の脱落によって形成さ以下の粒子。ここで、一般的な用語「電気自動車」とは、細胞によって放出される細胞外の生物小胞の全てのタイプを指すために使用される。 全血からのEVの単離は、多段階の手順であり、多くの異なる処理変数は、保存温度および期間11,12を含む、EVの内容に影響することが示されている、抗凝固剤/防腐剤13を使用し遠心法14を用いた。これらの変数の標準化の必要性は、適切な血液処理とEV分離手順のための血栓止血科学と標準化委員会（ISTH SSC）に関する国際学会勧告15,16につながっている、まだ、最適なプロトコル上の研究者の間でコンセンサスは存在しない12を使用する。最も厳密に制御前分析変数は、正確で再現性のあるデータのために重要であることが同意する。 電気自動車を分析するために、研究者らは、透過型電子顕微鏡17、走査型電子顕微鏡18,19、原子間力顕微鏡、20,21およびウェスタンブロッティング22,23を動的光散乱を含む様々な方法を利用している。 FCMは、多くの研究9,24のための選択の方法であるが-高いスループット能力に起因26、FCMを用いた電気自動車の分析がされている32 -そのサイズと離散正の集団27の欠如に難しいことで知ら。細胞の分析に比べて、必要となる粒子当たりの抗原の少ない数に起因して放出された1）以下蛍光電気自動車結果のサイズが小さく、後染色洗浄2）限られた可能性は、バックグラウンド蛍光を減少させる。研究者の間で共通の課題は、免疫グロブリン凝集体27,28および抗体29の自己凝集から生じる信号を含む。さらに、長い処理時間と現在のプロトコル33,34の多くで使用される長い洗濯/単離方法は、高スループットのアプリケーションに理想的で、それらが少なくなって、少数のサンプルを分析するために、マルチ日の時間のコミットメントを必要とする。一部の研究者は、正確にBACを評価するため、蛍光マイナス1（FMO）と抗体アイソタイプ役に立たないとして伝統的に使用されるFCMネガティブコントロールのレンダリング、完全に洗浄ステップを見送るkground蛍光30。 抗体凝集体および他の非小胞、非結合抗体を除去するのに難しさ、および識別可能な正の集団の不足から生じる信号：我々のプロトコルは、EVの適切なFCM分析を妨げることができる3つの一般的な問題に対処する。ここで説明される技術は、一般に市販の調製物に見られる抗体凝集体を排除する信号対雑音比を増加させると、バックグラウンド蛍光の検出を最小限にする合理的な方法でゲートを設定することで支援する。二つの異なる検出方法がここに提示されている：第二のプロトコルをキャプチャ小さいEVやエキソソームを検出するために、ビーズベースのアプローチを使用しながら、第一のプロトコルは、臨床サンプルの高容量を分析するために特によく適している個々の検出方法を使用する。

