人間の免疫細胞の三次元可視化のための光シート顕微鏡

この方法は、免疫細胞が生理学的に関連性のある状況でどのように正確に振る舞うか、例えば3次元環境で標的細胞を効率的に検索する方法など、免疫学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、非常に薄い光のシートを生成して、オフプレーンセルに影響を与えずに焦点面のみを照らすことです。これにより、非常に高速な取得速度が可能になり、漂白と光細胞毒性が著しく減少します。

この手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるRenping Zhao博士です。まず、細胞培養フードの下で、400マイクロリットルの冷却コラーゲンストック溶液を滅菌済みの1.5ミリリットルチューブに移します。冷やした50マイクロリットルの10X PBSをゆっくりと加えます。

次に、チューブを静かに傾けて溶液を混合します。コラーゲン溶液に0.1モルの水酸化ナトリウムを48マイクロリットル加えて、pHを7.2〜7.6に調整します。pHテストストリップを使用して、混合物のpH値を決定します。

2マイクロリットルの滅菌蒸留脱イオン水を追加して、最終容量を500マイクロリットルにします。よく混ぜて、コラーゲン溶液を氷上または摂氏4度で保存します。テキストプロトコルに従って生細胞を蛍光標識した後、細胞培養フードの下で、6番目の細胞に10回1回を滅菌1.5ミリリットルチューブに移します。

チューブを200倍gで8分間遠心分離します。次に、上清を捨て、200マイクロリットルの培地を使用してペレットを再懸濁します。中和したコラーゲン溶液85.9マイクロリットルを細胞懸濁液に加え、適切に混合してコラーゲン濃度2.5ミリグラム/ミリリットルに達する。

細胞コラーゲンミックスをフードの氷の上に置いておきます。次に、プランジャーがキャピラリーから1mm突き出るまで、一致するキャピラリーにプランジャーを挿入します。次に、培地に浸してプランジャーを濡らします。

このステップをスキップすると、プランジャーとコラーゲンマトリックスの間に気泡が望ましくない形で混入する可能性があります。毛細血管を細胞コラーゲン混合物に浸し、プランジャーをゆっくりと10〜20ミリメートル引き戻します。次に、70%エタノールのスプレーボトルでペーパータオルを湿らせ、それを使用して毛細血管の外壁を拭き取り、残りのコラーゲン溶液を取り除きます。

次に、モデリング粘土を使用して、キャピラリーを5ミリリットルのチューブの内壁に取り付けます。細胞コラーゲンミックスを毛細血管の端に押し込みます。次に、チューブをキャピラリーと37°C、5%CO2で1時間インキュベートし、コラーゲンを重合させます。

インキュベーション後、1〜2ミリリットルの培地をチューブに加えます。次に、重合したコラーゲンロッドを慎重に培地に排出し、コラーゲンの約半分が培地にぶら下がるまでします。キャピラリーをさらに30分間インキュベートします。

ライトシート顕微鏡検査を行うには、製造元の指示に従ってサンプルチャンバーを組み立てます。ライブイメージングを行う場合は、顕微鏡とインキュベーターの電源を入れた後、キャピラリーをサンプルチャンバーに配置し、サンプルの位置を特定し、画像取得の対象領域を見つけます。対応するレーザーをアクティブにします。

次に、レーザー出力と露光時間を設定します。また、Zスタックのステップサイズ、Zスタックの開始位置と終了位置、および生細胞イメージングの時間間隔も設定します。その後、画像取得を開始します。

PBS中の4%パラホルムアルデヒド1ミリリットルを化学フードの下の5ミリリットルのチューブに移します。次に、重合したコラーゲンを含むキャピラリーをパラホルムアルデヒド溶液に浸し、モデリングクレイを使用してキャピラリーをチューブの内壁に取り付けます。コラーゲンロッドの半分がパラホルムアルデヒド溶液にぶら下がるまで、プランジャーを静かに押します。

次に、プランジャーを引き戻して、コラーゲンロッドを毛細血管に戻します。チューブからキャピラリーを取り外し、パラホルムアルデヒドを廃棄します。キャピラリーを新しいチューブに取り付け、1ミリリットルのPBSを追加します。

キャピラリーがPBSに浸されていることを確認してください。コラーゲンロッドの半分が溶液にぶら下がるまでプランジャーを静かに押し、5分間インキュベートします。プランジャーを引き戻して、毛細血管内のコラーゲンロッドを巻き取ります。

次に、PBSを新しいPBSに交換し、コラーゲンロッドを溶液に排出します。3回目の洗浄後、1〜2ミリリットルのブロッキング透過化バッファーをチューブに加えます。コラーゲンロッドを溶液に排出し、チューブを室温で30〜60分間インキュベー

ブロッキング透過化バッファーをブロッキング透過化バッファー中の200〜500マイクロリットルの一次抗体に交換し、溶液に沈めたコラーゲンロッドを1時間インキュベートします。PBSTを使用してコラーゲンロッドを3回洗浄した後、ロッドを二次抗体でインキュベートし、室温でブロッキング透過化バッファーに1時間インキュベートします。PBSでさらに3回洗浄した後、コラーゲンロッドをキャピラリーに戻し、イメージングまでサンプルをPBSに保持します。

この動画に見られるように、EGFPアクチン融合タンパク質をトランスフェクトしたCTL細胞は、移動中にレモン状の大きな突起を形成し、細かい紡錘体状の構造で縁取られています。ここでは、CTLの軌跡を速度と持続性、または変位を軌跡の全長で割った値を測定パラメータとして示しています。速度は毎秒0.01〜0.19ミクロンの範囲で、ほぼ20倍の差があり、持続性は0〜0.7の範囲です。

この図は、内因性perforin-1およびactinについて染色された3Dコラーゲンゲル中の固定CTL細胞を示しています。サンプルは、片面または両側から照射されました。異なるZ位置から、細胞は均一に染色され、コラーゲンゲルへの抗体の浸透が良好であることを示しています。

固定CTLは、生細胞と同じ形態を示し、このプロトコルで形態が良好に維持されていることを示しました。この手順を試みるときは、気泡を避け、pH値を適切に調整することを覚えておくことが非常に重要です。この手順に続いて、特定の表面分子による生細胞染色などの他の方法を実行して、細胞の挙動を分化や異なる細胞サブタイプと相関させる方法や、細胞間相互作用や細胞運命を調査する方法などの追加の質問に答えることができます。

その開発後、この技術は、細胞生物学、免疫学、および癌研究の分野の研究者が、in vitroで最も生理学的に関連性の高いシステムにおける細胞の挙動、細胞運命、分化、および細胞相互作用を探求する道を開きました。このビデオを見れば、3次元コラーゲンマトリックスに細胞を埋め込んだサンプルを調製する方法、ライトシート顕微鏡を使用してライブまたは固定でサンプルを視覚化する方法、3Dで細胞移動を追跡する方法について十分に理解できるはずです。