質量サイトメトリー分析のための試料調製
2017年4月29日
この記事は、マスサイトメトリー分析のためのサンプルの収集と処理について説明しています。
このサンプル調製プロセスの全体的な目標は、不均一な細胞集団の調査を可能にするために、多様なサンプルの堅牢で一貫性のある抗体染色を行うことです。この方法は、複雑な不均一な細胞集団における細胞の同一性、細胞シグナル伝達、および細胞応答に関する疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、単一細胞レベルでの高パラメータタンパク質レベルの測定を可能にすることです。
この手順を実演するのは、私たちの研究室の大学院生であるAundrietta Duncanです。各シングルセル懸濁液サンプルについて、無血清培地で1ミリリットルあたり10〜6セル目の4回で再懸濁し、新たに調製した50マイクロモルシスプラチン/2/10を500マイクロリットルを6つの細胞に加え、室温で一定に混合しながらオービタルシェーカーでサンプルをインキュベートします。1分後、等量の洗浄バッファーでシスプラチンをクエンチし、細胞を遠心分離します。
上清を捨て、500マイクロリットルの洗浄バッファーを加え、細胞を遠心分離し、洗浄バッファーを注ぎ出して、サンプルをさらに2回洗浄します。これに続いて、500マイクロリットルのPBSで2回洗浄し、同様にサンプルを遠心分離し、上清を廃棄します。2回目のPBS洗浄後、ペレットを500マイクロリットルの新鮮なPBSに再懸濁し、500マイクロリットルの4%PFAで細胞を固定します。
細胞をピペットで撹拌します。次に、サンプルをオービタルシェーカーに置き、室温で15分間一定に混合します。インキュベーションの終わりに、遠心分離によって細胞をペレット化し、上清を注ぎ、これに続いて新鮮なPBSで洗浄します。
細胞を透過処理するには、細胞を再度スピンダウンし、上清を廃棄します。穏やかなボルテックスにより、サンプルを残留PBSに再懸濁し、直ちに2/10 10あたり100%メタノールの1ミリリットルを穏やかなピペッティングで6番目のセルに加えます。サンプルを4度で少なくとも1時間インキュベートし、インキュベーションの終了時に細胞を遠心分離します。
その後、メタノールを注ぎます。次に、メタノール1ミリリットルにつき1ミリリットルの洗浄緩衝液でペレットを洗浄し、続いて500マイクロリットルの新鮮な洗浄緩衝液でさらに2回洗浄します。50マイクロリットルに設定された200マイクロリットルのピペットを使用して、各ペレットの残りの洗浄バッファーを適切な対応する抗体カクテルのチューブに移します。
プランジャーを部分的に押し下げたままにすることで、チップに空気を引き込まずに結合溶液をピペットでバックアップします。次に、プランジャーを解放せずに、ピペットチップを500マイクロリットルの洗浄バッファーを含む1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。プランジャーを放し、抗体カクテルの総量が50マイクロリットルになるように洗浄バッファーを吸い上げ、穏やかなピペッティングで適切な対応するサンプルを吸引抗体カクテルで標識します。
室温で1時間後、絶えず振とうしながらサンプルを4回洗浄し、毎回洗浄バッファーを注ぎます。細胞をイリジウムで標識するには、最終ペレットを500マイクロリットルのPBSに再懸濁し、続いて500マイクロリットルの4パーセントPFAを室温で15分間添加します。次に、新たに調製した62.5ナノモルのイリジウムとPFAを500マイクロリットルのサンプルに加え、さらに15分間室温で振とうします。
次に、細胞を遠心分離し、上清を注ぎ、続いて 0.1% BSA とろ過脱イオン水を含む 500 マイクロリットルで 2 回洗浄します。サンプルプレートのウェルにノーマライゼーションビーズを添加し、細胞をこれらのウェルにピペットで移し、24時間以内にマスサイトメトリーを行うことで、サンプルを分析します。信号強度の正規化に続いて、イリジウム191陽性ビーズのネガティブ集団をゲートオンすることにより、キャリブレーションビーズをデータから削除できます。
その後、イベント長に対するイリジウム193陰性発現の二軸プロットを使用して、シングルセルイベントをゲート化して破片と細胞多重項を除去できます。シスプラチン標識は、細胞の深さの量を測定するために使用できます。たとえば、ここでは、死細胞の量が少ないサンプルと多いサンプルが示されています。
死んだ細胞は、プラチナ198陽性集団をゲートで取り除くことで除去でき、バーコード化により、バーコードパラメータ内のサンプルが明確に分離され、細胞を元のサンプルIDに割り当てることができます。IDUラベリングは、ここで観察された米国の顔細胞を検出するために使用できます。最初の正規化、バーコード解除、ゲーティングに続いて、SPADEアルゴリズムを使用して高次元データを分析して、視覚的な解釈に適したデータの低次元表現を生成できます。
このテクニックを習得すると、適切に実行すれば4〜6時間以内に完了できます。この手順を試行する際は、洗浄ステップを行う際のサンプル損失を最小限に抑えることを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、マスサイトメトリー解析用のサンプル調製方法について十分に理解できるはずです。
アジ化ナトリウムでの作業は危険な場合があるため、この手順を実行するときは適切なPPEを着用するなどの予防策を講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
この記事は、マスサイトメトリー分析のためのサンプルの収集と処理について説明しています。この方法は一貫した抗体染色を生み出し、異質な細胞集団を調査することを目的としています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- マスサイトメトリー
背景
- マスサイトメトリーは、単一細胞レベルで高パラメータのタンパク質レベルを測定することを可能にします。
- 細胞のアイデンティティとシグナリングを理解するのに役立ちます。
- この技術は複雑な異質な細胞集団に適用可能です。
- サンプルの準備は堅牢な結果を得るために重要です。
研究の目的
- マスサイトメトリーのサンプル準備プロセスを示す。
- 多様な細胞集団の調査を可能にする。
- 細胞の反応と相互作用についての洞察を提供する。
使用した方法
- 血清フリー培地で単一細胞懸濁液サンプルを再懸濁。
- 細胞処理のために新たに調製したシスプラチンの使用。
- 一貫した混合のために軌道シェーカーでのインキュベーション。
- 処理後の細胞の遠心分離と洗浄。
主要な結果
- 効果的なサンプル準備技術のデモンストレーション。
- サンプル間で一貫した抗体染色の達成。
- 単一細胞レベルでの高パラメータ分析の促進。
- 異質な細胞集団に関する洞察の取得。
結論
- この方法は複雑な細胞集団を分析する能力を高めます。
- 堅牢なサンプル準備は、正確なマスサイトメトリー結果にとって重要です。
