免疫細胞の表現型および機能的特性評価のためのバーコードアッセイ

刺激免疫細胞と固定免疫細胞を含む試験サンプルから始めます。

刺激は細胞内の特定のマーカーの発現を誘導しますが、固定は細胞表面抗原を含む表現型マーカーとサイトカインを含む機能状態マーカーを保存します。

重金属同位体結合抗体の独自の組み合わせを各サンプルに追加します。

この技術は、複数のサンプルを一意にバーコード化し、重金属同位体の組み合わせによって各サンプルを区別します。

抗体は共通のエピトープに結合し、サンプル内のすべての細胞をバーコード化します。

すべての

バーコード付きサンプルを1本のチューブにまとめて、下流処理を行います。

金属結合抗体カクテルを加えて、表面抗原を染色します。

透過処理バッファーを添加して、細胞内染色の細胞膜透過性を高めます。

細胞内サイトカインを染色するために、金属結合抗体の別のセットを追加します。

バーコードにより、マスサイトメトリーによるプールされたサンプルの染色と取得を同時に行うことができます。この技術により、アッセイ効率が最大化され、表現型および機能状態マーカーの評価が向上します。

溶解した固定細胞をバーコード化するには、摂氏マイナス80度の保管庫からサンプルを氷上でゆっくりと解凍します。10倍バーコードパームバッファーをPBSで1〜10に希釈し、サンプルあたり3ミリリットル分のバッファーを作ります。

1つの非滅菌トラフにCSMを充填し、もう1つに1xバーコードパーマバッファーを充填します。次に、解凍したばかりのサンプルに1ミリリットルの氷冷CSMを加えます。完全に混合し、それぞれの標識済みポリプロピレンクラスターチューブに移します。

次に、10マイクロリットルのサンプルを採取し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。余分な細胞の体積を除去することにより、各クラスターチューブの細胞数を正規化します。次に、細胞を室温で600回gで5分間遠心分離します。マルチチャンネルピペットで細胞を1ミリリットルの1xバーコードパームバッファーに再懸濁し、室温で600倍gで5分間遠心分離します。その後、上清を吸引します。

クラスターチューブをバーコードキーに示されているのと同じ順序でラックに並べ、サンプルがバーコードと一致するようにします。細胞ペレットに触れることなく、マルチチャンネルピペットでクラスターチューブ内のすべてのサンプルに800マイクロリットルの1xバーコードパーマバッファーを添加し、細胞損失を減らします。

次に、クラスターチューブのあるラックを脇に置きます。20プレックスパラジウムバーコードキットチューブストリップを摂氏マイナス20度から取り出し、室温で解凍します。100マイクロリットルの1xバーコードパーマバッファーを加え、完全に混合し、120マイクロリットルの再懸濁バーコードミックスをクラスターチューブ内の対応する細