リンパ球のサブタイプを特徴付けるための三次元定量的位相イメージング

リンパ球サブタイプ懸濁液をイメージングチャンバーにロードします。

チャンバーを3D定量位相イメージング顕微鏡ステージに配置します。

顕微鏡パラメータと焦点面を調整して、最適なイメージングを実現します。

リンパ球イメージング中、レーザービームは基準ビームとサンプルビームに分割されます。

デジタルマイクロミラーデバイスは、サンプルビームの経路にマイクロミラーアレイを備えており、ビームが光軸を中心に360度回転することができます。

リンパ球を通過する各ビームは、細胞内の屈折率の変化に基づいて位相シフトを受けます。

結果として得られたサンプルビームと基準ビームが再結合し、2D ホログラムを形成します。

さまざまな角度からの位相と振幅の情報を含む一連のホログラムは、リンパ球の周りのビーム回転によってキャプチャされます。

リンパ球を除く、さまざまな照明角度の複数の背景ホログラムを取得します。

回折断層撮影アルゴリズムを使用して、ホログラムを3D屈折率断層撮影に再構築し、標識を必要とせずにリンパ球の形態学的および生化学的情報を提供します。

最適なイメージングを行うには、各細胞サンプルをRPMI培地1マイクロリットルあたり180細胞の濃度に希釈し、最初に希釈したサンプル120マイクロリットルをイメージングチャンバーにゆっくりと注入します。チャンバー内に気泡がないことを確認したら、3D定量相顕微鏡の対物レンズに蒸留水を一滴垂らし、顕微鏡の並進ステージにイメージングチャンバーを置きます。サンプルが対物レンズに揃うようにステージを調整し、イメージングソフトウェアの顕微鏡パースペクティブのキャリブレーションタブでフォーカスとサーフェスをクリックして、対物レンズとコンデンサーレンズの軸位置をそれぞれ調整します。

[自動モード]をクリックして、対物レンズとコンデンサーレンズを位置合わせします。位置合わせを最適化するには、スキャンモードを開き、レンズを手動で調整して、デジタルマイクロミラーデバイスのパターンを中心に合わせます。次に、通常モードに戻り、移動ステージを調整して、視野内のセルを見つけます。対物レンズの軸位置を調整して、画面に表示されたサンプル境界がほとんど見えなくなるまで焦点面を見つけます。

最適な3D RI断層撮影を生成するには、細胞の焦点を完全に調整することが重要です。画像が適切に撮影されていないと、3D 再構成が損なわれ、ノイズの多い断層撮影が発生します。

移動ステージを調整してセルのない場所を見つけ、[キャリブレーション] をクリックして、さまざまな照明角度で複数の 2D ホログラムを測定します。変換ステージを調整して視野の中央にセルを見つけ、[取得]タブで、イメージングするサンプルに名前を付けます。

3D スナップショット] をクリックして、先ほど測定した 2D ホログラムと同じ照明角度を使用してセルのホログラムを測定します。取得したデータがデータ管理パネルに表示されたら、データを右クリックし、[処理]をクリックすると、イメージングソフトウェアに実装された回折断層撮影アルゴリズムを使用して、2Dホログラムから3D屈折率断層撮影を再構築します。イメージング後、[データ管理] パネルで [データ] を右クリックし、[開く] をクリックしてデータを視覚化します。

セルの中央をクリックして位置を変更し、[データ マネージャ] パネルの [RI トモグラム] をクリックします。[プリセット]タブで、[ロード]をクリックし、3D RI分布に従ってトモグラムを視覚化するためにイメージングソフトウェアによって提供される事前定義された伝達関数であるlymphocytes.xmlをダブルクリックします。マウスをスクロールして拡大し、セルをドラッグして任意の方向に回転します。