<table><tbody><tr><td>LSR II ベンチトップ フローサイトメーター</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red)</td></tr><tr><td>FACS Diva ソフトウェア&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>PCバージョン6.0</td></tr><tr><td>FlowJoソフトウェア&nbsp;</td><td>Treestar US</td><td></td><td>Macバージョン9.6.1またはPCバージョン7.6.5</td></tr><tr><td>Sphero Rainbow蛍光粒子</td><td>BD Biosciences</td><td>556298</td>、<td>蛍光強度の一貫性を維持するためにすべてのチャネル電圧を調整するために使用されます&nbsp;</td></tr><tr><td>ウルトラレインボー蛍光粒子&nbsp;</td>バッチ<td>間のEVのゲーティングの一貫性を確保するためにMegamix-Plus SSCビーズに加えて使用される</td><td>Spherotech</td><td>URFP-10-5</td></tr><tr><td>Megmix-Plus SSCビーズ</td><td>Biocytex</td><td>7803</td><td>は、FSCおよびSSC&nbsp;電圧を調整して、実行間の一貫性&nbsp;を維持するために使用されます。また、同じ流量がすべての実行で使用されていることを確認するために、流量を監視し、ちょうど流量ダイヤルをダイヤルするために使用することができます</td></tr><tr><td>AbCアンチマウスビーズキット</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td>ズ <td>補償制御に使用される&負のAbCビーズ ビーズベースの方法に使用される</td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)</td><td>サンタクルーズ&nbsp;</td><td>SC-281108</td><td>個別検出法では、ネガティブコントロールとして使用するための初期読み取り後のサンプルの溶解のみに使用されます。ストックはPBSで1:10に希釈し、冷蔵庫で最大1か月間保存できます。</td></tr><tr><td>BD TruCOUNTチューブ</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>340334</td>、<td>絶対的なEV濃度が必要な場合に使用できます</td></tr><tr><td>Ultrafree-MC、GV 0.22 &micro;m 遠心フィルターユニット</td><td>ミリポア&nbsp;</td><td>UFC30GVNB</td>、<td>サイズに基づいてEvを染色後洗浄および/またはEVを分画</td></tr>するために使用されます <tr><td>Vacutainerガラス全血チューブ ACD-A</td><td>BD Biosciences</td><td></td> 364606 <td></td></tr><tr><td>Facsチューブ 12x75ポリストレン</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>50 ml リザーバーを個別に包装&nbsp;</td><td>Phenix</td><td>RR-50-1s</td><td></td></tr><tr><td>Green-Pak ピペットチップ - 10 &micro;l</td><td>レイニン</td><td>GP-L10S</td><td></td></tr><tr><td>Green-Pak ピペットチップ -200 & マイクロ;l&nbsp;</td><td>レイニン</td><td>GP-L250S</td><td></td></tr><tr><td>グリーン -Pak ピペットチップ - 1,000 & マイクロ;l&nbsp;</td><td>レイニン</td><td>GP-L1000S</td><td></td></tr><tr><td>ステーブルスタック L300チップ 滅菌済み</td><td>レイニン</td><td>SS-L300S</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite&nbsp;XLS 8チャンネル LTS&nbsp;調節可能&nbsp;スペーサー&nbsp;</td><td>レイニン</td><td>LA8-300XLS</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル組織培養プレート</td><td>E&K Scientific</td><td>EK-20180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培地 (Hepes なし)</td><td>UCSF 細胞培養施設</td><td>CCFAE001ビーズ</td><td>ベースの検出法に使用される培地</td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 & micro;m フィルター付き</td><td>UCSF 細胞培養施設</td><td>CCFAL003</td><td></td></tr><tr><td>超遠心チューブ、薄壁、超透明</td><td>BECKMAN COULTER INC</td><td></td><td></td></tr> 344058 <tr><td>PANEL I</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD3 PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>344808</td><td>2 &micro;l</td></tr><tr><td>CD14 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>301820</td><td>2 &micro;l</td></tr><tr><td>CD16 V450</td><td>BD Biosciences 560474</td><td></td><td>2 & マイクロ;l</td></tr><tr><td>CD28 FITC</td><td>バイオレジェンド</td><td>302906</td><td>2 & マイクロ;l</td></tr><tr><td>CD152 APC</td><td>BD Biosciences 555855</td><td></td><td>2 & マイクロ;l</td></tr><tr><td>CD19 A700</td><td>バイオレジェンド</td><td>302226</td><td>2 & マイクロ;l</td></tr><tr><td>PANEL II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD41a PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>340930</td><td>2 &micro;l</td></tr><tr><td>CD62L APC</td><td>Biolegend</td><td>304810</td><td>2 & マイクロ;l</td></tr><tr><td>CD108 PE&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>552830</td><td>2 & マイクロ;l</td></tr><tr><td>CD235a FITC</td><td>バイオレジェンド</td><td>349104</td><td>2 & マイクロ;l</td></tr><tr><td>パネルIII</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b PE-Cy7</td><td>バイオレジェンド</td><td>301322</td><td>2 & マイクロ;l</td></tr><tr><td>CD62p APC</td><td>Biolegend</td><td>304910</td><td>2 &micro;l</td></tr><tr><td>CD66b PE&nbsp;</td><td>バイオレジェンド</td><td>305106</td><td>2 & マイクロ;l</td></tr><tr><td>CD15 FITC</td><td>exalpha</td><td>X1496M</td><td>5 & マイクロ;l</td></tr><tr><td>CD9 PE</td><td>Biolegend</td><td>555372</td><td></td></tr><tr><td>CD63 APC</td><td>Biolegend</td><td>353008</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Ms IgG2a, &kappa;</td><td>バイオレジェンド</td><td>400230</td><td></td></tr></tbody></table>