- この技術は細胞生物学と神経科学の研究を前進させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Mass cytometry enables high-parameter single-cell protein analysis, supporting deep interrogation of heterogeneous cell populations in drug discovery. Reliable sample preparation is essential for generating consistent, reproducible data that informs target validation and mechanistic de-risking. This protocol helps biopharma R&D teams reduce variability and improve predictive confidence in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables multiplexed protein profiling to clarify cellular identity and signaling states in complex tissues.
- Operational Value: Supports hypothesis-driven interrogation of drug target engagement and pathway modulation at single-cell resolution.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, high-dimensional readouts for assessing compound effects across diverse cell types.
- Operational Value: Establishes reproducible staining and fixation procedures critical for assay scalability and cross-experiment comparability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates biomarker discovery and phenotypic characterization in disease-relevant models.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of cellular responses to support go/no-go decisions in preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing quantitative, single-cell resolution data that complements bulk assays and functional screens.
- Discovery Biology: Enables detailed mapping of cellular heterogeneity and dynamic protein expression changes in response to perturbations.
- Screening: Delivers multiplexed, quantitative outputs suitable for hit validation and mechanism-of-action deconvolution.
- Analytics: Produces high-dimensional data requiring computational gating and normalization for accurate interpretation.
- Translational Research: Supports alignment with preclinical models by enabling consistent immunophenotyping across sample sets.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized sample preparation foundation for reusable mass cytometry platforms across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence through comprehensive, single-cell resolution protein profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and minimizes technical variability via standardized washing, fixation, and permeabilization steps.
- Strategic Value: Improves target selection and lead optimization by reducing biological ambiguity in complex samples.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization by revealing off-target effects and cell-state-specific responses early in discovery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry principles, antibody panel design, and metal-conjugated reagent handling.
- Depends on access to a mass cytometer, centrifugation equipment, and orbital shakers for consistent sample processing.
- Necessitates standardized operating procedures for reagent preparation, particularly Cisplatin and methanol-based permeabilization, to ensure batch-to-batch consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to diverse sample types such as primary tissues, blood, or cultured cells.
- Includes practical limitations related to sample loss during multiple wash steps and the need for careful titration of antibody cocktails to minimize background signal.
