質量サイトメトリー分析のための試料調製

このサンプル調製プロセスの全体的な目標は、不均一な細胞集団の調査を可能にするために、多様なサンプルの堅牢で一貫性のある抗体染色を行うことです。この方法は、複雑な不均一な細胞集団における細胞の同一性、細胞シグナル伝達、および細胞応答に関する疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、単一細胞レベルでの高パラメータタンパク質レベルの測定を可能にすることです。

この手順を実演するのは、私たちの研究室の大学院生であるAundrietta Duncanです。各シングルセル懸濁液サンプルについて、無血清培地で1ミリリットルあたり10〜6セル目の4回で再懸濁し、新たに調製した50マイクロモルシスプラチン/2/10を500マイクロリットルを6つの細胞に加え、室温で一定に混合しながらオービタルシェーカーでサンプルをインキュベートします。1分後、等量の洗浄バッファーでシスプラチンをクエンチし、細胞を遠心分離します。

上清を捨て、500マイクロリットルの洗浄バッファーを加え、細胞を遠心分離し、洗浄バッファーを注ぎ出して、サンプルをさらに2回洗浄します。これに続いて、500マイクロリットルのPBSで2回洗浄し、同様にサンプルを遠心分離し、上清を廃棄します。2回目のPBS洗浄後、ペレットを500マイクロリットルの新鮮なPBSに再懸濁し、500マイクロリットルの4%PFAで細胞を固定します。

細胞をピペットで撹拌します。次に、サンプルをオービタルシェーカーに置き、室温で15分間一定に混合します。インキュベーションの終わりに、遠心分離によって細胞をペレット化し、上清を注ぎ、これに続いて新鮮なPBSで洗浄します。

細胞を透過処理するには、細胞を再度スピンダウンし、上清を廃棄します。穏やかなボルテックスにより、サンプルを残留PBSに再懸濁し、直ちに2/10 10あたり100%メタノールの1ミリリットルを穏やかなピペッティングで6番目のセルに加えます。サンプルを4度で少なくとも1時間インキュベートし、インキュベーションの終了時に細胞を遠心分離します。

その後、メタノールを注ぎます。次に、メタノール1ミリリットルにつき1ミリリットルの洗浄緩衝液でペレットを洗浄し、続いて500マイクロリットルの新鮮な洗浄緩衝液でさらに2回洗浄します。50マイクロリットルに設定された200マイクロリットルのピペットを使用して、各ペレットの残りの洗浄バッファーを適切な対応する抗体カクテルのチューブに移します。

プランジャーを部分的に押し下げたままにすることで、チップに空気を引き込まずに結合溶液をピペットでバックアップします。次に、プランジャーを解放せずに、ピペットチップを500マイクロリットルの洗浄バッファーを含む1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。プランジャーを放し、抗体カクテルの総量が50マイクロリットルになるように洗浄バッファーを吸い上げ、穏やかなピペッティングで適切な対応するサンプルを吸引抗体カクテルで標識します。

室温で1時間後、絶えず振とうしながらサンプルを4回洗浄し、毎回洗浄バッファーを注ぎます。細胞をイリジウムで標識するには、最終ペレットを500マイクロリットルのPBSに再懸濁し、続いて500マイクロリットルの4パーセントPFAを室温で15分間添加します。次に、新たに調製した62.5ナノモルのイリジウムとPFAを500マイクロリットルのサンプルに加え、さらに15分間室温で振とうします。

次に、細胞を遠心分離し、上清を注ぎ、続いて 0.1% BSA とろ過脱イオン水を含む 500 マイクロリットルで 2 回洗浄します。サンプルプレートのウェルにノーマライゼーションビーズを添加し、細胞をこれらのウェルにピペットで移し、24時間以内にマスサイトメトリーを行うことで、サンプルを分析します。信号強度の正規化に続いて、イリジウム191陽性ビーズのネガティブ集団をゲートオンすることにより、キャリブレーションビーズをデータから削除できます。

その後、イベント長に対するイリジウム193陰性発現の二軸プロットを使用して、シングルセルイベントをゲート化して破片と細胞多重項を除去できます。シスプラチン標識は、細胞の深さの量を測定するために使用できます。たとえば、ここでは、死細胞の量が少ないサンプルと多いサンプルが示されています。

死んだ細胞は、プラチナ198陽性集団をゲートで取り除くことで除去でき、バーコード化により、バーコードパラメータ内のサンプルが明確に分離され、細胞を元のサンプルIDに割り当てることができます。IDUラベリングは、ここで観察された米国の顔細胞を検出するために使用できます。最初の正規化、バーコード解除、ゲーティングに続いて、SPADEアルゴリズムを使用して高次元データを分析して、視覚的な解釈に適したデータの低次元表現を生成できます。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば4〜6時間以内に完了できます。この手順を試行する際は、洗浄ステップを行う際のサンプル損失を最小限に抑えることを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、マスサイトメトリー解析用のサンプル調製方法について十分に理解できるはずです。

アジ化ナトリウムでの作業は危険な場合があるため、この手順を実行するときは適切なPPEを着用するなどの予防策を講じる必要があることを忘れないでください。