フローサイトメトリーを用いて細胞外小胞の分析のための技術

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

細胞外小胞（電気自動車）は、高度に細胞間コミュニケーションに関与し、生物学的プロセスの多様な範囲を規制する助けている体液で見つかった小さな、膜由来小胞である。フローサイトメトリー（FCM）を使用して、電気自動車の分析は、その小さなサイズと、目的のマーカーに陽性の別個の集団の不足のために悪名高く困難であった。かなり過去10年間に改善し、EV分析のための方法は、まだ進行中の作業である。残念ながら、そこにはフリーサイズのプロトコルではなく、使用するのが最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮しなければなりません。ここで提示個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して電気自動車を分析するためにEVやつのプロトコルを処理するための幾つかの異なる技術である。ここに記載される方法は、一般に市販の調製物に見られる抗体の凝集体を排除する信号対雑音比を増加させる、および合理的なfのでゲートを設定して支援するバックグラウンド蛍光の検出を最小にashion。第二のプロトコルをキャプチャ小さいEVやエキソソームを検出するために、ビーズベースのアプローチを使用しながら、第一のプロトコルは、臨床サンプルの高容量を分析するために特によく適している個々の検出方法を使用する。

<html> 図1は 、ビーズベースの方法または個々の検出方法のいずれかを使用してEVの分離および検出のための全体的な処理方式の概要を説明します。 FCMを使用したEVの個々の検出は、より大きな電気自動車の分析に適していますが、ほとんどのサイトメーターは、個別にエキソソームと小さい粒子を検出することができない。ビーズベースのアプローチは、一般的に、表1に概説されるが、この方法を使用することに関連する欠点が存在する、小さな電気自動車が検出することができる電気自動車の分離超遠心分離を使用して（またはスクロース勾配分画法の添加なし）である電気自動車は、機能的アッセイのために必要とされている場合、推奨。超遠心は、血清タンパク質と機能的な実験の成果に影響を与えることができるプラズマ、から他の可溶性の汚染物質を含む不純物を除去する。しかしながら、超遠心分離は、時間がかかり、EVの量と質12を変更することができる。 &quot;&gt;二つの検出アッセイのための期待される結果を図2-3に示されている。対応する非溶解サンプ...

多くの異なる方法は、フローサイトメトリー（FCM）を使用して、細胞外小胞（電気自動車）の測定のために存在する。使用する最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮すべきである。電気自動車を測定するための2つのプロトコルは、個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して、提示されている。

