昆虫の蛹における炎症性細胞動態の探索のための光変換技術

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色の蛍光を示す標識された損傷上皮を運ぶトランスジェニックショウジョウバエの蛹を含むガラス底の皿から始めます。

蛹の免疫細胞、つまり血球は、細胞質で光変換可能な緑色蛍光色素を発現し、核内で赤色蛍光タンパク質を発現し、細胞の追跡を促進します。

損傷した細胞は化学誘引物質、つまり炎症分子を放出し、血球を損傷部位に引き寄せます。

共焦点顕微鏡検査により、緑色の上皮細胞に囲まれた傷ついた領域が明らかになります。

治癒中、創傷の近くに赤い核を持つ緑色の血球は、膜の突起(糸状偽足と層状偽足)を伸ばし、損傷部位に向かって移動します。

時間が経つにつれて、化学誘引物質が拡散すると、遠くの血球が傷口に向かって移動し、免疫細胞波が生成されます。

405ナノメートルの波長で遊走性血球の亜集団を照らします。これにより、血球の光変換可能な蛍光色素が緑色から赤色に不可逆的に変換されます。

これらの光変換血球は、創傷上皮を修復して創傷部位から離れることで、光変換血球と非光変換血球を区別し、炎症細胞の動態を解明します。

瞳孔翼の縁を傷つけた後、ガラス底の皿を適切な顕微鏡にすばやく移してタイムラプスイメージングを行います。次に、適切な画像キャプチャ ソフトウェアを開きます。

ソフトウェアで、適切なレーザーをオンにし、パワーとゲインオフセットを調整して、ピクセル飽和なしに十分な蛍光信号を取得します。一般に、光退色を最小限に抑えるには、5%から20%の範囲で可能な限り低いレーザー出力が最適です。

低倍率で瞳孔翼全体に焦点を当てるか、高倍率で創傷に焦点を当てて創傷修復を調査します。修復上皮と炎症細胞の動員の両方をキャプチャするには、まず、コントロールパネルの微焦点調整を使用してzスタックを記録するように顕微鏡を設定します。損傷した上皮から、移動する血球を含むその下の細胞外空間までスキャンします。

次に、瞳孔翼を通るzスライスを3ミクロンごと、またはさらに狭い間隔で記録するようにソフトウェアを設定します。タイムラプスイメージングの場合は、少なくとも30秒ごとに少なくとも1時間、Zスタックを記録します。

フォトコンバーチブルプローブを使用して、イメージング中に細胞のサブセットを選択的にフォトコンバートしてラベル付けする場合は、イメージングソフトウェア内の適切なモジュールを開いてフォトコンバージョンを実行し、405ナノメートルレーザーをアクティブにします。次に、選択ツールを使用して、FRAP ソフトウェア内で写真変換するセルを選択します。

次に、写真変換の時間経過を 1 回の反復フレームに設定し、405 ナノメートルのレーザーを 20% のレーザー出力に設定してから、[実験の開始] をクリックして写真変換を実行します。完了したら、FRAPモジュールを終了し、元のイメージング画面に戻ります。そこで、使用中の蛍光色素にレーザーを調整し、タイムラプス記録を使用して光変換細胞と非光変換細胞を画像化します。

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Last updated: 4 July 2026