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

この手順の全体的な目的は、2つの異なる手法を用いて血液中の細胞外小胞の循環を単離し、分析することです。個別の細胞外小胞検出法では、まず血液サンプルから血小板減少血漿（PPP）を単離します。次に、PPPを目的の蛍光色素標識抗体で染色します。ビーズベースの検出法では、細胞外小胞をビーズと共にインキュベートし、その後、ビーズに結合した小胞を適切な蛍光色素標識抗体で染色します。最終的に、フローサイトメトリーによるサンプルの解析によって、血中細胞外小胞の内容を決定できます。電子顕微鏡や磁気ビーズ分離などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、所要時間が大幅に短縮され、特定のサブポピュレーションに限定されることなく、細胞外エキソソーム（extracellular vesicle）の全集団を評価できる点にあります。一般的に、本手法に不慣れな方は、操作の習得に苦労することがあります。なぜなら、本手法を成功させるには、実演された操作手順とサイトメーターの設定パラメータを厳格に遵守する必要があるためです。日々の変動を最小限に抑え、高品質なデータを得るためには、まず全血サンプルを遠心分離し、血漿をバフィーコートおよび赤血球から分離させます。次に、血漿上清を1.2 mLずつ1.5 mL遠心チューブに分注します。この際、バフィーコートと赤血球を含む底層を乱さないよう注意してください。その後、上清を再度遠心分離し、血小板および大きな細胞断片を除去します。遠心分離後、ペレットを乱さないように注意しながら、PPPサンプルの最後の200 µLを除くすべてを新しいチューブに慎重に移します。次に、血漿を数回ピペッティングして混合し、各サンプル320 µLを96ウェルプレートの上段に移します。サンプルを染色するため、3つのパネルそれぞれについて目的の抗体を個別の0.22 µm遠心フィルターチューブにまとめ、固定角単一速度遠心機を用いて抗体を遠心分離します。抗体がすべてフィルターを通過したら、図に示すように、混合物を適切な量ずつ96ウェルプレートの各ウェルに分注します。次に、マルチチャンネルピペットを用いてPPPサンプルを混合し、各サンプルの100 µLを2行目の抗体が分注されたウェルに移します。その後、サンプルを再度混合し、チップを交換して、必要に応じて次の2行の各抗体ウェルにサンプルの100 µLを移します。実験の手順は以下の通りです。バイオセーフティキャビネット内で、各ウェルに220 µLのPBSを添加し、6行目から8行目までを22°Cで30分間静置した後、4°Cでインキュベートします。次に、幅調整可能なマルチチャンネルピペットを用い、チップを交換せずに、各ウェルの内容物を対応する遠心フィルターチューブに移します。洗浄用行のいずれかから200 µLのPBSを使用し、サンプルを回収した直後のウェルをすすぎます。次に、このすすぎ液を、以前にPPPサンプルを加えたのと同じフィルターに移し、遠心フィルターを閉じます。染色したすべてのPPPサンプルとそのすすぎ液の移送が完了したら、固定ローター遠心機でサンプルを遠心分離します。遠心分離後、フィルターの上に液体が残っていないことを確認します。次に、フィルターの上部を 300 µL の PBS で再懸濁し、再懸濁した内容物をあらかじめラベルを貼ったチューブに移して、直ちにフローサイトメトリー分析に供します。遠心フィルターを用いて染色サンプルを洗浄することで、バックグラウンドと陽性マーカー信号との分離が向上します。ただし、エクソソームを含む一部の小さな細胞外小胞は、フィルターの孔を通り抜けて失われる可能性があることに注意してください。サンプルを解析するには、まず、前方散乱光および側方散乱光の電圧パラメータを対数スケールに設定し、各パラメータについてサイトメーターで許容される最低しきい値を選択します。次に、0.22 µmでろ過したPBSのチューブを流しながら、バックグラウンドノイズの大部分を除去できる最大値になるように、これらの電圧を調整します。続いて、1 µm以下のビーズ混合液を含むチューブを流し、前方散乱光対側方散乱光プロットにおいてビーズ集団を囲むゲートを設定し、1 µmビーズ以下のすべてのイベントをキャプチャします。次に、サイトメーターのフローレートを「low」に設定し、ビーズを用いてフローレートダイヤルを調整し、目的のイベントレートに設定します。その後、PBSで希釈したレインボー蛍光粒子が入ったチューブを使用し、5,000イベントを計測して、前方散乱光（forward scatter）、側方散乱光（side scatter）、および各カラーチャンネルの平均輝度値を記録します。すべてのパラメータが設定されたら、各サンプルを正確に1分または2分間計測します。各チューブの1回目の計測が完了した後、10% MP 40を20 µLずつ各サンプルに混ぜ、同時間分だけ再度計測し、溶出したサンプルにおいて同時間内に検出された陽性イベントを差し引けるようにします。ビーズベースのキャプチャーにより細胞外小胞を検出するには、まずコーティングされていない6 µmポリスチレンビーズをRPMI培地で2回洗浄し、続いて同培地2 mLで再懸濁します。次に、新しいファラックスチューブにそれぞれ6,000個のビーズを加え、陰性対照チューブには400 µLの培地を、その他のチューブには200 µLのPPPまたは適宜超遠心分離した細胞外小胞と200 µLの培地を加えます。各チューブの最終容量を400 µLに調整します。さらに培地を加えます。チューブをシェーカーに入れ、4 °Cで一晩インキュベートします。翌朝、ビーズを2 mLの培地で洗浄します。上清を吸引し、400 µLの5%牛血清アルブミンを用いて非特異的結合をブロックした後、シェーカーを用いて4 °Cで3時間静置します。3時間後、ビーズをさらに2 mLの培地で洗浄し、ペレットを100 µLの新鮮な培地に再懸濁します。次に、抗体をろ過し、ろ過した抗体カクテルを適切な量ずつ各チューブに加えます。その後、4 °Cで30分間静置し、ビーズをさらに2 mLの培地で洗浄します。今回、ペレットを400 µLの培地で再懸濁し、直ちにフローサイトメトリーでサンプルを分析します。その際、前方散乱光および側方散乱光のパラメータを、先ほど実演したように、フローサイトメーターで設定可能な最低しきい値に調整してください。最後に、シングレットビーズ集団をゲートし、1サンプルあたり2000イベントを収集します。これらのドットプロットに示されているように、個別の検出法とビーズを用いた検出法の両方で、PPPサンプル中の細胞外小胞の存在を検出できます。個別検出アッセイでは、溶出コントロールを用いて、対応する非リストサンプルのゲートを設定します。ほとんどのイベントが細胞外小胞（extracellular vesicle）ゲート内に収まるはずです。例えば、この図のバイパラメータープロットでは、細胞上に共存することが知られている2つの赤血球マーカー、CD 1 0 8 AおよびCD 2 35 Aの検出が示されています。予想通り、細胞外小胞における陽性イベントの半数以上が両方のマーカーに対して陽性となっています。一方で、これらのバイパラメータープロットにおいて、細胞上で共存しないことが知られている2つのマーカーの細胞外小胞における発現は、ビーズベースの検出法を用いることで、明確に分離した陽性集団として示されています。陽性集団と陰性集団の間に分離は見られず、イベントはダブルポジティブの領域に現れます。これは、2種類の細胞外小胞の両方が単一のビーズに結合するためであり、通常は同じ細胞型に共存しないものであっても同様です。したがって、この手法によるデータは、陰性コントロールのデータを重ね合わせたヒストグラムを用いて解析するのが最適であり、習得すれば、コントロールと比較してビーズを用いたサンプルでマーカー発現の明らかなシフトが観察されます。この技術を適切に実施すれば、個別の検出法では3〜4時間で、ビーズ法では1.5日で、3つの抗体パネルを用いて12検体の血液サンプルを解析することが可能です。この手順を行う際は、各サンプルの取り扱いを統一することが重要です。特に、複数日にわたって多数のサンプルを測定する場合、各実験の開始時にサイトメーターのフローレートと蛍光強度が前日の実験設定と一致するように正しく調整されているかを確認してください。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオは、蛍光標識捕捉抗体-磁性ナノ粒子コンジュゲートを使用した細胞外小胞の免疫捕捉を示しています。このプロセスには、複雑な形成、蛍光標識検出抗体による染色、磁気分離、抗原特性評価のためのフローサイトメトリー分析が含まれます。...

抗体特性評価のための細胞外小胞の免疫捕捉およびフローサイトメトリー(英語)

ウイルスまたは細胞外小胞は、表面抗原を認識する抗体に結合した15nmの磁性ナノ粒子で免疫捕捉されました。捕捉されたビリオンまたは小胞は、他の表面抗原に対する蛍光抗体で標識されました。得られた複合体を高磁場中で分離し、蛍光でトリガーされる従来のフローサイトメーターで分析しました。...

ビリオンの抗原性スペクトルと細胞外ベシクルを分析するためのフローVirometry

このプロトコルでは蛍光を用いたナノ粒子追跡によるひと全血から細胞小胞の迅速な分離と特定のマーカーの特性の完全なワークフローを説明します。結果が発表される高レベルの再現性を示し細胞培養上清に調整することができます。...

ナノ粒子追跡によるひと血中の細胞小胞単一の急速な蛍光特性評価

プロトコルでは、小さな細胞小胞 (EV) の表面の抗原を検出する細胞培養上清を使用のために設計された再現可能な方法について説明します。それは、CD63 と CD81 CD9、表面抗原を認識する抗体が結合したビーズを用いた特定の EV...

フローサイトメトリー法による細胞小胞細胞調節されたメディアからの解析します。

最新世代のEV特性評価ツールは、複数のパラメータにわたる単一のEV解析を同時に行うことができます。ナノフローサイトメトリーは、標識なしで45...

ナノフローサイトメトリーによる単一細胞外小胞膜貫通タンパク質の特性評価

このプロトコルは、エアスプレーノズルのサイズ、シース液の圧力、サンプルフロー圧力、電圧、ゲイン、およびトリガーしきい値パラメータを最適化することにより、小さな細胞外小胞の迅速かつサイズ固有の分離方法を提供します。...

低分子細胞外小胞のハイスループット単離および精製のためのフローサイトメトリーソーティングパラメータの最適化(英語)

ここでは、マイクロRNAパッケージングと細胞外小胞(EV)への輸出のダイナミクスを研究するために、蛍光標識されたマイクロRNAの存在量の in vitro...

フローサイトメトリーを用いた細胞外小胞へのmiRNA放出の追跡

ここでは、ヒト被験者の涙や唾液などの生体液から採取された細胞外小胞(EV)の特性評価法を示します。この方法で使用されるスキャナーは、サンプルの1μLからEVの表現型、サイズ、および総粒子数を検出することができます。...

体液からの細胞外小胞の特性評価

マウス精巣から高度に精製された実行可能な減数分裂分画を得るために効率的な方法は、蛍光活性化細胞選別（FACS）による洗練された細胞解離のプロトコルを組み合わせています、説明されています。このメソッドは、離散的な減数分裂画分のDNA含量の違いと核密度を利用しています。...

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

免疫細胞機能や増殖を監視するための細胞追跡用染料の使用の成功は、いくつかの重要な手順が含まれます。我々は、するための方法を説明します：1）膜染料と明るく、均一で、再現可能なラベルり得るステップと、2）蛍光色素とデータ収集条件を選択すると、3）色素希釈に基づいて、細胞増殖を定量化するためのモデルを選択する。...

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

学ぶ細胞外小胞のフローサイトメトリー分析法。個別検出法とビーズベース法を用いて血漿中EVを分離・測定し、細胞間情報伝達の理解に貢献する高速定量的アプローチを習得する。

フローサイトメトリーを用いて細胞外小胞の分析のための技術

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